橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基及橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法

摘要

本发明提供了橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基及橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，属于组织培养技术领域。所述诱导培养基是包含2,4‑D配合6‑BA、玉米素、TDZ、椰子汁和蔗糖的改良MS培养基，很大程度提高了胚性愈伤组织的诱导率。所述橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，将花药经初代诱导、胚性愈伤组织诱导和体细胞胚状体分化培养，分别得到胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体，将两者同步接种到增殖培养基上，以子叶形体细胞胚状体看护哺育，使胚性愈伤组织有效快速增殖。伴随着子叶形体细胞胚的萌发，胚性愈伤组织快速增殖，且同步性很好，皆处于胚性愈伤组织原胚性未分化状态。

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基及橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)隶属于大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，是多年生异花授粉乔木。橡胶树是天然橡胶的主要来源，而我国天然橡胶自给率仅为18％。当前，我国天然橡胶进口来源高度集中在泰国、印度尼西亚、马来西亚、越南等东南亚国家。进口来源高度集中、地缘政治不稳定和资源争夺激烈，使我国天胶进口不确定性加大，潜在风险重重。鉴于我国植胶区面积有限，提高橡胶树产量是保证自给的有效途径，而培育高产抗逆抗病的优良品种是提高橡胶树产量的有效手段。

当前，由于国内橡胶树再生体系低效、优质遗传转化受体材料匮乏等因素，使得我国未能建立稳定、高效的橡胶树遗传转化体系，致使橡胶树分子生物学尤其是橡胶树功能基因组方面的研究明显滞后于发达国家。橡胶树稳定、高效的再生体系以及大量优质遗传转化受体材料又是建立橡胶树稳定、高效的遗传转化体系的前提保证。

植株的再生途径大致分为两种：一种是体细胞胚胎发生途径，即通过形成体细胞胚状体获得再生植株；另一种器官发生途径，即先形成芽再形成根的获得再生植株。通过器官发生途径获得再生植株并进行快速繁殖已成为一种较有效的繁殖方式，但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长，获得无菌苗速度较慢，且无菌苗长期连续增殖极易发生退化或变异等缺点。因此选择体胚胎发生途径是橡胶树当前建立再生体系的重要途径。

我国橡胶树再生体系从已有的报道来看，以花药为外植体诱导愈伤组织，以体细胞胚状体途径形成再生植株的体系相对成熟。比较容易的品系如“海垦2”、“热研88-13”，其植株诱导率仅有4％～5％，而其它品系都在1％以下。胚性愈伤组织诱导率较低直接影响愈伤组织发育成再生体系的数量，因此胚性愈伤组织的数量是建立再生体系的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基，所述诱导培养基在诱导胚性愈伤组织方面具有较高诱导成功率。

本发明的另一目的在于提供橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法培养方法，利用所述方法能够获得大量橡胶树胚性愈伤组织。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-二氯苯氧乙酸0.8～1.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.3mg/L、玉米素0.3～1.0mg/L、噻二唑苯基脲0.04～0.1mg/L、椰子汁体积浓度4％～10％、蔗糖50～80g/L和植物凝胶2.0～2.5g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括为硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述诱导培养基的pH值为5.5～6.0。

优选的，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、玉米素0.5mg/L、噻二唑苯基脲0.05mg/L、椰子汁体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L。

优选的，所述诱导培养基的pH值为5.8。

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，包括以下步骤：

1)从清洗、消毒后的橡胶树雄花中分离单粒花药并以单粒花药接种的方式接种到初代诱导培养基中进行暗培养，诱导出花药脱分化愈伤组织；

2)将所述步骤1)中得到的花药脱分化愈伤组织接种至权利要求1～3任意一项所述的诱导培养基上暗培养20～30d，得到胚性愈伤组织；

3)将所述步骤2)得到的胚性愈伤组织接种到体细胞胚诱导培养基上进行继代培养45～60d，分化出不同发育时期的体细胞胚状体，同时伴随胚性愈伤组织的增殖；

4)选择步骤3)中得到的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体同步接种于增殖培养基中散射光培养25～30d，得到增殖的胚性愈伤组织。

优选的，所述步骤4)中增殖培养基是以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：水解酪蛋白280～320mg/L、椰汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、质量浓度0.08％～0.12％活性炭和植物凝胶2.0～2.5g/L；所述所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

优选的，所述步骤1)或步骤2)中暗培养、步骤3)中的继代培养以及步骤4)散射光培养中环境条件独立为：白天温度为23～27℃，夜晚温度为21～25℃，环境湿度为78％～82％。

