一株根霉菌ZH805及其应用

摘要

本发明提供了一种具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力和不产黑色孢子的食用发酵根霉菌(Rhizopus sp.)ZH805及其在提升液态发酵米醋质量和风味方面的应用。本发明的根霉菌ZH805具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力、不产黑色孢子，可显著提升米醋的原料利用率，可显著提升液态发酵食醋中的氨基态氮与总酯含量，还可以大幅改善液态发酵米醋的口感与风味，酿造出的米醋风味纯正度较高，酸度适中，酯香味突出，口感回甜度好。同时本发明的根霉菌ZH805亦可广泛应用于米酒、黄酒和米醋等发酵食品中。采用本发明根霉菌ZH805的制曲技术是基于现有的设备与资源，可以充分利用空闲制曲车间与成熟的制曲技术，具有较好的可操作性和经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于食品发酵与食品加工技术领域，具体涉及一株具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力和不产黑色孢子的食用发酵根霉菌(Rhizopus sp.)ZH805及其在提升液态发酵米醋质量和风味方面的应用。

背景技术

食醋是人们常用的酸性调味品，不仅具有调味功能，而且具有良好的保健功能，可防治多种疾病。据不完全统计，全世界食醋每年年产量在千万吨以上。我国的食醋酿造最早主要以固态发酵法为主，但是近些年来，液态发酵米醋工艺因其发酵周期短、产能大、机械化程度高以及劳动生产效率高等优势，越来越受到众多企业的青睐，在我国也逐渐推广开来。液态发酵工艺采用醋酸菌纯种发酵，相对于固态发酵食醋的细菌、酵母、霉菌等多菌种混合发酵，其存在风味、色泽较差，缺乏醇厚柔绵感的特点。同时与传统固态发酵食醋风味成分相比，其氨基态氮、总酯、不挥发酸等物质的含量差异也较大，而这些物质正是影响食醋口感和风味的关键成分。

目前，为提高液态发酵食醋的口感与风味，主要采取了如下几种方式来进行品质提升：

1)、采用多菌株混菌发酵技术。如在发酵过程中引入酵母、黑曲霉、米曲霉等具有较强酸性蛋白酶活力、酯化力、酒精发酵力的菌株进行混合发酵，以提升食醋中的氨基态氮含量、风味物质含量，从而提升食醋品质。

2)、改变食醋酿造原料种类。如为了增加食醋中的营养成分，在大米之外添加一定量豆粕、麸皮，通过增加原料中的蛋白质含量来提升食醋中蛋白质的含量。

3)、食醋的后熟陈化研究。发酵成熟的醋醅采用一些物理手段如臭氧、红外线、超高压电场等进行人工加速陈化，以提升食醋品质。

以上技术手段均报道有一定的效果，然而其在生产企业实现大规模应用具有一定难度，而利用一株根霉菌与一株产酯酵母混合制备米曲，在制曲的过程中完成淀粉质和蛋白质的分解，同时形成一些重要的风味物质，再利用该曲料进行酒精发酵和醋酸发酵来提升米醋品质的专利与文献比较少见。

经文献与专利调研，本发明人发现在中国发明专利ZL201310587714.2、ZL201310588158.0和ZL201310587454.9中提到了在液态发酵米醋制备过程中外加由黑曲霉、米曲霉和根霉菌三株菌株复合制备的种曲对于提升液态醋的原料利用率和风味具有较大的作用，然而其外加的复合菌株主要是在糖化的过程中加入，并未起到较大的蛋白质和淀粉分解的作用，且其针对的也主要是一些具有保健功能的谷物。在中国发明专利申请CN106434254A、中国发明专利ZL201410701656.6中提供了一种酱味醋的制备方法，其主要应用的菌株为黑曲霉、米曲霉，通过菌株的发酵特性来形成具有特殊风味的食醋；在中国发明专利ZL201110307690.1中提供了一种获得高还原糖高氨基态氮食醋的制作方法，其利用的发酵菌株也是黑曲霉和米曲霉，且其应用对象主要是针对传统固态发酵食醋；在中国发明专利ZL201410185333.6中提供了一株高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉，其具有较好的原料利用能力，然而这株曲霉的应用对象是白酒行业，其主体风味物质与食醋有较大差异；中国发明专利ZL201410014845.6提到了一株具有高酸性蛋白酶活力的华根霉菌，并详细介绍了其培养的方法及应用，但是其也主要是通过制备麸曲来应用于酿酒中，与本专利无明显关系。

