一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型构建方法

摘要

本发明首次采用刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼单侧皮肤的方式来进行免疫，采用最优化的感染浓度和感染时长，首次构建了刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型，彻底消除了鱼类局部皮肤黏膜免疫应答过程中“先天性差异”所带来的负面影响，为研究局部黏膜免疫应答规律提供了理想的免疫模型。本发明免疫模型的构建方法主要包括5个歩骤：(1)刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算；(2)斜带石斑鱼的分组和驯养；(3)局部皮肤免疫；(4)感染强度的测定；(5)局部感染后鱼体的处理。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类免疫领域，具体为鱼类黏膜免疫方向，具体涉及一种诱导斜带石斑鱼皮肤组织局部黏膜免疫的免疫模型的构建方法。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种原生纤毛虫，可感染几乎所有海水硬骨鱼类引起严重的致死性疾病——刺激隐核虫病或称白点病(Colorni A and BurgessP.，1997)。刺激隐核虫的生活史包括滋养体、包囊前体、包囊和幼虫等4个阶段，其中只有滋养体营专性寄生生活，以宿主体液、组织碎片以及完整细胞等为食。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成了非常严重的危害。2008年，农业部将刺激隐核虫病列入我国“二类动物疫病”名录，是我国“一、二类动物疫病”名录中唯一一种水产寄生虫病，可见其危害的严重性。

不同于病毒、细菌等其他微生物病原的全身感染，刺激隐核虫主要寄生于宿主的皮肤、鳍条和鳃上，其独特的寄生性质使其成为研究海水鱼类局部皮肤和鳃黏膜免疫应答的良好模型；此外，虽然刺激隐核虫不能在体外培养，但我们建立了以卵形鲳鲹为宿主的刺激隐核虫活体传代方法和低温保种方法，使我们可以随时获得大量的虫体进行人工定量感染实验，这是绝大多数水产寄生虫所做不到的(Dan et al.，2006；Dan et al.，2009)。

目前，关于刺激隐核虫感染诱导的宿主局部黏膜免疫应答的研究，主要是通过刺激隐核虫全身体表感染宿主鱼模型进行的(Yambot et al.，2006；Luo et al.，2007；但学明等，2008；Misumi，et al.，2011，2012)。此种方法感染后，鱼的皮肤、鳃和鳍条全部同时被感染，再通过比对感染组与非感染组不同个体鱼之间黏膜免疫应答的差异，揭示宿主抗刺激隐核虫感染的局部黏膜应答规律。然而，由于鱼类不同个体之间存在遗传差异，比较不同个体之间免疫应答的差异存在“先天性缺陷”。近期，有研究人员将石斑鱼泄殖孔以下部分浸入到刺激隐核虫的虫液中，进行局部尾部感染，再采集感染部位的皮肤和同一条鱼未感染的皮肤，进行转录组测序，比较同一尾鱼身上感染部位与非感染部位皮肤黏膜免疫应答的差异(Hu et al.，2017)。该方法排除了不同个体遗传背景的差异，相较于比较不同个体之间的差异已有很大改进。但该方法不能排除同一尾鱼尾部和尾部以外皮肤正常情况下免疫应答的差异。基于此，本发明进一步优化条件，建立刺激隐核虫感染鱼体单侧皮肤的免疫模型，可供比较同一尾鱼左右对称部位感染皮肤与未感染皮肤局部免疫应答的差异，使结果更加客观精准。

发明内容

本发明旨在克服海水鱼在刺激隐核虫免疫后个体差异所产生的影响，通过在同一尾鱼的单侧皮肤实施局部黏膜免疫，为研究局部黏膜免疫应答提供稳定、可靠的实验材料。

本发明采用独特的感染方式，培育出仅有单侧皮肤局部组织完成免疫的海水鱼。

本发明的独特之处在于，首次采用局部感染单侧皮肤的方式来进行免疫，采用最优化的感染浓度和感染时长，首次构建了刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型，彻底消除了鱼类局部皮肤黏膜免疫应答过程中“先天性差异”所带来的负面影响，为研究局部黏膜免疫应答规律提供了理想的免疫模型。此外，还可以对同一皮肤局部组织进行多次的免疫以生产出局部多次免疫鱼体，方便后续免疫记忆的研究。

本发明的优势在于，解决了在研究鱼类黏膜免疫过程中，鱼类个体差异或者组织差异产生的影响，并为研究鱼类局部黏膜免疫应答提供理想的实验材料和免疫模型。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型构建方法，包括以下步骤：