优选的，所述步骤3)中继代培养为每23～26d继代一次。

优选的，所述步骤1)中橡胶树雄花的纵径为2.81～3.20mm，所述橡胶树雄花的横径为1.37～1.43mm，所述橡胶树雄花的纵横比为2.15～2.18；所述花药的发育时期为单核靠边期；所述花药接种为单粒花药接种。

优选的，所述步骤1)中清洗用溶液为质量浓度为0.15％～0.25％的硫磺皂水。

优选的，所述步骤4)中胚性愈伤组织的形态特点为质地紧实、表面具有球形颗粒。

本发明提供了橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基，2,4-D诱导愈伤组织的形成，配合使用6-BA促进细胞分裂和后期再分化，避免因单独添加2,4-D愈伤组织诱导较快速，导致细胞组织结构疏松的问题。同时玉米素Zt对胚性愈伤组织诱导有很好的促进作用以及维持胚性；TDZ具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能，增进胚性细胞的分裂；椰子汁中含有丰富的氨基酸、多种矿质元素和维生素，具有抗氧化活性物质、生长素等，能使植物成熟细胞迅速而不规则分裂从而刺激植物生长的活性物质等，在外植体接种诱导愈伤组织和细胞培养中，有保护外植体抗氧化和促进细胞组织生长作用。蔗糖作为培养基中的碳源，同时还有效调节培养基内的渗透压。在脱分化诱导愈伤组织的基础上，维持适量和适宜比例的2,4-D和6-BA，继续诱导紧致愈伤组织，新添加具有增进胚性细胞分化的细胞分裂素类物质玉米素Zt，以及有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能、作用活性强的细胞分裂素类物质TDZ，既促进胚性细胞的分化和分裂，同时，又适当降低外源生长素/细胞分裂素的比例，避免因继代积累的外源生长素/细胞分裂素的比例过高导致内源IAA含量下降，从而使愈伤组织内源IAA/CTKs维持在9～10间，利于胚性细胞的分化诱导从而形成胚性愈伤组织，以提高胚性愈伤组织的诱导率。而椰子汁中含丰富的氨基酸、多种矿质元素营养元素辅助胚性细胞诱导所需的营养，同时添加的椰子汁中具有天然抗氧化活性物质和维生素E、C等，有保护诱导出的胚性细胞抗氧化，促进细胞健康增殖生长。采用本发明提供的所述诱导培养基对橡胶树胚性愈伤组织诱导成功率达67.5％，与相同材料接种至常规诱导培养基中产生的胚性愈伤组织相比，诱导率提高了60.7％。

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，将花药经初代诱导、胚性愈伤组织诱导和体细胞胚状体分化培养，分别得到胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体，将两者同步接种到增殖培养基上，以子叶形体细胞胚状体看护哺育，使胚性愈伤组织有效快速增殖。伴随着子叶形体细胞胚的萌发，胚性愈伤组织快速增殖。胚性愈伤组织的增长速率是未看护哺育胚性愈伤组织的3.76倍，是利用胚性愈伤组织诱导培养基并看护哺育培养的2.48倍，且同步性很好，皆处于胚性愈伤组织原胚性未分化状态。

进一步的，本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法具体采用纵径位2.81～3.20mm，横径为1.37～1.43mm，纵横比为2.15～2.18，未开、健康的橡胶树雄花作为材料，同时分离选择花粉发育处于单核靠边期的单粒花药作为外植体进行组织培养，为胚性愈伤组织的快速增值提供基础。本发明的外植体材料进行胚性愈伤组织诱导，诱导率达到67.5％，而以整个雄蕊(一个雄蕊约有6～7粒单粒花药)接种的胚性愈伤组织诱导率仅为48.0％，故以单粒花药接种的接种方式比以整个雄蕊接种的方式有效提高40.7％。而在常规的花药外植体接种中，通常没有人为定向诱导胚性愈伤组织这一环节，基本上是通过多次继代后自然选择胚性愈伤组织，得率极低，且继代时间长不利于胚性愈伤组织的胚性维持和后期植株再生。有报道夏花的胚性愈伤组织诱导率42％，本发明与常规选择的材料相比，提高了60.7％。

进一步的，本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，其中橡胶树雄花采用硫磺皂水洗涤，硫磺皂本身具有杀灭细菌、真菌、霉菌、螨虫和寄生虫等功能，因春季是橡胶树白粉病为主的真菌病易发时期，生产上常用325目硫磺粉、90％标准硫磺粉、45％硫磺胶悬剂、50％硫磺悬浮剂等药剂防治白粉病，本发明利用硫磺皂水浸泡花序，专门针对采春花时植株易发白粉病这一特点，可以初步杀灭表面的白粉真菌或潜在性病菌；另外，橡胶树是木本植物，枝条长期暴露空中，灰尖较大，利用淡的硫磺皂水的表面张力特性，有利于去除花序沾染的灰尘等微粒。

