一株降解PAEs的植物内生菌及在修复PAEs污染土壤中的应用

摘要

本发明公开一株降解PAEs的植物内生菌及在修复PAEs污染土壤中的应用。所述菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3，于2017年06月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。利用YJB3菌液通过根际土壤接种、喷雾处理或种子浸菌的方式，使内生菌定殖于植物根际或体内，或直接加菌至PAEs污染土壤中，均可提高土壤邻苯二甲酸酯污染修复效率。本发明操作简单、安全、经济，对土壤环境不引入二次污染，能够规避农产品污染风险，对于高效利用区域性中低浓度污染土壤生产安全农产品并实现“边生产、边修复”具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于有机污染土壤修复领域，具体涉及一株降解邻苯二甲酸酯(PAEs)的植物内生菌，并能够单独地或联合植物修复PAEs污染土壤的应用方法。

背景技术

农药、化肥和农膜等农资产品不合理使用以及工业“三废”排放等活动不断释放大量的PAEs类有机污染物，造成农田土壤污染日益严重。污染土壤中的PAEs被农作物吸收累积，严重威胁农产品质量安全。PAEs是一类环境激素类污染物，具有内分泌干扰、生殖发育毒性、肝毒性和“三致”效应。日常膳食摄入含有PAEs的农产品导致长期低剂量暴露，严重危及人类健康。土壤修复是消除农田土壤PAEs污染最直接的方式，相比于传统的土壤修复技术如客土法、化学淋洗、气提以及热处理等物理、化学方法，生物修复具有成本低、安全有效、环境友好等特点。生物修复方法主要包括微生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复等。具有高效降解PAEs等有机污染物的功能微生物，可以从植物体外的各种环境中获得，也可以从植物体内分离获得，后者研究还很少，但在应用上与前者相比有很多优势，比如，功能植物内生菌既能单独地，也能联合植物一起降解污染土壤中PAEs等有机污染物，还能够协助宿主植物降低PAEs等有机污染物在体内的累积和引起的毒害效应，同时促进宿主植物的生长。这是因为内生菌通过植物叶片气孔、茎干皮孔和根系伤口等途径进入植物体内，然后定殖在植物各个器官的组织内部及细胞间隙。内生菌与植物宿主建立了良好的互利共生关系，构成植物微生态系统中重要组成部分，占据特殊的生态位。

值得引起注意的是，可以利用植物内生菌接种于作物根际或体内，降低根际土壤中PAEs等有机污染物污染，降低作物PAEs累积，有效规避作物PAEs污染风险，使作物体内特别是可食用部位污染物含量低于食品卫生安全限量标准，进而保证农产品质量安全。然而据我们所知，目前还没有专利和文献报道植物内生菌单独地应用或与植物联合应用于修复PAEs污染土壤并降低作物吸收累积PAEs，以高效利用污染土壤生产安全农产品，实现“边生产，边修复”。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株降解PAEs的植物内生菌。

本发明的另一目的在于提供上述降解PAEs的植物内生菌的应用。

本发明提供了一株具有高效降解PAEs功能的植物内生菌，并且单独或联合植物修复PAEs污染土壤，促进土壤中PAEs降解和降低作物吸收累积PAEs的应用。本发明操作简单、安全、成本低，对土壤环境不产生二次污染，能够增加作物生物量，有效修复PAEs污染土壤，降低作物对PAEs的吸收累积，规避作物污染风险，保障农产品质量安全。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株降解PAEs的植物内生菌，菌种命名为Bacillus megateriumYJB3，通过梯度驯化和富集，从植物体内分离筛选出。

所述的降解PAEs的植物内生菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3，其保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。

所述的植物内生菌的分离筛选包括如下步骤：

(1)植物材料表面消毒步骤：将采集的新鲜植物材料样品用无菌水清洗后，用无菌剪刀剪成长1cm的小段，超净台内按照下列程序进行表面灭菌，1％～3％H₂O₂漂洗1～4min，无菌水冲洗2～4次，70％(v/v)酒精漂洗2～5min，无菌水冲洗2～4次，3～5％NaClO溶液漂洗2～5min，无菌水冲洗2～4次；

(2)植物材料表面消毒效果的检验：分别取最后一次冲洗植物材料的无菌水100μL和经表面消毒的植物样品于LB固体平板30℃培养24h后，无微生物长出，表明植物材料表面灭菌彻底，可进行植物内生菌分离筛选；

