一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法，通过腹腔注射环磷酰胺得到免疫抑制缺陷小鼠，探讨了硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠的各种影响，成功建立了本模型，试验结果提示，硒化低聚氨基多糖能显著改善环磷酰胺所致免疫抑制小鼠机体免疫水平。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法。

背景技术

免疫系统由免疫器官和组织、免疫细胞及免疫因子组成。许多疾病的发生在很大程度上起源于机体免疫功能的障碍，免疫低下即是其中一种病因。免疫力低下最直接的表现就是机体容易患病，康复期很长且易反复。许多因素都会导致机体免疫力的下降，包括先天的不足、压力大、失眠、情绪过激等，且各年龄阶层的人群都有可能发生。随着时代的发展和科技的进步，人们对自身健康愈发的重视，而硒多糖所具备的广泛生物活性正好契合这种需要。

壳聚糖亦称氨基多糖作为一种阳离子多糖同时有极佳生物相容性，以及生物降解性，且无毒副作用，其弱酸性水溶液有高粘性，其表面的氨基基团带正电荷，可与细胞表面带负电荷的磷脂等生物大分子作用，使药物易于结合到细胞膜表面促进其吸收，因此已经广泛被应用于药物载体和医用辅助材料领域。硒对人体的必要性已是研究人员的共识，它是人体必需的微量元素之一，硒在体内主要参与抗氧化、甲状腺激素合成和免疫功能等代谢通路，硒在体内的缺乏会引起癌症等数种慢性疾病。随着人们对氨基多糖金属复合物的认识的进一步深入，结合有机硒化合物良好的生物学活性，人们对氨基多糖硒的研究也越来越多。低聚化促进了氨基多糖的水溶性，有利于促进吸收，进而极大发挥其生物活性。硒化低聚氨基多糖作为一种有机硒，毒性低、生物利用率高，且兼具多糖和硒的生物学功效，如免疫调节、抗氧化，抗肿瘤等，目前已是医药、食品保健等诸多领域的研究对象。

环磷酰胺(CPA)不仅是一种烷化剂类化疗药物，同时也是一种免疫抑制剂，其能破坏细胞DNA结构，导致细胞凋亡。在免疫毒理学研究中，环磷酰胺常被应用于动物免疫抑制模型的建立。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的不足，通过腹腔注射环磷酰胺得到免疫抑制缺陷小鼠，探讨了一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法，为将其发展为免疫调节剂提供一定的理论依据。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法，所述的建立方法步骤如下：(a)取80只小鼠，随机按照每组十只分成8组；

正常对照组：在第1-14天使用生理盐水灌胃，在第11-14天使用生理盐水进行腹腔注射；

环磷酰胺组：在第1-14天使用生理盐水灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+0.3硒化低聚氨基多糖组：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kg BW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+0.6硒化低聚氨基多糖组：在第1-14天使用以硒含量计0.6mg/kg BW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+0.9硒化低聚氨基多糖组：在第1-14天使用以硒含量计0.9mg/kg BW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+0.3亚硒酸钠组：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kg BW/day亚硒酸钠溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+低聚氨基多糖组：在第1-14天使用9.87mg/kg BW/day的的低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+低聚氨基多糖+0.3亚硒酸钠组：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kg BW/day亚硒酸钠溶液和9.87mg/kg BW/day的的低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mgCPA/kg BW/day进行腹腔注射；

(b)末次给药24h禁食后，小鼠称重，继而眼球取血，颈椎脱臼处死，随后迅速摘取脾脏和胸腺，用生理盐水洗涤脏器后经滤纸吸干水迹，分别称重，记录，依照公式计算脏器指数。

作为优选，所述的脏器指数公式为：脏器指数＝(脏器重量mg/小鼠体重g)×10。

作为优选，所述的建立方法还包括：(c)解剖小鼠，通过观测脾脏组织形态、脾脏淋巴细胞增殖反应以及小鼠血清细胞因子等指标评价硒化低聚氨基多糖在免疫抑制小鼠整体免疫功能中的作用。

作为优选，所述的小鼠为SPF级BALB/C小白鼠，雄性，6-8周龄，体重18～22g。

作为优选，硒化低聚氨基多糖的硒含量为27.3mg/g，其中由亚硒酸钠提供硒源，所用低聚氨基多糖分子量约为50kDa。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)按50mg/kg剂量连续腹腔注射环磷酰胺4天所建立的小鼠免疫抑制模型较为理想，与空白组比较，CPA组小鼠胸腺、脾脏指数、血清Th1/Th2细胞因子(IL-2/INF-γ，IL-4/IL-10)水平显著降低(P＜0.05)；脾淋巴细胞对ConA或LPS诱导的增殖反应明显受抑制(P＜0.05)；脾脏组织结构出现受损的情况。