附图说明

图1为实施例1中橡胶树雄花、雄蕊及其单粒花药的形态图；其中图1-A为橡胶树雄花的光学照片；图1-B为橡胶树剥去花萼的雄蕊的光学照片；图1-C为剥出的单粒花药的形态图；图1-D为单核靠边期的花粉粒的形态学结构；

图2为实施例1中花药类胚性愈伤组织的诱导和甄选；图2-A为诱导20d的单粒花药脱分化愈伤组织；图2-B为诱导45d质地坚脆、表面具乳黄色球形颗粒的类胚性愈伤组织；

图3为实施例1中在子叶形体细胞胚状体看护哺育下快速增殖的胚性愈伤组织；图3-A为以胚性愈伤组织诱导培养基看护哺育的胚性愈伤组织；图3-B为以增殖培养基但未看护哺育培养的胚性愈伤组织；图3-C为以增殖培养基看护哺育培养的胚性愈伤组织。

具体实施方式

本发明提供了橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-二氯苯氧乙酸0.8～1.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.3mg/L、玉米素0.3～1.0mg/L、噻二唑苯基脲0.04～0.1mg/L、椰子汁体积浓度4％～10％、蔗糖50～80g/L和植物凝胶2.0～2.5g/L；

所述改良MS培养基为硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

本发明中，所述2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)在改良MS培养基的质量浓度优选为1.0mg/L。2,4-D是一种生长素类植物生长调节剂，有类似生长素的作用，对诱导外植体脱分化效果明显，主要作用是诱导愈伤组织的形成。本发明对2,4-D的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的2,4-D的来源即可。本发明实施例中，所述2,4-D购自sigma公司。

本发明中，所述6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)在改良MS培养基的质量浓度优选为0.2mg/L。6-BA是人工合成的细胞分裂素，使用6-BA主要作用是促进细胞分裂和后期再分化，避免单独添加2,4-D愈伤组织诱导相对快速，导致细胞组织结构相对疏松的问题。本发明对6-BA的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的6-BA的来源即可。本发明实施例中，所述6-BA购自sigma公司。

本发明中，所述玉米素(Zt)在改良MS培养基的质量浓度优选为0.5mg/L。在本发明中，Zt具有高效、稳定等特点，在花药胚性愈伤组织中有一定量的内源Zt，故在培养基中添加适量Zt对胚性愈伤组织诱导有很好的促进作用以及维持胚性。本发明对Zt的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的Zt的来源即可。本发明实施例中，所述Zt购自sigma公司。

本发明中，所述噻二唑苯基脲(TDZ)在改良MS培养基的质量浓度优选为0.05mg/L。在本发明中，TDZ具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能，增进胚性细胞的分裂。本发明对TDZ的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的TDZ的来源即可。本发明实施例中，所述TDZ购自sigma公司。

本发明中，所述椰子汁在改良MS培养基的体积浓度优选为5％。所述椰子汁优选为香水椰子汁。所述香水椰子汁优选取自8～10个月嫩果期的天然椰子水。所述香水椰子在8～10个月嫩果期固体胚乳尚未完全形成，大多数的营养成份和活性物质集中在椰子水中。所述椰子汁在制备培养基时是椰子汁在超净工作台上经0.22μm过滤灭菌后加入培养基中摇匀后再分装。椰子汁对于花粉细胞最初分裂的推动，生长素、碳源和渗透压是必要的条件。本发明实施例中，所述椰子汁购自百果园公司。

本发明中，所述蔗糖在改良MS培养基的质量浓度优选为70g/L。在本发明中，蔗糖在植物组织培养中可作为碳源和调节培养基内的渗透压，蔗糖的用量不仅影响着培养物的生长速度和生长量，还影响其代谢水平、次生代谢物的合成以及细胞的形态和发生；过低的蔗糖浓度，花粉愈伤组织诱导率低且在脱分化诱导出愈伤组织后逐渐出现生长停滞现象，可能是由于碳源逐渐耗竭，而过高浓度的蔗糖会抑制愈伤组织的形成。本发明对蔗糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蔗糖的来源即可。本发明实施例中，所述蔗糖购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

本发明中，所述植物凝胶在改良MS培养基的质量浓度优选为2.2g/L。在本发明中，植物凝胶用来凝固培养基。本发明对所述植物凝胶的种类没有限制，采用本领域技术人员所熟知的种类即可。本发明对所述植物凝胶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。本发明实施例中，所述植物凝胶购自sigma公司。