(3)植物内生菌的富集和驯化：将表面消毒彻底的植物材料置于无菌研钵内，加入0.1～2g无菌石英砂和5～10mL无菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.0～7.5)溶液，然后研磨粉碎至匀浆，取1～5mL上清液接种于100～150mL含PAEs为唯一碳源的无机盐液体培养基中，在30℃，120～150rpm转速条件下，避光摇床培养，每5～7天为一个周期，逐步提高PAEs初始浓度，从50mg/L至1000mg/L；

(4)植物内生菌分离筛选：驯化结束后，将上述培养菌液梯度稀释至10^-5～10^-7涂布于含有500～1000mg/L>

所述步骤(2)中植物材料表面消毒步骤还可以是：将采集的新鲜植物材料样品用无菌水清洗后，用无菌剪刀剪成长1cm的小段，将植物材料完全浸没与装有150mL～200mL无菌水的带塞三角烧瓶或带盖烧杯内，超声波消毒20min，工作频率为20KHz、功率为150W。

所述无机盐培养基(g·L^-1)：K₂HPO₄>2PO₄>2SO₄>2>2>2MoO₄·2H₂O>3>3>2·2H₂O>

所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3形态和生理生化特征为：菌落平滑，淡黄色，边缘整齐，菌体易挑起，革兰氏阳性菌，菌体长杆状，1.5～2.0μm宽，5.2～7.8μm长；好氧，触酶反应阳性，糖发酵阳性，淀粉水解实验阳性，甲基红试验阳性，脲酶实验阳性，柠檬酸盐实验和H₂S实验阴性，Voges-Proskauer实验阴性，吲哚实验阴性，明胶水解实验阴性。

所述的邻苯二甲酸酯(PAEs)为邻苯二甲酸二乙酯(DEP)或/和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)或/和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和/或邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)和/或邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和/或邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)。

所述的降解PAEs的植物内生菌在单独或联合植物修复PAEs污染土壤中的应用。

所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3菌液制备方法为：取斜面保藏B.megaterium YJB3菌种转接于1000mL LB液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养7～9h后，3000r/min离心收集菌体，然后悬浮于PBS溶液中，稀释至浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的菌悬液并补充0.5～1.5g/L的醋酸钠为起始碳源。

将所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3按照接种浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的菌悬液直接加入受PAEs污染的土壤介质中，搅拌均匀后并通气。

将所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3按照浓度为10⁶～10⁹CFU/mL接种量为1～10mL接种于植物根际土壤或接种于植物体内与植物联合修复PAEs污染土壤。

所述的植物内生菌的接种于植物体内的方法可以为：取颗粒饱满的植物种子，首先用5％次氯酸钠浸种消毒15～20min，然后用无菌去离子水冲洗2～3次，浸入含有浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～180min。

所述的植物内生菌的接种于植物体内的方法可以为：采用喷雾或涂抹方式将浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液接种于植物叶面。

所述的植物内生菌的接种于植物体内的方法可以为：将植物幼苗根系浸入浓度为10⁶～10⁹CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～90min。

所述的植物可以为用于土壤植物修复的东南景天、苜蓿、黑麦草、龙葵等或者水稻、玉米、菜心、番茄等作物。上述植物的种子均可从市场上购买得到。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明提供通过梯度驯化和富集，从植物体内分离筛选出一株降解PAEs的植物内生菌Bacillus megaterium YJB3。利用植物内生菌B.megaterium YJB3菌液通过根际土壤接种、喷雾处理或种子浸菌的方式，使内生菌定殖于植物根际或体内，或直接加菌至PAEs污染土壤中，均可提高土壤邻苯二甲酸酯污染修复效率，并降低作物吸收累积PAEs。本发明操作简单、安全、经济，对土壤环境不引入二次污染，能够规避农产品污染风险，对于高效利用区域性中低浓度污染土壤生产出安全农产品并实现“边生产、边修复”具有重要意义。

附图说明

图1是巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3菌落和细胞形态特征。

图2是巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3 16S rDNA PCR结果。

图3是巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3系统发育树。

图4是土培环境中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3对菜心根际微域内PAEs消减行为的影响；其中，S0指根系生长区，S0-1指距离根表面1mm距离的根际区；S1-3指距离根表面1-3mm的根际区；S3-5指距离根表面3-5mm的根际区。

图5是土培环境中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3对菜心吸收累积PAEs的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