(2)灌胃0.3、0.6mg/kg LSA能显著提高免疫抑制小鼠胸腺及脾脏指数(P＜0.05)。

(3)灌胃0.3、0.6、0.9mg/kg LSA能显著增强免疫抑制小鼠脾淋巴细胞对ConA或LPS诱导的增殖反应(P＜0.05)。

(4)灌胃0.3、0.6mg/kg LSA能改善免疫抑制小鼠脾脏组织结构的损伤情况。

(5)前期摄入0.6mg/kg LSA能显著提高小鼠血清INF-γ、IL-4水平(P＜0.05)；灌胃0.3、0.6、0.9mg/kg LSA能显著提高小鼠血清IL-2水平(P＜0.05)，其中中剂量组效果最好；灌胃0.6、0.9mg/kg LSA能显著提高小鼠血清IL-10水平(P＜0.05)。

附图说明

图1是硒化低聚氨基多糖对免疫抑制小鼠脾脏指数的影响。

图2是硒化低聚氨基多糖对免疫抑制小鼠胸腺指数的影响。

图3是各组小鼠脾脏组织形态学变化(HE染色，×100)。

图4是硒化低聚氨基多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。

图5是硒化低聚氨基多糖对小鼠血清细胞因子IL-2含量的影响。

图6是硒化低聚氨基多糖对小鼠血清细胞因子IFN-γ含量的影响。

图7是硒化低聚氨基多糖对小鼠血清细胞因子IL-4含量的影响。

图8是硒化低聚氨基多糖对小鼠血清细胞因子IL-10含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

一种硒化低聚氨基多糖对免疫抑制缺陷小鼠影响模型的建立方法，所述的建立方法步骤如下：

(a)取80只SPF级，雄性，6-8周龄，体重18～22g的BALB/C小白鼠，随机按照每组十只分成8组；

正常对照组(NC)：在第1-14天使用生理盐水灌胃，在第11-14天使用生理盐水进行腹腔注射；

环磷酰胺组(CPA)：在第1-14天使用生理盐水灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+0.3硒化低聚氨基多糖组(CPA+LSA(0.3))：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kgBW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；环磷酰胺+0.6硒化低聚氨基多糖组(CPA+LSA(0.6))：在第1-14天使用以硒含量计0.6mg/kgBW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；环磷酰胺+0.9硒化低聚氨基多糖组(CPA+LSA(0.9))：在第1-14天使用以硒含量计0.9mg/kgBW/day硒化低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；环磷酰胺+0.3亚硒酸钠组(CPA+Se-Ni(0.3))：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kg BW/day亚硒酸钠溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+低聚氨基多糖组(CPA+LA)：在第1-14天使用9.87mg/kg BW/day的的低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

环磷酰胺+低聚氨基多糖+0.3亚硒酸钠组(CPA+LA+Se-Ni(0.3))：在第1-14天使用以硒含量计0.3mg/kg BW/day亚硒酸钠溶液和9.87mg/kg BW/day的的低聚氨基多糖溶液灌胃，在第11-14天使用50mg CPA/kg BW/day进行腹腔注射；

其中硒化低聚氨基多糖的硒含量为27.3mg/g，其中由亚硒酸钠提供硒源，所用低聚氨基多糖分子量约为50kDa；

(b)末次给药24h(禁食)后，小鼠称重，继而眼球取血，颈椎脱臼处死，随后迅速摘取脾脏和胸腺，用生理盐水洗涤脏器后经滤纸吸干水迹，分别称重，记录。依照公式计算脏器指数。脏器指数＝(脏器重量mg/小鼠体重g)×10。

与正常对照组比较，环磷酰胺组小鼠连续腹腔注射环磷酰胺4天后，出现厌食、精神委顿等临床表现。因体重和脏器指数是反应动物整体健康状况好坏的直观指标，所以对各组小鼠体重、脾脏及胸腺指数进行测定，结果如表1、图1-2所示。从实验结果可知，化疗药物环磷酰胺(CPA)对小鼠体重无显著影响(P＞0.05)，但可显著降低小鼠脾脏和胸腺指数(P＜0.05)。与环磷酰胺模型组相比，灌胃0.3、0.6mg/kg LSA能显著提高小鼠脾脏及胸腺指数(P＜0.05)，0.9mg/kg LSA组小鼠的脾脏、胸腺指数较模型组有上升趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。此外，与模型组小鼠相比，亚硒酸钠组、低聚氨基多糖组及亚硒酸钠+低聚氨基多糖复合添加组小鼠的胸腺、脾脏指数均无显著性变化(P＞0.05)。

表1硒化低聚氨基多糖对小鼠体重、胸腺指数及脾脏指数的影响

注：用LSD检测法进行多重比较。表中标有不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)，标有相同小写字母则代表组间差异不显著(P＞0.05)。

2脾脏组织形态学观察

新鲜脾脏组织用生理盐水多次冲洗，洗去残留血液，于洁净EP管中用10mL4％多聚甲醛常温固定24h，随后进行乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，用切片机将组织石蜡块切成连续6μm组织切片，每组织块随机选取2张按常规流程进行苏木精-伊红染色(HE染色)，显微镜下观察组织病理变化。