1、刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算

利用专门的刺激隐核虫传代系统对刺激隐核虫进行传代和收集，其传代宿主为卵形鲳鲹。采集发育良好的刺激隐核虫包囊，置于消过毒的干净烧杯中孵化，孵化用水为高压灭菌的、加入适量青霉素和链霉素的自然海水；收集孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫虫液，充分混匀后取50μL，加10μL甲醛将幼虫杀死，在显微镜下计数，计算出幼虫虫液的虫体浓度。

2、斜带石斑鱼的分组和驯养

实验用鱼为20g左右的斜带石斑鱼，该大小便于操作，且刺激隐核虫感染后可引起强烈的免疫反应。将实验鱼随机分为13组，包括实验组12个、对照组1个，每组15尾鱼。鱼体驯养2周，直至其进食、活动正常。整个养殖过程中，海水经600目的滤网过滤，盐度30‰左右，pH8左右，溶氧量在5.6mg/L以上。

3、局部皮肤免疫

实验组用刚孵出2小时内不同浓度的刺激隐核虫幼虫进行局部感染。实验组设6个幼虫感染浓度：1000、5000、10000、15000、20000、30000个/ml，因为30000个幼虫/ml的感染浓度时已有部分鱼开始出现死亡，所以最高感染浓度设为此浓度；实验组设置30s和60s两个感染时间，为了尽量减少鱼体离开水体造成的环境胁迫，同时保证虫体能感染上宿主。

具体感染过程如下：取一个长15cm、宽5cm、高5cm的塑料容器，在长边的中点处套入一根橡皮筋，向塑料容器内倒入100ml不同浓度的新鲜刺激隐核虫虫液；将实验组鱼置入含1ppm丁香酚的海水中进行麻醉，完全麻醉后取出并用含2ppm聚维酮碘海水冲洗鱼体皮肤。设置计时器为30s或60s，将鱼体左侧朝下平放于盛有虫液的塑料容器中，轻按鱼体并使鱼的左侧皮肤接触虫液且头部及尾鳍暴露于虫液之外，并用橡皮筋将鱼体固定。按下计时器并保持鱼的左侧皮肤接触虫液；直至计时器响起后，用无虫水沿未感染测皮肤冲洗鱼体10s，去除未感染上的幼虫，再将鱼体转移至新鲜海水中正常养殖。

对照组用0个幼虫/ml的海水进行感染，感染时间为60s，操作同上。

4、感染强度的测定

在免疫后的48小时，各组取5尾鱼进行麻醉，并置于解剖镜下计数左右两边皮肤的滋养体数量，结果以均值表示。

结果发现：未接触虫液的右边皮肤及对照组的左右边皮肤均未发现有滋养体，而接触虫液的左边皮肤在不同感染时间和浓度条件下均有不同程度的刺激隐核虫感染。用较高浓度(30000幼虫/ml)的刺激隐核虫感染后鱼体会出现不同程度的死亡，且相同浓度的刺激隐核虫局部感染皮肤30s后虫体的感染强度显著低于感染60s。因此，为保证较高的刺激隐核虫感染强度同时对鱼体的存活不造成影响，对于20g左右的鱼体，本发明推荐使用20000个/ml的虫液感染60s。

5、局部感染后鱼体的处理

刺激隐核虫感染鱼体3天后就会从鱼体脱落，发育成熟的包囊会孵化出新的幼虫再次感染鱼体。为避免斜带石斑鱼被首次感染后脱落的刺激隐核虫包囊孵出的幼虫再次感染，影响局部感染实验的结果，于刺激隐核虫感染后每2天将鱼体转移到干净的养殖缸内，轮换养殖3次后，置于养殖缸中正常养殖，取获感染浓度和感染时间为20000个/ml、60s的实验组斜带石斑鱼，即获得刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型。移除鱼体后的养殖缸，加入30cm深的淡水，浸泡8小时，即可杀灭所有粘附于缸底的刺激隐核虫包囊，刷洗后排净淡水，加注干净海水待下一次使用。

本发明的优点和效果：采用独特的皮肤局部免疫方式，采用最优化的感染浓度和感染时间，使鱼体仅在左侧皮肤有刺激隐核虫滋养体的感染，而右侧皮肤则无寄生虫。此方法获得的免疫模型可大大减少鱼类个体差异或组织差异带来的影响，为研究鱼类皮肤局部黏膜免疫应答提供了理想的实验材料。