从人工湿地采集植物样品，立即进行内生菌分离筛选试验。采用常规的内生菌分离方法。将采集的新鲜植物材料样品用无菌水清洗后，用无菌剪刀剪成长1cm的小段，超净台内按照下列程序进行表面灭菌，3％H₂O₂漂洗2.5min，无菌水冲洗4次，70％酒精漂洗3次，无菌水冲洗3次，3％NaClO溶液漂洗5min，无菌水冲洗3次，分别取最后一次冲洗植物材料的无菌水100μL和经表面消毒的植物样品，移入LB固体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl>-5涂布于含有500mg/L的DBP无机盐固体培养基平板上，30℃恒温培养，待平板长出菌落后，划线法纯化获得目标菌株YJB3，转接于LB试管斜面，4℃冰箱保存。

实施例2

从人工湿地采集植物样品，立即进行内生菌分离筛选试验。将采集的新鲜植物材料样品用无菌水清洗后，用无菌剪刀剪成长1cm的小段，将植物材料完全浸没于装有150mL～200mL无菌水的带塞三角烧瓶或带盖烧杯内，超声波消毒25min，工作频率为20KHz、功率为150W；将该植物材料置于无菌研钵内，加入2g无菌石英砂和10mL无菌磷酸缓冲液(pH7.2)，研磨粉碎至匀浆，取上清液0.5mL，接种于100mL含有DBP为唯一碳源的无机盐液体培养基中，30℃，150rpm，避光摇床培养，每7天为一个周期，逐步提高DBP的初始浓度，100mg/L至800mg/L梯度驯化；驯化结束后，将上述培养液梯度稀释至10^-6涂布于含有1000mg/L的DBP无机盐固体培养基平板上，30℃恒温培养，待平板长出菌落后，划线法纯化获得目标菌株YJB3，转接于LB试管斜面，4℃冰箱保存。

实施例3

(1)菌株形态特征鉴定：将菌株YJB3划线接种于LB固体培养基中，平板倒置恒温培养箱，30℃恒温培养12～18h，观察菌落形态，菌落平滑，淡黄色，边缘整齐，易挑起；对菌株进行革兰氏染色，革兰氏阳性菌，利用扫描电子显微镜观察，该菌株为长杆菌，1.5～2.0μm宽，5.2～7.8μm长，见图1。

(2)菌株相关生理生化试验

分别对菌株YJB3培养物进行甲基红实验、脲酶实验、触酶实验、糖发酵实验、淀粉水解实验、柠檬酸盐实验、H₂S实验、Voges-Proskauer实验、吲哚实验、明胶水解实验等一系列相关生理生化试验，详细结果见表1。

表1菌株相关生理生化试验结果

生理生化实验结果甲基红实验+好氧生长+触酶反应+糖发酵实验+淀粉水解实验+脲酶实验+柠檬酸盐实验-H₂S实验-Voges-Proskauer实验-吲哚实验-明胶水解实验-

(3)菌株16S rDNA分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物(27F，1492R)扩增菌株的16S rDNA片段，送至上海生工测序，通过1％琼脂糖凝胶电泳发现产物在约1100bp处出现一条特异性条带，结果如图2所示，序列如SEQ ID NO：1所示。将得到的细菌16S rDNA序列与NCBI数据库进行Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)同源性比对，与数据库中已知细菌Bacillus megaterium的16S rDNA序列的相似性达到了99％，构建的系统发育树如图3所示，结合形态和生理生化特征，将该菌株鉴定为Bacillus megaterium。菌种命名为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3。

所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。

实施例4

设定土壤中DBP浓度为100mg·kg^–1，取部分土壤(约5kg)添加DBP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megateriumYJB3菌种转接于100mL>8CFU/mL，并补充0.5g/L的醋酸钠为起始碳源。待菜心幼苗生长状况稳定且有新叶长出后，以10mL接种量将菌悬液采用灌根法接种于菜心根际。结果表明，菜心绿宝(LB)根际土壤中DBP消减率平均提高了54.2％(图4)，其地上部DBP含量降低了45.2％，根部DBP含量降低了40.6％(图5)，菜心华冠(HG)根际土壤中DBP消减率平均提高了50.6％(图4)，其地上部DBP含量降低了43.6％，根部DBP含量降低了32.7％(图5)。

