肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用及RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌药物中应用

摘要

本发明提供肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌药物中应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA。所述抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。所述抑制剂通过有效抑制RUVBL1基因的表达，从而能够有效抑制细胞增殖和迁移，为临床治疗肺癌提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用及RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。

背景技术

目前，肺癌属于世界上致死率较高的肿瘤，特别是非小细胞肺癌，严重地威胁着人类的健康和生命。因此,寻找有效的治疗肺癌药物与方法,彻底攻克肺癌,是当今我国乃至世界医学界的一个重要研究课题。

近年来，肿瘤学的研究在我国及世界范围的发展均极为迅速，科技的不断进步对肿瘤的治疗有很大促进作用。随着肿瘤分子生物学研究的进步，对肺癌相关基因的研究也日益深入，确定了许多与肺癌生成的有关基因。如原癌基因ras、myc、erbB基因家族及重要的抑癌基因p53、Rb、Chr3p、5p、9p 等。但是，肺癌基因的发生发展过程中，原癌基因和抑癌基因容易发生突变，使原本与肺癌相关的基因的检测方法受到了限制。

由于肺癌相关基因的易突变性，使得靶点治疗肿瘤的方式成为主流。靶向治疗正是肿瘤治疗变革的产物，具有较低的不良反应和良好疗效，能明显提高患者的生活质量，还可以大幅度减低患者发生副作用的风险，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。作为抗肿瘤领域的世界领先者，罗氏公司现拥有5个能延长患者生存期的靶向治疗药物，其中3个产品已经在中国上市。靶向治疗药物具有较光明的治疗模式，因此，筛选出合适的药物靶标为开发多种抗癌药物提供新的思路和方向。

与药物作用相关的靶或蛋白质主要有3类：①疾病相关(特异性)蛋白质；②生物标记分子；③信号传导分子。尽管目前现有技术中报道了关于肺癌的药物靶点的种类，但是有些靶点筛选的药物给药后会产生不良反应，例如药物毒副作用较强；还有一些药物靶点治疗效果不佳，容易导致延误患者病情，错过最佳的治疗时期。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供肺癌靶向治疗的抑制剂及RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用，所述抑制剂通过有效抑制 RUVBL1基因的表达，从而能够有效抑制肺癌细胞增殖和迁移。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了所述的抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。

本发明还提供了RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。

本发明提供了所述RUVBL1基因具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。

优选的，所述抗肺癌的药物为抑制RUVBL1基因表达的抑制剂。

优选的，所述抑制剂为权利要求1所述的肺癌靶向治疗抑制剂。

优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

本发明提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中 Seq IDNo.1、Seq ID No.2或Seq ID No.3所示的核苷酸序列。所述抑制剂能够有效抑制RUVBL1基因的表达，从而显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移。

本发明还提供了RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本发明通过检测临床肺癌组织及邻近正常肺组织中RUVBL1的表达水平，临床肺癌组织中RUVBL1的表达水平明显高于邻近正常肺组织的表达水平。通过分子生物学的方法使用CRISP/cas9技术成功的在肺癌A549细胞株中敲除RUVBL1。检测了敲除RUVBL1后通过细胞增殖实验、化疗药物敏感实验、 transwell实验、划痕实验、细胞成球实验、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞周期、EMT实验、裸鼠移植瘤实验等对A549细胞生物学功能的影响，结果表明通过抑制RUVBL1的表达水平，能够有效抑制细胞增殖。目前对于 RUVBL1在肺癌发生发展的作用还很少，本发明提供的应用，在肺癌发病机制中的作用进行了初步探索，为临床治疗肺癌提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。

附图说明

图1为实施例1中RUVBL1敲除A549细胞系的构建及RUVBL1在肺癌组织中的高表达情况；图1-A为RUVBL1基因敲除实验中使用的三条gRNA 的序列；图1-B为Westernblot实验显示RUVBL1被成功敲除的电泳图；图 1-C为基因测序显示RUVBL1被敲除后的序列对比图；图1-D为RUVBL1在肺癌多数样本中表达量增加示意图；图1-E为统计学分析显示RUVBL1在肺癌样本中表达量显著增加示意图；图1-F为TCGA分析RUVBL1在肺癌中表达量增加示意图；

图2为实施例2中RUVBL1可调节C-RAF、MEK、ERK的磷酸化；图 2-A为在敲除RUVBL1的A549细胞系中C-RAF、MEK、ERK的磷酸化情况；图2-B为RUVBL1敲除后的细胞中pC-RAF(259)磷酸化情况；图2-C为 RUVBL1敲除后的细胞中pMEK表达情况；图2-D为RUVBL1敲除后的细胞中pERK表达情况；