本发明中，所述诱导培养基的pH值优选为5.8。

本发明中，所述改良MS培养基与传统的MS培养基不同之处在于，磷酸二氢钾340mg/L、二水氯化钙800mg/L，硼酸9mg/L，MS有机成分为肌醇100mg/L，甘氨酸1mg/L，盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L，盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L，烟酸1mg/L和生物素VH>

胚性细胞分化程度很低，需要人为地通过外源激素和生长环境的调整，才能提高其诱导率。与正常的MS培养基成份相比，本发明中KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、H₃BO₃添加至原MS培养基的1.4～2倍。外源磷酸盐的充分供给能增强胚性细胞发生各阶段的蛋白质代谢和体外磷酸化，本发明中将KH₂PO₄适当提高至340mg/L，旨在胚性细胞形成过程中，促进多肽类物质的体外磷酸化，调节细胞增值速率；钙是植物生长所必需的大量元素，同时也是植物细胞中重要第二信使，参与胚性细胞形成过程中的各种代谢反应，如外源激素的诱导作用与外源钙的内流密切相关，另钙离子的增加，对胚性愈伤组织的细胞分离至易碎性以及提高胚性细胞膜抗氧化能力；硼元素不是作物体内各种有机物的组成成分,但能加强作物的某些重要生理机能，其中对植物的生殖器官发育具有决定性的影响，充足的硼元素可促进花药可溶性糖、可溶性蛋白的增强、提高花药呼吸强度，从而有利于花药脱分化形成愈伤组织以及胚性细胞的进一步分化和伸长。相对于MS培养基有机成份，本发明中的最大改变是维生素B1的大幅度提高，维生素B1与愈伤组织的产生和生活力有密切关系。VB1在植物体中以硫胺素焦磷酸酯的形式存在，硫胺素焦磷酸是呼吸底物丙酮酸和α-酮戊二酸的脱羧酶的辅酶，也是转酮酶的辅酶，在呼吸和光合过程中起重要作用，因此，添加适量的VB1，在花药脱分化愈伤组织诱导以及进一步的胚性愈伤组织诱导和分化中，组织细胞能维持正常旺盛的呼吸强度，维持正常代谢。此外，在植物离体培养中，由DNA变异引起的体细胞无性系的变异频率与体细胞胚发生的频率成反比，是造成植物组织培养再生率低的原因之一，而硫胺素的胺基所带的正电荷可以直接中和DNA负电荷，从而稳定DNA结构，使胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生频率增加，实现植物细胞全能性表达。

本发明中，所述诱导培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的制备方法即可。

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法，包括以下步骤：

1)从清洗、消毒后的橡胶树雄花中分离花药并以单粒花药接种的方式接种到初代诱导培养基中进行暗培养，诱导出花药脱分化愈伤组织；

2)将所述步骤1)中得到的花药脱分化愈伤组织接种至上述方案提供的诱导培养基上暗培养20～30d，得到胚性愈伤组织；

3)将所述步骤2)得到的胚性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上进行继代培养45～60d，分化出不同发育时期的体细胞胚状体，同时伴随胚性愈伤组织的增殖；

4)选择步骤3)中制备的未分化的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体同步接种于增殖培养基中散射光培养25～30d，得到增殖的胚性愈伤组织。

本发明采集橡胶树雄花进行清洗，得到清洗后的橡胶树雄花。

本发明对所述橡胶树雄花的品种没有特殊限制，采用本领域所熟知的橡胶树的品种即可。本发明实施例中，所述橡胶树的品种为热研7-33-97。

本发明中，所述清洗的方法优选为用清洗液将花序浸没，然后用流水冲洗。所述浸没的时间优选为8～15min。所述冲洗的时间优选为5～10min。清洗液优选为质量浓度为0.15％～0.25％的硫磺皂水。所述硫磺皂本身具有杀灭细菌、真菌、霉菌、螨虫和寄生虫等的特殊功能，因春季是橡胶树白粉病为主的真菌病易发时期，生产上常用325目硫磺粉、90％标准硫磺粉、45％硫磺胶悬剂、50％硫磺悬浮剂等药剂防治白粉病，本发明利用硫磺皂水浸泡花序外植体，专门针对采春花时植株易发白粉病这一特点，可以初步杀灭表面的白粉真菌或潜在性病菌；另外，橡胶树是木本植物，枝条长期暴露空中，灰尖较大，利用硫磺皂溶液的表面张力特性，有利于去除花序沾染的灰尘等微粒，一举两得。硫磺皂液比常规的淡肥皂水或在水里滴洗洁精、稀释84液等清洗液相比不仅清洗效果好还能针对性的去除橡胶树花序中农药残留，杜绝因材料的不洁净影响诱导效果。