实施例5

设定土壤中DEHP浓度为100mg·kg^–1，以不添加DEHP的土壤对照。取部分土壤(约5kg)添加DEHP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megaterium YJB3菌种转接于100mL>7CFU/mL，并补充1.0g/L的醋酸钠为起始碳源。待番茄幼苗生长状况稳定且有新叶长出后，以10mL接种量采用喷雾处理，接种于番茄地上部。相对于未接菌处理，接种菌株B.megateriumYJB3使番茄根际土壤中DEHP消减率平均提高了24.1％。

实施例6

设定土壤中DEP浓度为100mg·kg^–1，以不添加DEP的土壤对照。取部分土壤(约5kg)添加DEP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megaterium>8CFU/mL，并补充1.5g/L的醋酸钠为起始碳源。取颗粒饱满的植物种子，首先用5％次氯酸钠浸种消毒20min，然后用无菌去离子水冲洗3次，浸入含有所述浓度为10⁸CFU/mL的内生菌培养液中180min。温室内栽培55天，相对于未接菌处理，接种菌株B.megateriumYJB3使黑麦草根际土壤中DEP消减率平均提高了50.4％。

实施例7

设定土壤中DMP浓度为100mg·kg^–1，以不添加DMP的土壤为对照，取部分土壤(约5kg)添加DMP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megaterium>6CFU/mL，并补充0.8g/L的醋酸钠为起始碳源。将水稻幼苗根系浸入菌液悬液60min，然后移栽DMP污染土壤中，温室内栽培50d，相对于未接菌处理，接种菌株B.megateriumYJB3使根际土壤中DMP降解率平均提高了43.3％。

实施例8

设定土壤中DBP浓度为100mg·kg^–1，以不添加DBP的土壤为对照，取部分土壤(约5kg)添加DBP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megaterium>8CFU/mL，并补充0.8g/L的醋酸钠为起始碳源，将该菌悬液直接拌入土壤中，搅拌均匀并通气。土壤中DBP降解率为35.2％，而未加菌土壤中DBP降解率仅为11.3％。土壤中直接加入菌株B.megaterium>

实施例9

设定土壤中DnOP浓度为100mg·kg^–1，以不添加DnOP的土壤为对照，取部分土壤(约5kg)添加DnOP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megateriumYJB3菌种转接于100mL>8CFU/mL，并补充0.8g/L的醋酸钠为起始碳源。将该菌悬液直接接入具有3～4片真叶的黑麦草根际土壤中，温室内培育55天，相相对于未接菌处理，接种菌株B.megateriumYJB3使植物根际土壤中DnOP降解率提高了23.5％。

实施例10

设定土壤中BBP浓度为100mg·kg^–1，以不添加BBP的土壤对照。取部分土壤(约5kg)添加BBP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megaterium YJB3菌种转接于100mL>9CFU/mL，并补充1.0g/L的醋酸钠为起始碳源。待玉米幼苗生长状况稳定且有3～4片叶长出后，以10mL接种量采用喷雾处理，接种于叶片。温室内栽培45天，与未接菌处理比较，接菌B.megaterium>

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一株降解PAEs的植物内生菌及在修复PAEs污染土壤中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1096

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 巨大芽孢杆菌（B.megaterium）YJB3的16S rDNA核苷酸序列

<400> 1

gggcatgtgc gcggcgtgct atacatgcca agtcgagcga tactgataga agcttgcaac 60

tatgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtccgcaa cgctgcctgt aagactggga 120

taacttcggg ataccgaagc taataccgga taggatcttc tccttcatgg gagatgattg 180

aaagatggaa tcggctatca cttacagatc gcgccgcggt gcattagcta gttggtgagg 240

ttacggctca cctaggcaac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg cgacactggg 300

actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 360

aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgcgtcgta taactctgtt 420

gttagggaag aacaagtacg agagtaactg cttgtacctt gacggtacct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa 540

ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtt tcataagtct gatgtgaaag cgcacggctc 600

aaccgtggag ggtcaatgga aactggggaa cttgagtgct gaagagaaaa gcggaattcc 660

acgtgtagcg gtgaattgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcggctttta 720

ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgtaagc gtggggagca aacacgatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgttaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct atagtgctgc 840

agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900

ttgacggggg ccggcacaag cggtggagca tgtggattaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960

cataccaggt cttgacatcc tctgacactc tagagataga gcgttcggct tcgggggaca 1020

gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt ggagatgaag ggttaagtcc 1080

cgctacgagc cccgaa 1096