图3为实施例3中RUVBL1敲除后对A549细胞增殖、细胞周期及对化疗药物5-FU和CDDP敏感性的影响；图3-A为RUVBL1敲除后的A549细胞在72小时内的生长速度变化示意图；图3-B为RUVBL1敲除后A549细胞细胞周期多数停滞在G2/M期分析图；图3-C为RUVBL1敲除后的A549细胞的细胞周期多数停滞在G2/M期柱状统计图；图3-D为RUVBL1敲除后的 A549细胞中5-Fu的敏感性增加变化情况；图3-E为RUVBL1敲除后的A549 细胞中CDDP的敏感性变化情况；

图4为实施例4中RUVBL1敲除后的A549细胞的划痕实验、克隆形成实验及EMT实验结果；图4-A和图4-B为RUVBL1敲除后的A549细胞的迁移能力图；图4-C和图4-D为RUVBL1敲除后的A549细胞的克隆形成能力图；图4-E和图4-F为RUVBL1敲除后的A549细胞的上皮间充质转化能力变化图。

图5为实施例5中RUVBL1敲除后的A549细胞的成球能力实验、细胞干性标记CD44和CD133流式细胞术检测和western blot检测结果；图5-A为 RUVBL1敲除后的A549细胞的成球能力图；图5-B为流式细胞术检测野生A549细胞和RUVBL1敲除A549细胞的结果图；图5-C和图5-D为RUVBL1 敲除后的A549细胞流式细胞术检测CD44和CD133的表达情况；图5-E、图5-F和图5-G为RUVBL1敲除后A549细胞western blot检测CD44和CD133 的表达情况；

图6为实施例6中RUVBL1敲除后的A549细胞体内成瘤能力实验结果；图6-A为RUVBL1敲除后的A549细胞体内成瘤的形态；图6-B为RUVBL1 敲除后A549细胞体内成瘤的质量变化图；图6-C为RUVBL1敲除后A549 细胞体内成瘤的体积变化图；图6-D为RUVBL1敲除后的A549细胞体内成瘤的实验中裸鼠的体重变化图；图6-E为RUVBL1敲除后的A549细胞体内成瘤的HE染色图片；图6-F为RUVBL1敲除后的A549细胞体内成瘤的CD31 免疫组织化学染色图片。

具体实施方式

本发明提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中 Seq IDNo.1所示的核苷酸序列。

本发明中，所述抑制剂通过人工合成方法获得。本发明中，所述抑制剂委托生工生物(上海)股份有限公司合成。

本发明中，所述抑制剂能够有效抑制肺癌细胞中RUVBL1基因的表达，通过增强C-RAF(259)磷酸化程度来抑制C-RAF功能，并下调MEK、ERK 的磷酸化水平，使细胞周期多数停滞在G2/M期，细胞增殖受到抑制，同时细胞的迁移能力变弱。

本发明提供了所述的抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。

本发明中，所述抗肺癌药物的制备方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的基因药物常用的制备方法即可。

本发明还提供了RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。

本发明中，所述RUVBL1基因优选具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。RUVBL1蛋白优选具有如序列表中Seq ID No.3所示的氨基酸序列

本发明中，所述抗肺癌的药物优选为抑制RUVBL1基因表达的抑制剂。所述抑制剂优选为上述方案中所述肺癌靶向治疗抑制剂。

本发明中，所述肺癌优选为非小细胞肺癌。

本发明中，为了验证所述药物靶标的作用，构建基因敲除细胞模型(记为细胞-RUVBL1-KO模型)。所述基因敲除细胞模型的方法，优选包括以下步骤：

A.设计RUVBL1基因抑制剂gRNA的DNA寡核苷酸片段的正反向序列；

B.将设计得到的正反向序列进行磷酸化，得到双链片段；

C.将所述双链片段连接至质粒载体中，得到连接产物；

D.将所述连接产物进行纯化；

E.将纯化后的连接产物转染至肺癌细胞中，检测基因和蛋白的表达结果。

本发明中，所述设计抑制剂的DNA寡核苷酸片段的正反向序列用软件没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的设计软甲即可。本发明实施例中，采用麻省理工学院的CRISPR Design进行设计。所述CRISPR Design网址：http://crispr.mit.edu/。

本发明中，抑制剂的DNA寡核苷酸片段的正反向序列的长度优选为 18～22bp。所述正反向序列优选在5’端添加上粘性末端序列。所述粘性末端序列优选为CACCG或AAAC。在正反向序列的5’端添加上粘性末端序列有利于后期与质粒易于连接。

本发明中，将设计得到的DNA正反向序列进行磷酸化使人工合成的DNA 正反向序列形成双链结构。所述磷酸化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸化方法即可。

本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。

本发明中，所述纯化是将所述连接产物中存在的未连接在载体上的DNA 寡核苷酸片段的正反向序列进行线性化。本发明对所述线性化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的线性化的方法即可。

本发明中，转染的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转染方案即可。本发明实施例中，转染采用vefactor进行转染。所述肺癌细胞优选传代15代以内的细胞。所述肺癌细胞在平时培养时，密度优选低于超过 70％，当转染时，细胞的密度优选为70％～90％。