器官保持完整的组织结构是其发挥功能的物质基础。脾实质由白髓、红髓和边缘区三部分组成。硒化低聚氨基多糖对小鼠脾脏组织形态的影响如图3所示，由图可知，正常对照组(图3A)：脾脏结构清晰，白髓、红髓界限明显，白髓面积大；环磷酰胺组(图3B)：脾脏结构较模糊，白髓和红髓界限不清，白髓面积明显减少；LSA处理组(3C-3E)：与环磷酰胺组比较，灌胃中、高剂量LSA小鼠的脾脏结构较清晰，红髓和白髓界限较明显，白髓面积增大。结果提示，LSA提前摄入对小鼠脾脏组织有保护作用。

3脾脏淋巴细胞增殖反应测定

先制备脾脏淋巴细胞悬液，步骤如下：

①取材。小鼠末次给药24h(禁食)后，颈椎脱臼处死，在75％乙醇中浸泡3min进行消毒，后移入超净台中，置于无菌的牛皮纸上。左侧腹部朝上，腹中部剪开小口，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，以眼科剪分离下面的结缔组织，取出脾脏，放在装有3mL Hank′s液的离心管中，冰上储存，尽快进行后续处理；

②研磨。培养皿置冰上，放入10mL Hank′s液，200目筛网置于培养皿上，用一次性注射器的活塞胶头研磨筛网上的脾脏，研磨过程中左手灵活固定筛网，使脾既在Hank′s液面下又没有贴着培养皿，轻轻快速研磨，至脾完全发白；

③裂解红细胞。将培养皿中脾脏悬液转移至15mL离心管中，300g离心5min后倒扣弃上清；每管加入2mL红细胞裂解液(已经0.22μm滤膜过滤除菌)，300g常温离心5min，倒扣弃上清；

④洗涤。Hank′s液重悬至12mL，300g离心5min，弃上清，如此重复2次；

⑤所得脾脏淋巴细胞用适量PRMI-1640完全培养液(含10％FBS，100U/mL青链霉素，50μM β-巯基乙醇)重悬，细胞计数板计数，调整细胞浓度为3×106个/mL用于后续指标测定。

脾脏淋巴细胞增殖反应测定：

将脾淋巴细胞(3×106个/mL)接种至96孔板，每孔100μL，再加入PRMI-1640空白培养液或含ConA或是LPS的PRMI-1640完全培养液100μL(ConA和LPS的终浓度分别为5μg/mL和10μg/mL)，置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养72h后，每孔加入50μL MTT(经0.22滤膜过滤除菌，MTT终浓度为0.5mg/mL)，继续培养4h，4000r/min离心10min，弃去各孔液体，每孔加入150μL DMSO溶解生成的甲臜，用酶标仪于波长490nm处测量各孔OD值，并以630nm为校准波长。以刺激指数(SI)为指标，判断淋巴细胞转化增殖程度，SI计算公式如下。

SI＝(刺激孔OD值-空白孔)/(为刺激孔OD值-空白孔)

考察LSA对免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响，结果如图4所示。由图可知，与正常对照组比较，环磷酰胺组小鼠脾脏淋巴细胞对ConA或LPS诱导的增殖反应明显受抑制(均P＜0.05)，而LSA能在一定程度上逆转CPA造成的抑制作用，具体表现为：与环磷酰胺组比较，各剂量组LSA均能明显提高免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应(P＜0.05)；0.6、0.9mg/kg BW剂量LSA能显著提高免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞对LPS诱导的增殖反应(P＜0.05)。此外，与环磷酰胺组小鼠相比，灌胃亚硒酸钠、低聚氨基多糖或亚硒酸钠+低聚氨基多糖小鼠的脾脏淋巴细胞对ConA或LPS诱导的增殖反应均无显著性变化(P＞0.05)。

4小鼠血清细胞因子检测

末次给药24h(禁食)后，小鼠眼球取血，分装于洁净干燥EP管中，室温静置2h后，4℃2000rpm/min离心10min，取血清保存于-80℃冰箱中备用。通过ELISA试剂盒测定血清中细胞因子(IL-2/IFN-γ，IL-4/IL-10)含量，具体操作按试剂盒的说明书进行。

考察硒化低聚氨基多糖对小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量的影响，结果见图5-8。由图可知，与正常对照组比较，环磷酰胺组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量均显著降低(P＜0.05)。与环磷酰胺组比较，低、中、高LSA小鼠血清IL-2含量均显著提高(P＜0.05)；灌胃0.3、0.9mg/kg LSA对环磷酰胺引起的IFN-γ、IL-4降低有一定的改善作用，但无统计学差异(P＞0.05)，0.6mg/kg LSA小鼠血清IFN-γ、IL-4含量有显著提高(P＜0.05)；0.6、0.9mg/kg LSA能显著提高小鼠血清IL-10含量(P＜0.05)。此外，与环磷酰胺组小鼠比较，亚硒酸钠组、低聚氨基多糖组及亚硒酸钠+低聚氨基多糖复合添加组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量均无显著性变化(P＞0.05)。