得到清洗的花序后，本发明将所述花序选择未开、健康的花序后消毒，得到消毒的花序。

本发明中，所述橡胶树雄花的纵径优选为2.81～3.20mm，所述橡胶树雄花的横径优选为1.37～1.43mm，所述橡胶树雄花的纵横比优选为2.15～2.18；所述花粉粒发育时期优选为单核靠边期。所述橡胶树雄花的花蕾颜色优选为黄绿。

本发明中，所述消毒的方法优选为将选择的花序用纱布包住，用酒精进行表面消毒40s，再用HgCl₂溶液浸泡消毒12min，最后用无菌水冲洗。所述酒精的体积浓度优选为70％～75％。所述HgCl₂溶液的质量浓度优选为0.1～0.15％，更优选为0.12％。所述无菌水冲洗的次数优选为5～6次。

得到消毒的花序后，本发明将所述消毒的花序分离出单粒花药以单粒花药的接种方式接种到初代诱导培养基上暗培养，诱导出花药脱分化愈伤组织。

本发明中，所述分离的方法优选借助解剖镜进行。所述花药的颜色为浅黄色。所述接种量优选每个培养皿28～32粒花药，更优选为30粒花药。所述培养皿的直径优选为9～12cm。

本发明中，所述初代诱导培养基优选以改良的MS培养基为基本培养基，添加2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、(实为液体胚乳椰子水5％)椰子汁体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，所述培养基的pH值为5.8。所述改良MS基本培养为:KH₂PO₄>2·2H₂O>

本发明中，所述暗培养中：白天温度优选为23～27℃，更优选为25℃；夜晚温度优选为21～25℃，更优选为23℃。所述暗培养的湿度优选为78％～82％，更优选为80％。所述暗培养的时间优选为18～23d，更优选为20d。

得到花药脱分化愈伤组织后，本发明将所述的花药脱分化愈伤组织接种至上述技术方案所述的诱导培养基上暗培养20～30d，得到胚性愈伤组织。

本发明中，在诱导培养基上暗培养时期，愈伤组织陆续有胚性愈伤组织的细胞形态发生，分离得到胚性愈伤组织。所述分离的方法优选借助解剖镜用解剖针和镊子挑出。所述胚性愈伤组织的形态优选为质地紧脆、表面具乳黄色球形颗粒。所述暗培养的环境为：白天温度优选为23～27℃，更优选为25℃；夜晚温度优选为21～25℃，更优选为23℃。所述暗培养的湿度优选为78％～82％，更优选为80％。

得到胚性愈伤组织后，本发明将所述胚性愈伤组织接种到体细胞胚诱导培养基上进行继代培养45～60d，分化出不同发育时期的体细胞胚状体，同时伴随胚性愈伤组织的增殖。

本发明中，所述体细胞胚诱导培养基以改良MS为基本培养，添加Kt 0.6～1.0mg/L、NAA0.15～0.20mg/L、ABA0.05～0.10mg/L、亚精胺3～5mg/L、水解酪蛋白200～300mg/L、椰子汁体积浓度为8～12％、活性炭0.08～0.12％、蔗糖60～80g/L和植物凝胶2.0～2.5g/L，更优选为Kt 0.6mg/L、NAA0.15mg/L、6-BA0.05mg/L、亚精胺5mg/L、水解酪蛋白300mg/L、10％椰子汁、活性炭0.10％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.4g/L。所述体细胞胚诱导培养基的pH值为5.6～6.0，更优选为5.8。所述体细胞胚诱导培养基中的椰子汁优选通过香水椰子在10～12个月成熟果期的椰肉榨汁得到。所述改良MS培养基以水为溶剂，包括为硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

本发明中，所述体细胞胚诱导培养基中激动素Kt能延缓胚性愈伤组织的衰老，维持胚性从而避免或延缓其器官分化能力的丧失。细胞分裂素协调配和生物素，可有效促进体细胞胚状体的发生。NAA诱导愈伤组织分化。在形态分化过程中，细胞分裂素/生长素的比值更为重要，本发明中，Kt/NAA为4～5。外源亚精胺能够抑制胚性愈伤组织中蛋白水解酶活性，从而延缓胚性愈伤组织的的衰老，以维持胚性细胞的胚性，利于分化体细胚状体；另外多胺类物质也促进胚性愈伤组织分体细胞胚状体。在暗培养条件下进行体细胞胚状体分化过程中，作为异养的胚性愈伤组织，自身不能或合成有机物有限。水解酪蛋白是多种氨基酸的混合物，在培养基中添加水解酪蛋白可为胚性愈伤组织的分化不断提供有机氮素营养，保证细胞的正常生长和分裂，促进体细胞胚状体的诱导分化。椰子汁含有丰富的蛋白质以及其他养育早期胚胎的营养成份，利于促进体细胞胚状体的分化。胚性愈伤组织在体细胞胚状体诱导期间，细胞新陈代谢旺盛，活性炭的加入能吸附一些有害物质，降低组织受害至褐化死亡机率，另外活性炭对细胞形态发生和器官形成也有良好效应。