本发明中，转染后优选培养48h后筛选阳性细胞克隆。所述培养优选在细胞培养基中添加0.6～1.0μg/ml的嘌呤霉素(Puromycin)。所述阳性克隆的筛选方法依次包括细胞稀释、多克隆细胞淘汰、Western blotting及PCR法检测这些细胞克隆的基因敲除步骤。

本发明中，稀释的程度为至0.5个细胞/100μl培养液。优选将稀释后的细胞接种至96孔板中，每孔中1个细胞。

本发明中，所述PCR法的扩增引物为引物F:GCAAAATGAAGATTGAG GAGGT(Seq IDNo.4)和引物R:GCAAAATGAAGATTGAGGAGGT(Seq ID No.5)。

所述扩增程序为：

下面结合实施例对本发明提供的肺癌靶向治疗的抑制剂及RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质粒构建

1：设计和合成gRNA

设计gDNA序列

通过以下在线工具设计：

麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

设计三对20bp左右的gDNA，具体序列如下(图2A)：

gRNA1:AAGCCCTGAGGCCGCCTGCT

gRNA2:GCACATCCCCTTTTGGCAAG

gRNA3:CGCGCGAGAGGTGTGGCCAG(Seq ID No.1)

对应的正反向序列如表1示。

表1 gRNA-RUVBL1引物序列

2：将sgRNA克隆至pSpCas9(BB)质粒，与Cas9共表达

(1)将每条gRNA溶解至终浓度100μM,按照以下配方(表2)对sgRNA 进行磷酸化和退火

表2 sgRN与Cas9共表达体系配方

组分体积(ul)上游引物sgRNA(100uM)1下游引物sgRNA(100uM)1T4连接酶缓冲液,10X1T4PNK1水6共计10

(2)将上述混合物放置PCR仪中，利用以下程序对sgRNA进行磷酸化和退火：37℃30分钟，95℃5分钟，然后以5℃/分钟降至25℃。

(3)将上述已经磷酸化和退火的产物按1:200进行稀释，即取1μl加199 μl的PCR水。

(4)按照以下配方(表3)将上述稀释的产物与载体进行连接

表3稀释产物与载体连接体系

(5)将上述混合物放在PCR仪中，按照以下程序(表4)进行连接反应

表4稀释产物与载体连接条件

循环数条件1-637℃5分钟,21℃5分钟

(6)利用PlasmidSafe exonuclease来处理连接产物，将一些线性化的DNA 水解掉。具体反应体系如下(表5)：

组分体积(ul)2(5)步的反应产物11PlasmideSafe缓冲液,10X1.5ATP,10mM1.5PlasmideSafe核酸外切酶1共计15

(7)将PlasmidSafe反应体系放在PCR仪中：先37℃30分钟，再70 ℃30分钟.

取上述2μl产物来转染大肠杆菌(Stbl3strain)，挑单克隆，抽提质粒，采用U6启动子通用引物测序。

3.A549细胞的准备，细胞最好是15代以内的，平时培养时细胞密度一定不要超过70％。

4.将细胞传至6孔板，每个孔加2ml培养基，在转染前16至24小时不加抗生素，转染时细胞密度最好能达到70-90％，用lipofectamine 2000转染测序正确的pSpCas9(sgRNA)，具体过称为，取2.5ul lipofectamine 2000及1000ng 质粒，分别与250ul opti-MEM培养基轻轻混匀，静置5分钟，将二者混匀，静置20分钟，置于待转A549细胞中。

5.转染24小时后，加入筛选试剂嘌呤霉素Puromycin至终浓度为 0.8μg/ml，继续培养48小时来筛选阳性细胞克隆。

6.利用稀释法筛选单克隆细胞系。将细胞充分消化后，用培养基稀释至 0.5个细胞/100μl，按照此种稀释程度，24孔板的一个孔细胞最终至少接种至 2个96孔板。(这步，对细胞的稀释至关重要，确保使大多数的孔不能多于1 个细胞，在稀释前需对细胞计数)。

7.取100μl稀释好的细胞接种于96孔板，即每孔100μl。大概1周左右能长出单克隆，注意观察，如果某些孔长出多克隆，应将此孔标记去除。大约培养至2到3周，孔内细胞能张满，这时可将这些细胞消化下来扩大培养 (即为RUVBL1-KO细胞)，用于后续检测基因敲除情况。

8.用Western及PCR法检测这些细胞克隆的基因敲除情况。

PCR法检测这些细胞克隆的基因敲除情况。

所述PCR法的扩增引物为引物F:GCAAAATGAAGATTGAG GAGGT(Seq ID No.4)和引物R:GCAAAATGAAGATTGAGGAGGT(Seq ID No.5)。