上述文献和资料在提升液态发酵食醋品质方面虽然有一定的效果，但也存在一些问题与不足，主要有如下几点：1)采用多菌种混菌发酵对于企业而言，因需要增设微生物种子液发酵罐等固定投资，因此需要额外增加一些设备投资。2)通过改变食醋制备原料和种类来提升食醋品质，一方面，存在面临需要在生产配方中标识的问题，这可能会导致消费者对该产品是否属于纯酿米醋产生疑虑；另一方面，额外增加原料，也会相应增加物料成本；3)采用后熟陈化技术，虽然是一项较为不错的方法，可以在米醋成熟后来提升其品质，但是其也存在生产企业实施的技术难度与投资成本较大、后熟时间较长的缺点。

上述检索到的专利或者专利申请中虽然有部分涉及利用黑曲霉、米曲霉或根霉菌制曲技术提升食醋的氨基态氮、还原糖、酯类等成分，但其基本是将原有发酵体系中的优势菌种进行生物强化，主要是在传统固态发酵食醋或是白酒行业中进行应用，同时服务于自身食醋品种，并未有涉及液态发酵食醋的报道出现。

发明内容

鉴于以上技术的不足，本发明目的在于筛选获得一株具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力、不产黑色孢子的根霉菌，并以普通大米为原料，利用该菌株与一株产酯酵母—异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)(GIM2.18)混合制备米曲，在制曲的过程中完成淀粉质和蛋白质的分解，同时形成一些重要的风味物质如氨基态氮、酯类物质，而后将该曲料进行酒精发酵、醋酸发酵，从而获得具有高原料利用率、高氨基态氮水平和总酯含量的液态发酵食醋，改善液态发酵食醋的口感与风味。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下实验方案：

本发明提供了一株根霉菌ZH805，已于2017年6月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCCNo：60200。

本发明的根霉菌ZH805，是发明人从佛山市海天(高明)调味食品有限公司现有酒曲中，经过多次选择性筛选和分离纯化培养获得，该菌株具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力且不产黑色孢子的特点。

本发明还涉及所述的根霉菌ZH805和一株异常汉逊酵母(GIM2.18)混合制备米曲的工艺，并将该工艺应用于米醋制备，不仅可以显著提升液态发酵食醋中的氨基态氮与总酯含量，还可以大幅改善液态发酵米醋的口感与风味。

因此，在一方面，本发明提供根霉菌ZH805。

在另一方面，本发明提供所述根霉菌ZH805在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，所述食品发酵为酒类或醋类发酵。在又一个实施方案中，所述酒类为米酒或黄酒，所述醋类为米醋。

在又一方面，本发明提供所述根霉菌ZH805在制曲中的用途。在一个实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备米醋。

在另一方面，本发明提供所述根霉菌ZH805在制备米醋中的用途。

在又一方面，本发明提供制备米醋的方法，其中将所述根霉菌ZH805与产酯酵母混合制备米曲。在一个实施方案中，所述产酯酵母为异常汉逊酵母GIM2.18。

本发明的有益效果：

(1)筛选获得具有高糖化酶活力、高酸性蛋白酶活力、不产黑色孢子的根霉菌ZH805(保藏号：GDMCCNo：60200)，可广泛应用于米酒、黄酒、米醋等发酵食品中；

(2)提供了根霉菌ZH805与一株产酯酵母(GIM2.18)混合制备米曲的制备方法，该米曲应用于米醋制备过程中不产黑色孢子，且酿造出的米醋风味纯正度较高，酸度适中，酯香味突出，口感回甜度好。