本发明中，所述继代培养的时间优选为50～55d。所述继代培养优选为每23～26d继代一次。所述继代培养优选为暗培养。所述暗培养的环境为：白天温度优选为23～27℃，更优选为25℃；夜晚温度优选为21～25℃，更优选为23℃。所述继代培养的湿度优选为78％～82％，更优选为80％。

得到不同发育时期的体细胞胚状体和增殖的胚性愈伤组织后，本发明选择未分化的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体。所述未分化的胚性愈伤组织的形态特点为质地紧实、表面具有球形颗粒。所述子叶形体细胞胚状体优选为生长发育正常，且单片子叶为2～3mm宽。

得到未分化的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体后，本发明将所述未分化的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体同步接种于增殖培养基中散射光培养25～30d，得到增殖的胚性愈伤组织。

本发明中，所述增殖培养基优选以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：水解酪蛋白280～320mg/L、椰汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、质量浓度0.08％～0.12％活性炭和植物凝胶2.0～2.5g/L，更优选为水解酪蛋白300mg/L、体积浓度为10％椰汁、蔗糖70g/L、质量浓度为0.1％活性炭和植物凝胶2.3g/L；所述增殖培养基的pH值为5.6～6.0，更优选为5.8。所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述增殖培养基用来进行传代培养，着重于胚性细胞增殖生长和维持胚性的培养基，是以体细胞胚状体萌发培养基为基础，不添加任何激素，只提供了满足胚性愈伤组织生长的基本培养基，避免外源激素的添加不当引起已诱导出的胚性愈伤组织的分化、消退或丧失，而利用胚性极高的小双子叶胚状体看护培养的培养方式来提高增殖速率，同时添加一些维持胚性的辅助有机物水解酪蛋白和椰子汁。添加活性炭，利于吸收胚状体萌发并看护哺育、胚性愈伤组织快速增殖过程中所排放的一些废弃物质，维持胚性愈伤组织生长微环境的生态洁净。胚性愈伤组织的增殖培养基是以胚状体萌发培养基为基础，能够使同步接入的胚状体萌发，但是不能使胚性愈伤组织分化，而是快速增殖。所述增殖培养基能让胚性愈伤组织增殖的优越条件如下：①用以看护的小双子叶体细胞胚状体，其子叶、胚轴等胚性组织由大量的胚性细胞组成，提供适宜的密度效应，促进低密度胚性愈伤组织细胞的生长、分裂；②双子叶体细胞胚中含有丰富的内源IAA和细胞分裂素CTKs，另萌发过程中，子叶中贮藏蛋白质的降解或分泌的某些活性物质，可为胚性愈伤组织生长提供丰富的氮素等营养；以香水椰子10～12个月成熟果期的固体胚乳(椰肉)乳汁作为有机辅助添加物，里面含有丰富的蛋白质、矿质元素以及多种维生素，以上营养完全满足胚性愈伤组织胚性维持和细胞增殖的需要。

本发明中，所述散射光培养期间白天温度优选为23～27℃，更优选为25℃；夜晚温度优选为21～25℃，更优选为23℃。所述培养的湿度优选为78％～82％，更优选为80％。所述散射光培养的时间优选为28d。所述散射光培养中散射光的提供方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的散射光培养即可。

本发明中，将未分化的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体同步接种于同一培养基的目的是以正常子叶形体细胞胚状体看护哺育，使胚性愈伤组织有效快速增殖。本发明首次采用子叶形胚状体作为看护细胞进行增殖胚性愈伤组织，而目前通常是以子叶形胚状体发育之前的状态(如鱼雷胚、心形胚、球形胚)的胚性愈伤组织来进行看护培养增殖胚性愈伤组织，或以已诱导出芽的子叶来看护培养示分化出芽的子叶，本发明提供的方法比现有技术增殖效果好。