具体实施方式

本发明具体实施方式如下：

一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型构建方法，包括以下步骤：

1、刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算

利用专门的刺激隐核虫传代系统对刺激隐核虫进行传代和收集，其传代宿主为卵形鲳鲹。采集发育良好的刺激隐核虫包囊，置于消过毒的干净烧杯中孵化，孵化用水为高压灭菌的、加入适量青霉素和链霉素的自然海水；收集孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫虫液，充分混匀后取50μL，加10μL甲醛将幼虫杀死，在显微镜下计数，计算出幼虫虫液的虫体浓度。

2、斜带石斑鱼的分组和驯养

实验用鱼为20g左右的斜带石斑鱼，该大小便于操作，且刺激隐核虫感染后可引起强烈的免疫反应。将实验鱼随机分为13组，包括实验组12个、对照组1个，每组15尾鱼。鱼体驯养2周，直至其进食、活动正常。整个养殖过程中，海水经600目的滤网过滤，盐度30‰左右，pH8左右，溶氧量在5.6mg/L以上。

3、局部皮肤免疫

实验组用刚孵出2小时内不同浓度的刺激隐核虫幼虫进行局部感染。实验组设6个幼虫感染浓度：1000、5000、10000、15000、20000、30000个/ml，因为30000个幼虫/ml的感染浓度时已有部分鱼开始出现死亡，所以最高感染浓度设为此浓度；实验组设置30s和60s两个感染时间，为了尽量减少鱼体离开水体造成的环境胁迫，同时保证虫体能感染上宿主。12个实验组的幼虫感染浓度和感染时间如下表所示：

组号幼虫浓度(个/ml)感染时间(s)对照组06011000302500030310000304150003052000030630000307100060850006091000060101500060112000060123000060

表1

具体感染过程如下：取一个长15cm、宽5cm、高5cm的塑料容器，在长边的中点处套入一根橡皮筋，向塑料容器内倒入100ml不同浓度的新鲜刺激隐核虫虫液；将实验组鱼置入含1ppm丁香酚的海水中进行麻醉，完全麻醉后取出并用含2ppm聚维酮碘海水冲洗鱼体皮肤。设置计时器为30s或60s，将鱼体左侧朝下平放于盛有虫液的塑料容器中，轻按鱼体并使鱼的左侧皮肤接触虫液且头部及尾鳍暴露于虫液之外，并用橡皮筋将鱼体固定。按下计时器并保持鱼的左侧皮肤接触虫液；直至计时器响起后，用无虫水沿未感染测皮肤冲洗鱼体10s，去除未感染上的幼虫，再将鱼体转移至新鲜海水中正常养殖。

对照组用0个幼虫/ml的海水进行感染，感染时间为60s，操作同上。

4、感染强度的测定

在免疫后的48小时，各组取5尾鱼进行麻醉，并置于解剖镜下计数左右两边皮肤的滋养体数量，结果以均值表示，见下表：

表2

结果发现：未接触虫液的右边皮肤及对照组的左右边皮肤均未发现有滋养体，而接触虫液的左边皮肤在不同感染时间和浓度条件下均有不同程度的刺激隐核虫感染。用较高浓度(30000幼虫/ml)的刺激隐核虫感染后鱼体会出现不同程度的死亡，且相同浓度的刺激隐核虫局部感染皮肤30s后虫体的感染强度显著低于感染60s。因此，为保证较高的刺激隐核虫感染强度同时对鱼体的存活不造成影响，对于20g左右的鱼体，本发明推荐使用20000个/ml的虫液感染60s。

5、局部感染后鱼体的处理

刺激隐核虫感染鱼体3天后就会从鱼体脱落，发育成熟的包囊会孵化出新的幼虫再次感染鱼体。为避免斜带石斑鱼被首次感染后脱落的刺激隐核虫包囊孵出的幼虫再次感染，影响局部感染实验的结果，于刺激隐核虫感染后每2天将鱼体转移到干净的养殖缸内，轮换养殖3次后，置于养殖缸中正常养殖，即获得刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼皮肤的免疫模型。移除鱼体后的养殖缸，加入30cm深的淡水，浸泡8小时，即可杀灭所有粘附于缸底的刺激隐核虫包囊，刷洗后排净淡水，加注干净海水待下一次使用。