法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-08-16
授权
授权
2018-02-13
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/86 申请日:20170915
实质审查的生效
2018-01-19
公开
公开
技术领域
本发明属于中药分析领域，涉及一种中药指纹的构建方法，特别是涉及一种正骨水指纹的构建方法及检测方法。
背景技术
基于中医药理论的中成药，药味组成比较繁多，一般是指将两味以上中药进行配伍组合并应用于疾病治疗的制剂。在制备过程中，不同成分之间可能相互发生反应，导致其成分更加复杂，所以准确检测其各有效成分的难度很大，如仅定性或定量的检测其中某个或某几个成分，由于信息量有限，难以体现中药组合物作为整体的化学特征。
正骨水是广西玉林制药集团有限责任公司自主研发的中成药，主要用于治疗跌打扭伤、骨折脱位及体育运动前后疲劳。该药由草乌、徐长卿、两面针、虎杖、碎骨木等26味中药组成，具有活血祛瘀、舒经活络、消肿止痛之功效。目前对正骨水的质量控制方法中，主要包括：(1)以降香对照药材、丹皮酚对照品、两面针对照药材进行薄层色谱鉴别；(2)以樟脑对照品、薄荷脑对照品进行气相色谱法鉴别；(3)以丹皮酚为对照品进行高效液相色谱法测定，其中每1ml正骨水含徐长卿按丹皮酚(C9H10O3)计算，不得少于0.1mg。
正骨水的特定原料药以及制剂成分复杂多样，上述方法仅针对部分药材或成分进行表征与控制，具有一定的片面性，均不能全面的反应正骨水中有效化学成分，不足以对其进行有效的质量控制。
发明内容
基于此，针对上述问题，本发明提供了一种正骨水指纹图谱的构建方法，从而实现对正骨水主要化学成分的整体分析与有效表征，建立具备系统性、特征性、稳定性的正骨水质量控制方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种正骨水的指纹图谱的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
(1)供试品的制备：精密取正骨水，以乙醇水溶液稀释并定容，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)高效液相色谱测定：精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的正骨水指纹图谱。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，高效液相色谱测定的色谱条件为：采用C18键合硅胶色谱柱，柱温20℃～35℃，以乙腈为流动相A，0.1％-0.4％的甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流动相的流速为0.5-1.5mL/min，检测波长为270nm-290nm。
在其中一个实施例中，梯度洗脱中的，流动相A、B的变化设置如下：
0～15min，所述流动相A的体积百分比由5％变化至20％，所述流动相B的体积百分比由95％变化至80％；
15～45min，所述流动相A的体积百分比由20％变化至30％，所述流动相B的体积百分比由80％变化至70％；
45～75min，所述流动相A的体积百分比由30％变化至50％，所述流动相B的体积百分比由70％变化至50％；
75～90min，所述流动相A的体积百分比由50％变化至80％，所述流动相B的体积百分比由50％变化至20％；
90～110min，所述流动相A的体积百分比由80％变化至100％，所述流动相B的体积百分比由20％变化至0％。
优选地，所述正骨水的指纹图谱构建方法包括以下步骤：
(1)精密取正骨水1ml，置于100ml容量瓶中，加入体积浓度50-75％的乙醇水溶液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪测定，即得具有共有特征峰的正骨水指纹图谱。
在其中一个实施例中，色谱条件为：采用C18键合硅胶色谱柱，柱温30℃，以乙腈为流动相A，0.1％的甲酸溶液为流动相B，流动相的流速为1mL/min，进行梯度洗脱，检测波长为280nm。
本发明的另一目的是提供一种正骨水指纹图谱的检测方法。
具体技术方案如下：
一种正骨水指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品的制备：精密取正骨水，以乙醇水溶液稀释并定容，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)高效液相色谱测定：精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得。
在其中一个实施例中，将步骤(2)检测得到的供试品溶液色谱图与上述构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，对正骨水的质量进行评价。
在其中一个实施例中，步骤(2)的色谱条件如下：
色谱柱：Agilent Extend C18(250×4.6mm，5μm)；
检测器：二极管阵列检测器；
柱温20℃～35℃，以乙腈为流动相A，0.1％-0.4％的甲酸水溶液为流动相B，流动相的流速为0.5-1.5mL/min，检测波长为270nm-290nm；
梯度洗脱：
0～15min，流动相A的体积百分比由5％变化至20％；
15～45min，流动相A的体积百分比由20％变化至30％；
45～75min，流动相A的体积百分比由30％变化至50％；
75～90min，流动相A的体积百分比由50％变化至80％；
90～110min，流动相A的体积百分比由80％变化至100％。
本发明的另一目的在于提供一种正骨水的指纹图谱，该指纹图谱是通过上述指纹图谱构建方法构建的，共有22个共有峰：两面针的特征峰包括1、3、4、5、8号峰；木香的特征峰包括2号峰；降香的特征峰包括6、7、9、10、12、13、15、16、17、20、21号峰；香加皮的特征峰包括11号峰；徐长卿的特征峰包括14号峰；樟脑的特征峰包括18号峰；五味藤的特征峰包括19号峰；香樟的特征峰包括22号峰。
基于以上技术方案，本发明具有以下效果：
本发明经发明人的大量实验和研究，确定了制备供试品溶液的方法及高效液相色谱方法的色谱条件的最优参数，由此构建出正骨水的指纹图谱，并将其应用到正骨水的质量控制当中，从而保证了不同操作者、不同实验室多重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内，体现了所述指纹图谱的通用性、稳定性和实用性，能够全面、有效地对正骨水进行质量控制。