所述扩增程序为：

Western法检测这些细胞克隆的基因敲除情况。

所有肺癌样本均来自云南省第一人民医院，肺癌包括腺癌和鳞癌，蛋白的提取过程如下：

取出肺癌样本，于肺癌及周边正常组织分别切取约0.5cm*0.5cm*0.5cm* 体积的样本，用PBS冲洗2-3次后放入1.5mm的离心管中，加入100ul Ripa 裂解液，置于冰上，用电动研磨器进行研磨，每次5秒中，至组织研磨充分， 4度离心，蛋白定量，western blot检测蛋白表达。

western blot实验步骤：

1.用洗涤精把玻璃板洗干净，再用去离子水冲洗，然后将玻璃板置于烘箱中至烘干。

2.配胶：配分离胶和浓缩胶，先配分离胶，配完分离胶后要加95％的分析纯乙醇液封，大约500μl；等分离胶充分凝固后，再配浓缩胶，根据样品数，选择合适孔的梳子插入收缩胶中。

3.上样：将凝胶板放到电泳槽中，倒入适量的的1×电泳缓冲液，然后小心缓慢地拔去梳子，将准备好的蛋白样品以及蛋白marker加入SDS-PAGE凝胶的各泳道中。以GAPDH蛋白为对照组。

4.电泳：打开电源，电泳仪条件为U＝80V，I＝100mA，电泳大约30min；然后将电压调至120V，电泳约1.5h。

5.转膜：预先配好转膜液，放入4℃预冷。转膜用的装置需提前洗干净。胶板从电泳槽中取出后，先切去浓缩胶。转膜前要把PVDF膜浸泡在甲醇中，待其浸透无白点时，才可放入转膜液中进行转膜。打开转膜用具，黑板朝下，放上一块棉垫，加三张滤纸(6×8cm)，每一步都需赶走气泡，将凝胶放在滤纸上，对整齐，加PVDF膜，赶气泡，再加三张滤纸，最后再放另一块棉垫，然后整齐的拿出三明治，放到电泳槽中。转膜条件为：U＝110V恒压 T＝1h10min。

6.封闭：用5％的脱脂牛奶(1×TBST配用)封闭。转膜结束后，将PVDF 膜放入杂交袋中，加入适量的5％脱脂牛奶，用塑料薄膜封口机封口，室温摇床上2h。

7.孵育一抗：3％的脱脂牛奶(1×TBS配用)作为配置液，按比例加入 KAP1蛋白一抗。用镊子将PVDF膜从脱脂牛奶中拿出。然后将PVDF膜放入杂交袋中，加入配制好的KAP1蛋白一抗，赶走杂交袋中膜上气泡，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，4℃过夜孵育。

8.孵育二抗：取出PVDF膜，KAP1蛋白一抗回收利用，将膜放在摇床上用0.1％的1×TBST漂洗3次，每次5min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入配制好的对应的二抗，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，室温孵育60min。

9.化学发光仪显影：二抗孵育完后，取出PVDF膜，用0.1％的1×TBST 漂洗3次，每次10min。漂洗后将PVDF膜浸泡于配制好的发光底物中，孵育 5min，将膜转移到杂交袋中，放入化学发光仪中，调好曝光时间进行显影。

检测结果见图1。

图1为实施例1中RUVBL1敲除A549细胞系的构建及RUVBL1在肺癌组织中的高表达情况；图1-A为RUVBL1基因敲除实验中使用的三条gRNA 的序列；图1-B为Westernblot实验显示RUVBL1被成功敲除的电泳图；图 1-C为基因测序显示RUVBL1被敲除后的序列对比图；图1-D为RUVBL1在肺癌多数样本中表达量示意图；图1-E为统计学分析显示RUVBL1在肺癌样本中表达量示意图；图1-F为TCGA分析RUVBL1在肺癌中表达量示意图；

由图1-B可知，Westernblot实验表明RUVBL1蛋白在肺癌细胞中高表达，同时，gRNA1，gRNA2和gRNA3作为抑制剂导致细胞中，只有gRNA3能够成功敲除RUVBL1基因，抑制RUVBL1蛋白的表达。图1-E为统计学分析显示RUVBL1在肺癌样本中表达量显著增加。

实施例2

野生型A549细胞为正常组，以未经EGF处理的细胞为starve组，以EGF 处理细胞为EGF组。以上述三组细胞为样本，分别测定RUVBL1、C-RAF、 p-C-RAF(259)、p-C-RAF(338)、B-RAF p-B-RAF(245)、A-RAF、p-MEK、 MEK、ERK、ERK、GAPDH蛋白为检测对象。

western blot实验

1.用洗涤精把玻璃板洗干净，再用去离子水冲洗，然后将玻璃板置于烘箱中至烘干。

2.配胶：配分离胶和浓缩胶，先配分离胶，配完分离胶后要加95％的分析纯乙醇液封，大约500μl；等分离胶充分凝固后，再配浓缩胶，根据样品数，选择合适孔的梳子插入收缩胶中。

3.上样：将凝胶板放到电泳槽中，倒入适量的的1×电泳buffer，然后小心缓慢地拔去梳子，将准备好的蛋白样品以及蛋白marker加入SDS-PAGE凝胶的各泳道中。