下面结合实施例对本发明提供的橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基及橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。用0.1％的淡肥皂水浸没花序(图1-A)10min，流水冲洗干净。用灭菌小剪刀剪取纵径约2.81～3.20mm，横径约1.37～1.43mm，纵横比2.15～2.18，未开、健康的橡胶树雄花(图1-B)，花粉粒发育时期多数为单核靠边期(图1-D)。用灭菌纱布包好，70～75％酒精表面消毒40s，0.1％HgCl₂浸泡消毒12min，再用无菌水冲洗6次，然后在解剖镜下剥出单粒花药接种到花药愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒花药。

表1橡胶树热研7-33-97品种花粉发育时期与花蕾的外部形态对应关系

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2)单粒花药初代培养

在解剖镜下将单粒花药剥离花丝，接种到花药愈伤组织初代诱导培养基上，暗培养，温度白天25±2℃，晚上23±2℃，湿度80％。初代诱导培养基以改良MS为基本培养基，添加2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、椰汁5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH5.8。培养20d后转接至胚性愈伤组织诱导培养基上。改良MS基本培养为:KH₂PO₄340mg/L、CaCl₂·2H₂O>

3)胚性愈伤组织诱导培养

花药在初代愈伤组织诱导培养基上生长20d后，将诱导出的花药脱分化愈伤组织及时转接至胚性愈伤组织诱导培养基上,暗培养，温度白天25±2℃，晚上23±2℃，湿度80％。胚性愈伤组织诱导培养基以改良MS为基本培养基，添加2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt(玉米素)0.5mg/L、TDZ(噻二唑苯基脲)0.05mg/L、椰汁5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH5.8。培养20～30d后，愈伤组织陆续有类胚性愈伤组织的细胞形态发生(图2-A)借助解剖镜可用解剖针和镊子挑出质地紧脆、表面具乳黄色球形颗粒的类胚性愈伤组织(图2-B)。改良MS基本培养为:KH₂PO₄>2·2H₂O>3BO₃9mg/L，有机成份中，盐酸硫胺素VB₁5.0mg·L^-1、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg·L^-1、烟酸1.0mg·L^-1、甘氨酸1.0mg·L^-1、生物素VH>-1，，其他与MS基本培养基成份一样。

表2花粉发育不同时期的花药愈伤组织诱导率

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

本发明用单粒花药接种的方式在本培养基上，胚性愈伤组织诱导率达67.5％。

对比例1

以实施例1制备的主要单核靠边期的花药为外植体接种至常规诱导培养基上，所述常规诱导培养基为改良的MS+2,4-D 1.0mg/L+Kt 1.0mg/L+0.5～1.0mg/LNAA+体积浓度为5％椰乳+9％蔗糖(w/v)+琼脂粉6.0g/L培养基中，按照实施例1的诱导方法进行暗培养，诱导得到胚性愈伤组织。

采用常规诱导培养基进行诱导培养，获得的胚性愈伤组织的诱导率为42％。本发明提供的诱导培养基比常规技术的胚性愈伤组织的诱导率提高了60.7％。

实施例2

胚性愈伤组织的体细胞胚分化

将挑选出的表面具有球形颗粒的胚性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，每25d继代一次，暗培养，温度白天25℃，晚上23℃，湿度80％。50d后，胚性愈伤组织陆续分化出不同发育时期的体细胞胚状体，同时伴随胚性愈伤组织的增殖。体细胞胚分化培养基以改良MS为基本培养，添加Kt 0.6mg/L、NAA 0.15mg/L、6-BA 0.05mg/L、亚精胺5mg/L、水解酪蛋白300mg/L、10％椰汁、活性炭0.10％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.4g/L，培养基的pH值为5.8。改良MS基本培养为:KH₂PO₄226mg/L、NH₄NO₃1100mg/L、KNO₃1267mg/L、CaCl₂·2H₂O>4·7H₂O>3BO₃9mg/L，有机成份中，盐酸硫胺素VB₁5.0mg·L^-1、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg·L^-1、烟酸1.0mg·L^-1、甘氨酸1.0mg·L^-1、生物素VH>-1，其他与MS基本培养基成份一样。

对比例2

采用常规分化培养基培养基(MS+Kt14.0μmol/L、NAA0.1μmol/L、6-BA2.2μmol/L、GA31.4μmol/L、3.8μmol/LABA、204.5mmol/L蔗糖、2.2g/L植物凝胶；pH值为5.8)替换实施例2中胚细胞分化培养基，在28℃条件下暗培养50d，得到分化的初生子叶胚。经统计，每块愈伤组织平均产生0.6个初生子叶胚。