(3)可显著提升米醋的原料利用率、氨基态氮和总酯含量，提升发酵米醋的品质。同时该制曲技术是基于现有的设备与资源，可以充分利用空闲制曲车间与成熟的制曲技术，具有较好的可操作性和经济效益。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为本发明根霉菌ZH805的获得及应用流程图。

图2为本发明根霉菌ZH805的孢子形态图。

图3为无发酵菌剂米醋、不同根霉菌发酵食醋鉴评鉴评结果。

生物保藏信息

一株根霉菌ZH805，已于2017年6月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCCNo：60200。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

目标菌株的分离筛选方法

以佛山市海天调味食品有限公司生产的酒曲为原料，经粉碎过40目筛，称取25g加入到装有225ml三级水的三角瓶中，加入数颗玻璃珠，于150rpm摇床中震荡30min，然后，将所得到的液体制成不同的稀释梯度10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液，于加入有去氧胆酸钠和链霉素的PDA固体培养基(制备方法为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟)中进行培养，培养24h后，挑选具有根霉菌典型菌落形态的菌株，转接到淀粉鉴别培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，水1000ml，PH7.0-7.2，琼脂20g，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟)中进行培养，以水解圈大小对各菌落进行编号，培养一段时间后，挑选菌落水解圈最大的菌株，经过多次分离纯化后，最终筛选出一株根霉菌，命名为ZH805。

实施例2

根霉菌鉴定方法

1)、将筛选出的根霉菌ZH805进行相关的生理生化特性检测，其检测结果与根霉菌3.866对比，基本一致。

2)、依据1973年科学出版社出版的周德庆主编的《微生物学实验手册》、《常见与常用真菌》相关书籍作为菌株的形态学特征的参考依据。

3)、本发明筛选的根霉菌ZH805的菌落形态为PDA固体培养基培养15h后，菌落直径约为1.0-1.4cm，菌丝致密。36h后菌丝铺满整个平板。根霉菌ZH805的菌落形态如图2所示。

由图2可知，根霉菌ZH805均为白色孢子，无黑色孢子产生。

实施例3

利用根霉菌ZH805与异常汉逊酵母(GIM2.18)制备种曲

1)、小斜面培养：将根霉菌ZH805接种于PDA固体培养基中，异常汉逊酵母接种于麦芽汁固体培养基(制备方法：1000ml麦芽汁，15-20g琼脂，高压蒸汽灭菌(115℃)灭菌20分钟)中，分别于30℃培养2-3天，即活化为一代菌株。

2)、三角瓶培养：

将步骤1)中的根霉菌ZH805接种于已灭菌的PDA液体培养基(制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟)中，于30℃，150rpm培养24h，使其菌体浓度为10⁷-10⁸cfu/ml，于4℃冰箱保藏备用。

将步骤1)中的异常汉逊酵母接种于已灭菌的PDA液体培养基中于，30℃，150rpm培养24h，使其菌体浓度为10⁷-10⁸cfu/ml，于4℃冰箱保藏备用。

3)、种曲培养：

将麸皮与米糠按照7:3比例(质量比)进行混合、润水，装于曲盘中，每盘装5kg曲料，并进行灭菌，然后将步骤2)中的根霉菌ZH805和异常汉逊酵母分别接种于已事先灭菌的曲料中，于30℃条件下进行扩大培养，培养2-3天即可成熟，为种曲。

实施例4

根霉菌单独制曲相关理化结果

以根霉菌3.866、根霉菌Q303按照实施例3所述方法制备相关种曲，对上述种曲在相同条件下检测其糖化酶和酸性蛋白酶活力，检测结果如表1所示。

表1.不同根霉菌糖化力与酸性蛋白酶活力检测结果

菌株糖化酶(U/g)酸性蛋白酶活力(U/g)根霉菌3.8661315357根霉菌Q3031452416根霉菌ZH8051817452

由表1可知，在三种根霉菌中，根霉菌ZH805糖化力和酸性蛋白酶活力相对其他2株根霉菌具有显著优势，其中糖化力相对于根霉菌3.866糖化力高出近38％，相对于根霉菌Q303糖化力高出近25％；酸性蛋白酶活较根霉菌3.866糖化力高出26.7％，相对于根霉菌Q303糖化力高出8.7％。