4.电泳：打开电源，电泳仪条件为U＝80V，I＝100mA，电泳大约30min；然后将电压调至120V，电泳约1.5h。

5.转膜：预先配好转膜液，放入4℃预冷。转膜用的装置需提前洗干净。胶板从电泳槽中取出后，先切去浓缩胶。转膜前要把PVDF膜浸泡在甲醇中，待其浸透无白点时，才可放入转膜液中进行转膜。打开转膜用具，黑板朝下，放上一块棉垫，加三张滤纸(6×8cm)，每一步都需赶走气泡，将凝胶放在滤纸上，对整齐，加PVDF膜，赶气泡，再加三张滤纸，最后再放另一块棉垫，然后整齐的拿出三明治，放到电泳槽中。转膜条件为：U＝110V恒压 T＝1h10min。

6.封闭：用5％的脱脂牛奶(1×TBST配用)封闭。转膜结束后，将PVDF 膜放入杂交袋中，加入适量的5％脱脂牛奶，用塑料薄膜封口机封口，室温摇床上2h。

7.孵育一抗：3％的脱脂牛奶(1×TBS配用)作为配置液，按比例加入一抗。用镊子将PVDF膜从脱脂牛奶中拿出。然后将PVDF膜放入杂交袋中，加入配制好的一抗，赶走杂交袋中膜上气泡，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，4℃过夜孵育。

8.孵育二抗：取出PVDF膜，一抗回收利用，将膜放在摇床上用0.1％的 1×TBST漂洗3次，每次5min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入配制好的对应的二抗，用封口机封口，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，室温孵育 60min。

9.化学发光仪显影：二抗孵育完后，取出PVDF膜，用0.1％的1×TBST 漂洗3次，每次10min。漂洗后将PVDF膜浸泡于配制好的发光底物中，孵育 5min，将膜转移到杂交袋中，放入化学发光仪中，调好曝光时间进行显影。

检测结果见图2。图2为RUVBL1可与C-RAF激酶结合并调节C-RAF、 MEK、ERK的磷酸化。图2-A表明在A549细胞系统中敲除RUVBL1后，在正常培养，饥饿处理及EGF激活三种条件下处理，均发现C-RAF、MEK、 ERK的磷酸化程度受到了影响。图2-B表明RUVBL1敲除后pC-RAF(259) 磷酸化水平显著升高。图2-C表明RUVBL1敲除后pMEK表达显著降低。图 2-D表明RUVBL1敲除后pERK表达显著降低。这表明，RUVBL1蛋白能够与EGF激活的细胞中的C-RAF结合，并降低C-RAF、MEK、ERK的磷酸化水平。

实施例3

细胞增殖实验：

1.显微镜观察细胞，当RUVBL1-KO细胞汇合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入PBS溶液轻轻冲洗，并弃去冲洗溶液。

2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。

3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μL的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/mL＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以A549(wt)为对照组。

4.配置细胞密度为每孔2000个单细胞悬液，然后向96孔板中的每个孔中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。

5.分别在培养箱中培养1d，2d，3d和4d后，向96孔板中加入10ul 10mg/ml 的CCK8试剂，随后在37℃，5％的CO₂细胞培养箱中孵育2h。

6.将96孔板放入酶标仪中，读取吸光值。使用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析作图。

流式细胞检测细胞周期

流式细胞术：

1.离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2.加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。

3.细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS 含50ug/mL溴化乙锭(PI)，100ug/mL RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟。

4.流式检测：以标准程序用流式细胞仪检测，计数1万个细胞，FL-2通道检测荧光值。

化疗药物敏感：

1.显微镜观察细胞，当RUVBL1-KO细胞汇合度达到80％～90％时，弃去培养基，加入PBS溶液轻轻冲洗，并弃去冲洗溶液。

2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。

3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μL的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间 16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/mL＝小格细胞总数×10⁴。最后计算出细胞的浓度。以A549(wt)为对照组。

4.配置细胞密度为每孔8000个单细胞悬液,然后向96孔板中的每个孔中加入单细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。

5.当细胞贴壁后，向96孔板中加入顺铂，并设定浓度梯度，加入到96 孔板。化疗药物CDDP的浓度梯度分别为：0，1，3，10，30，100，300μmol/L。 5-氟尿嘧啶浓度梯度分别为：0，100，1000，5000，10000ng/ml。

6.在5％的CO₂细胞培养箱中培养24h后，向96孔板中加入10ul>

7.将96孔板放入酶标仪中，读取吸光值。利用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析作图。

检测结果见图3。图3为RUVBL1敲除后对A549细胞增殖、细胞周期及对化疗药物5-FU和CDDP敏感性的影响。

图3-A表明RUVBL1敲除后A549细胞72小时内与对照组相比，其生长显著变慢且差异具有统计学意义。图3-B表明RUVBL1敲除后A549细胞细胞周期多数停滞在G2/M期。图3-C表明RUVBL1敲除后A549细胞细胞周期多数停滞在G2/M期且具有统计学意义。这说明，通过抑制RUVBL1基因表达后，能够有效抑制细胞的生长，且生长周期停滞在G2/M期。