而以热研7-33-97品种花蕾为外植体，采用本发明所述的单粒花药接种方式、分化培养基和培养方式，经筛选的胚性愈伤组织的分化率达79.4％，平均每块愈伤组织体细胞胚分化数目1.6个，而整蕊花药接种花药脱分化愈伤组织的分化率为44.1％，单粒花药接种比整蕊花药接种的分化率提高了80％(平均每块愈伤组织体细胞胚分化数为0.9个)。同时与常规分化培养基的分化率相比，分化率提高了167％。

实施例3

胚性愈伤组织的快速增殖

借助解剖镜，从正在分化的胚性愈伤组织中挑出尚未分化的质地紧实、表面具有球形颗粒的胚性愈伤组织，以及生长发育正常的子叶形体细胞胚状体(单片子叶约2～3mm宽)一个，一起接种到增殖培养基上，以正常子叶形体细胞胚状体看护哺育，使胚性愈伤组织有效快速增殖。室内自然散射光培养25～30d，温度白天25±2℃，晚上23±2℃，湿度80％。胚状体萌发培养基以改良MS为基本培养基，添加水解酪蛋白300mg/L、10％椰汁、蔗糖70g/L、0.1％活性炭和植物凝胶2.3g/L，pH5.8，不添加任何激素。

将上述挑出尚未分化的质地紧实、表面具有球形颗粒的胚性愈伤组织接入增殖培养基上，并且不接入子叶形体细胞胚的实验为对照组1；以挑出尚未分化的质地紧实、表面具有球形颗粒的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚同步接入胚性愈伤组织诱导培养基的实验为对照2，将对照组1和对照组2按照上述技术方案进行培养，得到胚性愈伤组织。

经过增殖培养基培养，结果表明，伴随着子叶形体细胞胚的萌发，胚性愈伤组织快速增殖，其增长速率是对照组1的3.76倍，是对照组2的2.48倍，且增殖的胚性愈伤组织同步性很好，皆处于胚性愈伤组织原胚性未分化状态。

对比例3

选择热研7-33-97品种的花蕾，花蕾的发育时期见表3，以此为外植体按照实施例1的方案进行清洗、消毒、脱分化培养和诱导培养，得到胚性愈伤组织，并统计脱分化愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率。

表3橡胶树热研7-33-97品种花粉发育时期与花蕾的外部形态对应关系

统计结果见表4。

表4不同发育时期的花蕾对应脱分化愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率

由表4可知，纵径2.41～2.60mm的花蕾作为外植体，以整个雄花蕊接种，胚性愈伤组织的诱导率为33.23％，而以单粒花药接种的，胚性愈伤组织诱导率为43.17％，提高了29.91％；纵径3.41～3.60mm的花蕾作为外植体，以整个雄花蕊接种，胚性愈伤组织的诱导率为27.43％，而以单粒花药接种的，胚性愈伤组织诱导率为33.47％，提高了22.02％。

实施例4

据前人报导，以热研88-13花蕾为外植体，利用常规方法剥出花蕾中的花药，接种到花药易碎胚性愈伤组织诱导培养基(改良的Ms培养基并添加2.0mg/L2,4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/LKT、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5％(v/v)椰汁、2.0g/L植物凝胶)培养50d，诱导出初生愈伤组织后，再将生长状态良好的初生愈伤组织转入到新鲜的培养基上继代培养，每10天继代一次。经多次选择继代，约3个月，才能诱导出颜色鲜黄、结构疏松、颗粒状的花药易碎胚性愈伤组织。初代脱分化愈伤组织诱导率80～90％，胚性愈伤组织诱导率未详细报道。脱分化愈伤组织继代3～4次后，以7～9d继代一次进行悬浮培养或20～30d继代一次进行固体培养增殖，增殖系数3～5倍，但胚性细胞参差不齐，且继代几个月后，部分胚性细胞系颜色逐渐变浅，细胞内含物少，甚至衰亡。

本发明利用热研88-13花蕾为外植体，以单粒花药接种，20～30d脱分化愈伤组织诱导率93.6％，20～30d，即可诱导出具圆形颗粒状的胚性愈伤组织，诱导率62～68％，以子叶胚同步接种到增殖培养基上，其增长速率是对照组1(不接入子叶形体细胞胚的实验)的3.34倍，是对照组2(胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚同步接入胚性愈伤组织诱导培养基的实验)的2.15倍，且增殖的胚性愈伤组织同步性很好，皆处于胚性愈伤组织原胚性未分化状态。这说明本发明提供的诱导培养基以及增殖培养方法不受橡胶树品种的限制，诱导率和增殖速率较为理想。与常规方法相比，本发明在胚性愈伤组织的诱导和增殖方面具有较大优势，为体外培养以及遗传材料的获得提供保障。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。