附图说明
图1为考察不同检测波长试验下的色谱图，其中S1：254nm；S2：260nm；S3：280nm；S4：300nm；
图2为考察不同流动相试验的色谱图，其中，S1：乙腈-水；S2：乙腈-0.1％磷酸；S3：乙腈-0.1％甲酸的色谱图；
图3为考察流动相梯度试验的色谱图，其中，S1：梯度1；S2：梯度2；S3：梯度3；
图4为19批样品的叠加色谱图，其中S1-S19为样品的编号；
图5为正骨水的指纹图谱色谱图，其中的1-22为特征峰的编号；
图6为正骨水与对应原料药材特征峰的色谱图，其中，S1：正骨水213281；S2：降香；S3：两面针；S4：五味藤；S5：香加皮；S6：两香樟；S7：徐长卿；
图7为混合对照品、丹皮酚对照品与正骨水样品在280nm下的色谱图，其中S1：樟脑、4-甲氧基水杨醛和丹皮酚混合对照品；S2：丹皮酚对照品；S3：正骨水213281；
图8为精密度考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号；
图9为供试品稳定性考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号，其中，S1：0小时；S2：2小时；S3：4小时；S4：8小时；S5：12小时；S6：24小时；S7：48小时；S8：72小时；
图10为方法重现性考察的叠加色谱图，其中S1-S6为样品的编号。
具体实施方式
本发明提供了一种正骨水的指纹图谱构建方法及其指纹图谱，下面结合具体实施例，阐述本发明。
实施例1正骨水的指纹图谱构建中色谱条件的建立
一、仪器和试剂
1.仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪，配置脱气机G1322B、四元泵G1311B、自动进样器G1329B、柱温箱G1316A、紫外检测器G4212B；KQ-250B型超声仪(40KHz，昆山市超声仪器有限公司)；BT25S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；Synergy超纯水机(Millipore中国有限公司)。
色谱柱：Agilent Extend C18(250×4.6mm，5μm)；
2.试剂
乙腈(色谱纯，Merck公司)；甲酸(色谱纯，Merck公司)；磷酸(色谱纯，Merck公司)；超纯水；乙醇(分析纯)；
3.样品
正骨水批号：213281，213286，213290，213291，213294，213305，213309，213321,，213322，213324，213326，213327，1701002，1701003，1701004，1701005，1701006，1701008，1701010，由广西玉林制药集团有限责任公司提供。
二、色谱条件的建立
供试品的制备：精密取批号213281的样品10ml，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
色谱条件：色谱仪：Agilent1260高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent Extend C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min，二极管阵列检测器检测，波长为280nm。
1.紫外检测波长的确定
精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，检测器检测，并记录110min内的色谱图。以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱。
表1
分别考察254、260、280、300nm波长下的色谱图，结果见图1。
结果显示：280nm波长下的色谱峰较多，表观峰度较高，且基线相对平稳。因此选择280nm作为本发明所述方法的HPLC的检测波长。
2.流动相的确定
柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min，以乙腈为流动相A，分别以水、0.1％甲酸、0.1％磷酸为流动相B，选择确定流动相。
精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，检测器检测，并记录110min内的色谱图。全部按表1所示的洗脱程序进行梯度洗脱，结果见图2。
结果显示：乙腈-0.1％甲酸为流动相，色谱峰的保留时间更合适、峰形更好、基线更平稳。因此选择乙腈-0.1％甲酸为流动相。
1.3流动相流脱程序的确定
柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min，按照下列洗脱条件洗脱。
洗脱条件1：
表2
洗脱条件2：
表3
洗脱条件3：
表4
结果见图3，结合保留时间、分离度、峰的数量和基线分析，结果选择洗脱条件1作为本研究洗脱条件。
实施例2：高效液相色谱法测定正骨水色谱图
1、供试品溶液制备：
精密取批号213281的样品1ml，置于100ml容量瓶中，加入体积浓度70％的乙醇水溶液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
2、对照品溶液的制备：
丹皮酚(批号：110708-200506，购买于中国食品药品检定研究院)，4-甲氧基水杨醛(批号：110790-201404，购买于中国食品药品检定研究院)和樟脑(批号：111749-200601，购买于中国食品药品检定研究院)。
丹皮酚对照品溶液：精密称取丹皮酚对照品各9.99mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，制成浓度为0.1998mg/mL的溶液，作为对照品储备液。再取储备液1mL至100mL量瓶中，加甲醇溶解定容制成浓度为1.998μg/mL的对照品溶液。
混合对照品溶液：精密称取樟脑19.94mg置2mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度制成浓度为9.970mg/mL的溶液，作为对照品储备液；精密称取4-甲氧基水杨醛对照品各10.08mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，制成浓度为0.2016mg/mL的溶液，作为对照品储备液；取三种储备液各1mL至100mL量瓶中，加甲醇溶解定容制成丹皮酚、4-甲氧基水杨醛、樟脑浓度分别为1.998μg/mL、2.016μg/mL、99.7μg/mL的混合对照品溶液。