实施例5

根霉菌ZH805制备米曲试验

以大米为原料，加入2倍自来水浸泡6-8h，滤干水后，于0.15MPa压力下蒸煮30分钟，待米饭冷却后分别添加实施例3获得的种曲，根霉菌ZH805接种量为1％，异常汉逊酵母接种量为6‰-8‰，同时以根霉菌3.866、根霉菌Q303为对照，于30℃，相对湿度80％左右条件下培养48-72h，培养结束即为成熟曲料，取成熟曲料检测糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶活力。检测结果见下表2。

表2.不同根霉菌米曲制备试验酶活检测结果

由表2可知，采用根霉菌ZH805制备的米曲的糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶较根霉菌3.866分别提高了58％、43％、37.5％，较根霉菌Q303分别提高了17.4％、35％、31％。

实施例6

根霉菌ZH805曲料制备米醋对比试验

为了进一步明确根霉菌ZH805对液态发酵食醋质量提升的效果，本发明人以上述实施例5中制得的曲料进行酒精发酵和醋酸发酵，其具体操作步骤为：

1)、将曲料加入1倍自来水，接入已活化好的活性干酵母，接种量为5％，接种后将曲料搅拌均匀。于28～33℃条件下静置发酵4～5天，发酵结束后通过板框过滤器进行压榨，得到米酒清夜，并检测米酒清液的酒精度和还原糖，其检测结果如下表3。

2)、将上述米酒清液泵送至醋酸发酵罐，接入已活化好的醋酸菌进行醋酸发酵。醋酸发酵阶段采用Frings深层液态发酵系统(德国福林斯公司，型号Acetator型、容积100L)，发酵温度控制在30～32℃，发酵时间为20-24小时，发酵成熟后，检测米醋的理化指标，其检测结果如下表4。

表3.不同曲料发酵米酒检测结果

菌株酒精度(％VOL)还原糖(g/l)根霉菌3.8668.24.1根霉菌Q3039.14.5根霉菌ZH80510.25.4

由表3可知，采用根霉菌ZH805发酵的米酒，其酒精度较根霉3.866和根霉Q303分别提高了24.4％和12％，且其清液残留的还原糖也明显高于其他两株根霉，充分说明根霉ZH805较其他两株根霉具有较高的原料利用率。

表4.不同曲料发酵米醋检测结果

由表4可知，对比无发酵菌剂米醋与根霉菌ZH805制备的米醋，根霉菌ZH805的各项理化指标均要远远优于常规的液态米醋，特别是其在氨基态氮、总酯、还原糖与不挥发酸等方面。对比不同根霉菌制备的米醋，根霉菌ZH805在酸度相近的情况下，其他各项理化指标均要优于另外两组米醋。

在此基础上，本发明人将无发酵菌剂米醋、根霉菌ZH805与根霉菌3.866、根霉菌Q303发酵的米醋在色泽、香气、刺激性、回甜度、酸味等方面进行感官鉴评分析，感官鉴评由经过专业训练的专业人员进行，以上评价指标的分值为0～5分，分数越高，该项指标越好，其鉴评结果如表5和图3所示。

表5.米醋感官鉴评结果

如表5和图3所示，与无发酵菌剂米醋相比，根霉菌大米制曲发酵米醋在香气、色泽、回甜度等方面均有较大改善，且根霉菌ZH805在香气、色泽和回甜度三个维度上表现均要优于其他两株根霉菌。

综上所述，采用根霉菌ZH805米曲制备工艺可以显著改善液态发酵食醋的口感与风味，全面提升米醋质量。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。