图3-D和图3-E表明RUVBL1敲除后A549细胞对5-Fu的敏感性增加且具有统计学意义。这表明通过抑制RUVBL1基因后，采用化疗药物5-氟尿嘧啶和CDDP具有较好治疗作用。

实施例4

划痕实验：

1.显微镜观察细胞，当RUVBL1-KO细胞汇合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入PBS溶液轻轻冲洗一次，并弃去冲洗溶液。

2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含有10％的胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。

3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μL的细胞悬浮液，从血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间 16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/mL＝小格细胞总数×104。最后计算出细胞的浓度。以A549(wt)为对照组。

4.每个划痕小室中均匀的加入约1×10⁵个细胞，细胞放入37℃，5％的CO2>

5.第二天用取出划痕小室，并加入丝裂霉素拍照记录。

6.放入37℃5％CO₂培养箱，培养。每天拍照记录直到划痕消失。

7.统计方法：使用Image J软件得出划痕面积，用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析作图。

transwell实验：

1.显微镜观察细胞，当RUVBL1-KO细胞融合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入PBS溶液轻轻冲洗一次，并吸取冲洗溶液，加入无血清的培养基饥饿12h.

2.在超净台中取出Transwel小室，放置于24孔培养板中，小室内和放小室的孔内先加入PBS进行润洗3次，随后加入无血清的培养基润化5-15min, 备用。

3.加入一定量的胰酶后，把细胞放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆。

4.在超净工作台中加入无胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。收集在10ml的离心管中，离心3min，800rpm。

5.弃除上清，加入适量无血清的培养基重悬细胞，用微量移液器取10μ L的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/mL＝小格细胞总数×10⁴。最后计算出细胞的浓度。以A549(wt)为对照组。

6.计数后，取无血清培养基重悬一定数量的细胞悬液，将细胞密度调整至5×10⁴/ml。

7.将Transwell小室放入24孔板中，取上述细胞悬液200μl加入小室；取含10％FBS的培养基500μl沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间没有气泡。

8.将接种好的细胞放入培养箱，37℃，5％CO₂条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。

9.24h后，取出Transwell小室，并用棉签擦去靠近内室一面的细胞，然后用多聚甲醛室温固定30分钟，0.5％结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，然后在显微镜下观察小室中的细胞，记数，并拍下照片，用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析作图。

上皮间充质转化实验(EMT)

1.把肺癌A549细胞及RUVBL1-KO细胞铺入6孔板中，密度大约 30～40％。

2.贴壁后跟换为0.2％血清的培养基，8h后加入TGF-β(20μg/ml)1μl。

3.12h后拍照记录细胞形态，24h后收样western blot验证EMT相关蛋白。

western blot步骤同实施例1。

图4是RUVBL1敲除后A549细胞的划痕实验，克隆形成实验及EMT实验结果。图4-A和图4-B为RUVBL1敲除后A549细胞的迁移能力变弱且差异具有统计学意义。图4-C和图4-D为RUVBL1敲除后A549细胞的克隆形成能力变弱且差异具有统计学意义。图4-E和图4-F为RUVBL1敲除后A549 细胞的上皮间充质转化能力无显著改变。

实施例5

成球实验：

1.显微镜观察细胞，当RUVBL1-KO细胞融合度达到80％-90％时，弃去培养基，加入PBS溶液轻轻冲洗一次，并弃去冲洗溶液

2.加入一定量的胰酶后，把细胞放入5％的CO2，37℃细胞培养箱中，大约放置3分钟左右后拿出在显微镜下观察至细胞变圆后，在超净工作台中加入含胎牛血清培养基终止消化，用移液枪来回吸吹打散细胞。

3.细胞计数：取血球计数板，注意一定要干净，可以用酒精擦拭，将盖玻片盖在血球计数板上，血球计数板上有小方格的区域都要盖住。用微量移液器取10μL的细胞悬浮液，自血球计数板一端注入血球计数槽中，由于毛细作用悬液充满盖玻片和计数槽之间。置于倒置显微镜下观察计数，数出中间16个小格子总数，边缘的细胞两个算作一个。细胞数/mL＝小格细胞总数× 104。最后计算出细胞的浓度。以A549(wt)为对照组。