3、高效液相色谱测定：
分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，按以下色谱条件测定，并记录110min的色谱图。
色谱柱：Agilent Extend C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；；
流动相：以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，流速1.0mL/min，按表5梯度洗脱程序洗脱，二极管阵列检测器检测，波长280nm。
表5
实施例3正骨水指纹图谱的建立
按实施例2中的方法，检测19个批次(批号：213281，213286，213290，213291，213294，213305，213309，213321,，213322，213324，213326，213327，1701002，1701003，1701004，1701005，1701006，1701008，1701010)的样品，得到色谱图，如图4所示，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版，建立样品指纹图谱。
1、指纹图谱共有峰的标定
根据19批供试品检测的色谱图，用相对保留时间标定HPLC指纹图谱中的22个共有特征峰，如图5所示。
2、指纹图谱参照峰的选择
如图5所示，14号峰峰面积最大，分离较好，保留时间适中稳定，因此选择该吸收峰作为参照峰。
3、共有峰的相对保留时间及相对峰面积值
确定的22个共有峰，以14号峰为参照峰，将其保留时间和峰面积定为1，计算其他色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。
19个样品的22个特征峰的相对保留时间如表6-7所示：
表6
表7
19个样品的22个特征峰的相对峰面积如表8-9所示：
表8
表9
4、指纹图谱相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价19个样品进样得到色谱图的相似度，结果见表10，其中R表示对照指纹图谱：
表10
根据表10的数据显示，19个批次的样品对应的色谱图相似度都在0.9-1.0之间，未发现离群样本，符合国家食品药品监督管理局对重要指纹图谱相似度的要求。
5、制剂产品与各原药材的相关性及特征峰归属
按实施例2的方法，分别制备处方中各药材、以及对照品及供试品溶液，在与实施例2相同的色谱条件下，分别测定与样品相应量各药材的指纹图谱如图6所示，以及对照品的图谱如图7所示。将获得的样品以及对照药材色谱图对比，从而确认样品指纹图谱各特征峰的归属。
所得样品的供试品溶液的色谱图中22个色谱峰中，检出与相应量各药材参照指纹图谱相同的色谱峰共22个，正骨水指纹图谱对原来中的各个药材的化学成分均有体现。对样品中各峰进行药材及对照品归属，以14号峰为参照峰，根据各峰对应的相对保留时间，归属药材如表11所示。
表11
实施例4仪器精密度试验
精密取批号213281的样品，按实施例2的测定方法，连续进样6次，测定得到色谱图，如图8所示，共得到22个特征峰，以14号峰丹皮酚为参照峰，即将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
22个特征峰的相对保留时间如表12所示：
表12
22个特征峰的相对峰面积如表13所示：
表13
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价6次进样得到色谱图的相似度，结果见表14：
表14
表12-14的数据显示，22个特征峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.999，表明实验仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。
实施例5样品稳定性试验
精密取批号为213281的样品，按实施例2的方法配制样品，分别在0、2、4、8、12、24、48、72h共8个时间点测定，得到色谱图，如图9所示，共有22个特征峰，以14号峰丹皮酚为参照峰，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间与相对峰面积。
22个特征峰的相对保留时间如表15所示：
表15
22个特征峰的相对峰面积如表16所示：
表16
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价8个时间点对应的色谱图的相似度，结果见表17：
表17
表15-17的数据显示，22个特征峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于5％，相似度均大于0.999，表明实验样品72小时内稳定。
实施例6方法重现性试验
取批号为213281的样品，按实施例2的样品制备方法平行制备6份供试品溶液，并参照实施例2的方法测定，得到色谱图，如图10所示，共得到22个特征峰。以14号峰丹皮酚为参照峰，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
22个特征峰的相对保留时间如表18所示：
表18
22个特征峰的相对峰面积如表19所示：
表19
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价6份供试品溶液对应的色谱图的相似度，结果见表20：
表20
表18-20的数据显示，22个特征峰的相对保留时间RSD均低于1％，相对峰面积RSD均小于5％，相似度均大于0.999，表明实验方法重现性良好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
机译： 同时测定思茅汤多组分的方法及其指纹图谱的构建方法
机译： 基于毛细管四色荧光电泳检测系统和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种DNA指纹图谱构建方法
机译： 概率分布构建方法，概率分布构建设备，概率分布构建程序的存储介质，对象检测方法，对象检测设备以及对象检测程序的存储介质