4.配置细胞密度为每孔1000个单细胞悬液，然后向细低粘附的6孔板里孔板中加入单细胞悬液,放入细胞培养箱中培养。设置3个复孔。

5.细胞置于培养箱内培养10-14天，每2-3天加入100ul培养基，并观察克隆球的形成情况。

6.细胞培养14天左右，即可进行拍照计数，用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析作图。

将RUVBL1-KO细胞为样本以A549(wt)为对照组进行流式细胞术检测 CD44和CD133的表达。具体细胞流式检测同实施例3。

将RUVBL1-KO细胞为样本以A549(wt)为对照组，采用western blot检测 CD44和CD133的表达。western blot步骤如图一。

图5是RUVBL1敲除后A549细胞的成球能力实验、细胞干性标记CD44 和CD133流式细胞术检测和western blot检测结果。

图5-A和图5-B为RUVBL1敲除后A549细胞的成球能力降低且差异具有统计学意义为流式细胞术检测野生A549细胞和RUVBL1敲除A549细胞的结果图。

图5-C和图5-D为RUVBL1敲除后A549细胞流式细胞术检测CD44和 CD133的表达减低且差异具有统计学意义。

图5-E、图5-F和图5-G为RUVBL1敲除后A549细胞western blot检测 CD44和CD133的表达减低且差异具有统计学意义。

实施例6

移植瘤实验：

选取健康的上述实验裸鼠12只，饲养一周，待体重约为20g，每只裸鼠左侧腋窝皮下注射0.2mL的细胞悬液，细胞浓度5×107个/mL。用游标卡尺测量移植瘤直径大小，动态观察敲除KAP1后的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每5天一次。30天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长宽。

HE染色：

石蜡包埋：50％酒精，1小时；70％酒精，1小时；80％酒精，1小时；90％酒精，1小时；95％酒精，1小时；无水酒精，1小时；无水酒精，1小时；无水酒精：二甲苯1:1，1小时；二甲苯透明，时间按组织块大小浮动；二甲苯：石蜡1:1时间按组织块大小浮动；石蜡，1.5小时；石蜡1.5小时。

事先将组织块切片，准备好盖玻片，

1.脱蜡：脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；

2.覆水：100％(Ⅰ、Ⅱ)、90％、80％、70％酒精各5min，自来水冲洗5min ×3；

3.苏木精染色5min(根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间)，流水冲洗。

4.5％乙酸分化1min，流水冲洗。(用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色)

5.返蓝：返蓝液

6.伊红染色1min(根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间)，流水冲洗。

7.脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10s，二甲苯1min(可以在通风橱自然晾干再封片，约5min左右)

8.滴上中性树胶，封片。(用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡)。

CD31免疫组织化学实验

将手术取出的裸鼠移植瘤，固定制片用于免疫组化。免疫组化试验按照以下步骤进行：

1)烤片:将制好的石蜡切片置于电热恒温干燥箱中，80℃烘烤3小时；

2)将干燥的石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗；

3)抗原修复；

4)滴加3％H₂O₂室温孵育10min以灭活内源性酶，PBS洗3次，每次3>

5)每张切片滴加正常山羊免疫血清封闭，室温孵育10min后甩去多余液体，勿洗，滴加按一定比例稀释CD31抗体(1:100)，4℃冰箱过夜；

6)从冰箱取出恢复至室温后，PBS洗3次，每次3min；

7)每张切片滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温20min，PBS洗3次，每次3min；

8)每张切片滴加酶标抗鼠兔聚合物(试剂B)，室温10min，PBS洗3 次，每次3min；

9)DAB显色，显微镜下控制反应时间，苏木素复染，蒸馏水充分水洗终止显色；

10)切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片；

11)使用相差显微镜200×倍视野下随机选取3个缺血半影区拍照。

图6是RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤能力实验检测结果。

图6-A为RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤明显变小。图6-B为RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤的质量显著减小。图6-C为RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤的体积显著减小。图6-D为RUVBL1敲除后A549 细胞体内成瘤的实验中裸鼠的体重无显著改变。

图6-E为RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤的HE染色。A549细胞组与RUVBL1敲除细胞组相比，肿瘤细胞形态不规则，胞核肥大、呈蓝色深染、核分裂相多见，偶见腺腔样结构。

图6-F为RUVBL1敲除后A549细胞体内成瘤的CD31免疫组织化学染色。在敲除RUVB1后的细胞中，棕黄色阳性表达的部位明显减少，即显示移植瘤血管生成减少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用及RUVBL1基因作为药物靶标在筛选抗肺癌药物中应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcgcgagag guguggccag 20

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagattg aggaggtgaa gagcactacg aagacgcagc gcatcgcctc ccacagccac 60

gtgaaagggc tggggctgga cgagagcggc ttggccaagc aggcggcctc agggcttgtg 120

ggccaggaga acgcgcgaga ggcatgtggc gtcatagtag aattaatcaa aagcaagaaa 180

atggctggaa gagctgtctt gttggcagga cctcctggaa ctggcaagac agctctggct 240

ctggctattg ctcaggagct gggtagtaag gtccccttct gcccaatggt ggggagtgaa 300

gtttactcaa ctgagatcaa gaagacagag gtgctgatgg agaacttccg cagggccatt 360

gggctgcgaa taaaggagac caaggaagtt tatgaaggtg aagtcacaga gctaactccg 420

tgtgagacag agaatcccat gggaggatat ggcaaaacca ttagccatgt gatcatagga 480

ctcaaaacag ccaaaggaac caaacagttg aaactggacc ccagcatttt tgaaagtttg 540

cagaaagagc gagtagaagc tggagatgtg atttacattg aagccaacag tggggccgtg 600

aagaggcagg gcaggtgtga tacctatgcc acagaattcg accttgaagc tgaagagtat 660

gtccccttgc caaaagggga tgtgcacaaa aagaaagaaa tcatccaaga tgtgaccttg 720

catgacttgg atgtggctaa tgcgcggccc caggggggac aagatatcct gtccatgatg 780

ggccagctaa tgaagccaaa gaagacagaa atcacagaca aacttcgagg ggagattaat 840

aaggtggtga acaagtacat cgaccagggc attgctgagc tggtcccggg tgtgctgttt 900

gttgatgagg tccacatgct ggacattgag tgcttcacct acctgcaccg cgccctggag 960

tcttctatcg ctcccatcgt catctttgca tccaaccgag gcaactgtgt catcagaggc 1020

actgaggaca tcacatcccc tcacggcatc cctcttgacc ttctggaccg agtgatgata 1080

atccggacca tgctgtatac tccacaggaa atgaaacaga tcattaaaat ccgtgcccag 1140

acggaaggaa tcaacatcag tgaggaggca ctgaaccacc tgggggagat tggcaccaag 1200

accacactga ggtactcagt gcagctgctg accccggcca acttgcttgc taaaatcaac 1260

gggaaggaca gcattgagaa agagcatgtc gaagagatca gtgaactttt ctatgatgcc 1320

aagtcctccg ccaaaatcct ggctgaccag caggataagt acatgaagtg a 1371

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Ile Glu Glu Val Lys Ser Thr Thr Lys Thr Gln Arg Ile Ala

1 5 1015

Ser His Ser His Val Lys Gly Leu Gly Leu Asp Glu Ser Gly Leu Ala

202530

Lys Gln Ala Ala Ser Gly Leu Val Gly Gln Glu Asn Ala Arg Glu Ala

354045

Cys Gly Val Ile Val Glu Leu Ile Lys Ser Lys Lys Met Ala Gly Arg

505560

Ala Val Leu Leu Ala Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Ala Leu Ala

65707580

Leu Ala Ile Ala Gln Glu Leu Gly Ser Lys Val Pro Phe Cys Pro Met

859095

Val Gly Ser Glu Val Tyr Ser Thr Glu Ile Lys Lys Thr Glu Val Leu

100 105 110

Met Glu Asn Phe Arg Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ile Lys Glu Thr Lys

115 120 125

Glu Val Tyr Glu Gly Glu Val Thr Glu Leu Thr Pro Cys Glu Thr Glu

130 135 140

Asn Pro Met Gly Gly Tyr Gly Lys Thr Ile Ser His Val Ile Ile Gly

145 150 155 160

Leu Lys Thr Ala Lys Gly Thr Lys Gln Leu Lys Leu Asp Pro Ser Ile

165 170 175

Phe Glu Ser Leu Gln Lys Glu Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Tyr

180 185 190

Ile Glu Ala Asn Ser Gly Ala Val Lys Arg Gln Gly Arg Cys Asp Thr

195 200 205

Tyr Ala Thr Glu Phe Asp Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Val Pro Leu Pro

210 215 220

Lys Gly Asp Val His Lys Lys Lys Glu Ile Ile Gln Asp Val Thr Leu

225 230 235 240

His Asp Leu Asp Val Ala Asn Ala Arg Pro Gln Gly Gly Gln Asp Ile

245 250 255

Leu Ser Met Met Gly Gln Leu Met Lys Pro Lys Lys Thr Glu Ile Thr

260 265 270

Asp Lys Leu Arg Gly Glu Ile Asn Lys Val Val Asn Lys Tyr Ile Asp

275 280 285

Gln Gly Ile Ala Glu Leu Val Pro Gly Val Leu Phe Val Asp Glu Val

290 295 300

His Met Leu Asp Ile Glu Cys Phe Thr Tyr Leu His Arg Ala Leu Glu

305 310 315 320

Ser Ser Ile Ala Pro Ile Val Ile Phe Ala Ser Asn Arg Gly Asn Cys

325 330 335

Val Ile Arg Gly Thr Glu Asp Ile Thr Ser Pro His Gly Ile Pro Leu

340 345 350

Asp Leu Leu Asp Arg Val Met Ile Ile Arg Thr Met Leu Tyr Thr Pro

355 360 365

Gln Glu Met Lys Gln Ile Ile Lys Ile Arg Ala Gln Thr Glu Gly Ile

370 375 380

Asn Ile Ser Glu Glu Ala Leu Asn His Leu Gly Glu Ile Gly Thr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Leu Arg Tyr Ser Val Gln Leu Leu Thr Pro Ala Asn Leu Leu

405 410 415

Ala Lys Ile Asn Gly Lys Asp Ser Ile Glu Lys Glu His Val Glu Glu

420 425 430

Ile Ser Glu Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ala Lys Ile Leu Ala

435 440 445

Asp Gln Gln Asp Lys Tyr Met Lys

450 455

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaaaatgaa gattgaggag gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaaaatgaa gattgaggag gt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcgcgagag gtgtggccag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggccacac ctctcgcgcg 20