组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备防治腹膜透析后腹膜纤维化的药物中的用途

摘要

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备防治腹膜透析后腹膜纤维化的药物中的用途。本发明使用Tubastatin A（TA）抑制HDAC6，可减轻高糖腹膜透析液刺激的腹膜病理学改变，改善腹膜功能。本发明的机制包括抑制纤维化信号通路，抑制炎症信号通路和炎症因子的释放，减少血管新生。因此，HDAC6可能成为防治腹膜纤维化的重要靶点。

说明书

技术领域

本发明属于药物学领域，涉及一种组蛋白去乙酰化酶HDAC6，具体来说是一种组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备防治腹膜透析后腹膜纤维化的药物中的用途。

背景技术

腹膜透析是一种重要的终末期肾脏病患者的替代疗法，被肾衰患者广泛接受。然而长时间的腹膜透析，因腹膜长期接触生物不相容性的腹透液及尿毒症毒素刺激等因素，可诱导腹膜纤维化，迫使透析患者被迫退出腹膜透析。因此，深入研究和探索新的腹膜纤维化防治药物对于改善腹膜透析患者长期生活和生存质量有着非常重要的意义。

腹膜是一层薄层透明膜，覆盖了腹壁的内表面（壁层腹膜，10-15%）和大多数的内脏器官（脏层腹膜，85-90%），主要由腹膜单层间皮细胞层及间皮下区域组成。腹膜间皮下区域包括胶原、粘多糖、纤维母细胞、毛细血管及淋巴管等结构。间皮细胞具有上皮细胞的一些形态功能特性，由其下的基底膜支撑，阻止其与间皮下的实质细胞接触。一旦腹膜受损，基底膜破坏，实质细胞中的纤维母细胞游离至上层，若间皮细胞受损，亦可分泌大量促炎、致纤维化因子，即可触发腹膜纤维化。

腹膜纤维化是一个复杂的病理过程，研究发现炎症反应、肾素血管紧张素醛固酮系统（RAS）激活、腹膜间皮细胞转分化EMT、TGF-β/Smad等致纤维化信号通路激活等机制调控腹膜纤维化发生发展。

国内外研究表明，组蛋白去乙酰化酶（histone deacethlases, HDACs）与组织和脏器纤维化有关。HDACs在调节基因转录中发挥重要作用。

最近的研究表明，HDACs的活性也与一些以纤维化为特征的慢性疾病的发生和进展有关，如慢性肾脏疾病、特发性肺纤维化IPF、心肌纤维化、系统硬化症、原发性骨髓纤维化和囊性纤维化。活化的成纤维细胞，呈现出特定的表型改变，包括α-SMA的表达，细胞外基质的合成增多（细胞外基质包括胶原蛋白和纤维连接蛋白）。在肾脏和肺发生纤维化的过程中，相当一部分的肌成纤维细胞是由上皮细胞通过上皮间质转化而来的。转化生长因子家族成员作为最有力的诱导因子之一，可以在各种生理和病理环境中诱导上皮间质转化的发生。Glenisson通过研究HDACs在TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化中的作用发现，沉默HDAC4、HDAC6(Histone deacethlases 6)和HDAC8的表达，可以降低TGF-β1诱导的α-SMA的表达。

大量证据表明HDAC6活化参与多个器官的纤维化。Hui T等人发现HDAC6在心肌纤维细胞和成纤维细胞中表达上调，抑制HDAC6活性后心肌纤维细胞的增殖也会受到抑制。此外，Sin Young Choi等也发现HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A可以通过抑制TGF-β诱导的组蛋白乙酰化或Smad2/3磷酸化，减少I型胶原蛋白的生成，进而减轻高血压引起的肾脏磷酸化。最后，Xin Cheng等人通过腹腔注射HDAC6选择性抑制剂，降低腹水中TNF-α和IL-6的水平,减轻腹膜炎症这些证据都强烈的提示HDAC6参与多个器官的纤维化发病机制。虽然有报道表明HDAC6的药理学抑制可抑制血管紧张素引起的肾间质纤维化，HDAC6是否参与了腹膜纤维化的发展未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备治疗腹膜纤维化的药物中的用途，所述的这种组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备治疗腹膜纤维化的药物中的用途解决了现有技术中没有合适药物，用于治疗由于长时间的腹膜透析诱导腹膜纤维化的技术问题。

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂在制备防治腹膜透析后腹膜纤维化的药物中的用途。

进一步的，所述的组蛋白去乙酰化酶HDAC6的抑制剂为Tubastatin A。

我们使用HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A（TA），探讨靶向抑制HDAC6对高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化的影响和作用机制。

腹膜纤维化是临床常见的腹膜透析的并发症，腹膜透析患者因腹膜纤维化导致超滤衰竭而被迫退出腹透，目前仍缺乏行之有效的治疗方式，探索腹膜纤维化的发病机制和治疗靶点至关重要。

腹膜纤维化的病理生理学与腹膜间皮细胞损伤、上皮间充质细胞转分化和分泌大量促炎、致纤维化因子紧密相关，其中腹膜的完整性受损起着重要作用。本发明的研究显示在活化的肾间质成纤维化细胞中HDAC表达显著增加，应用HDAC6抑制剂可通过上调乙酰化信号转录转导因子3（Acetyl-STAT3），下调磷酸化STAT3的表达，抑制肾间质成纤维细胞的增殖。HDAC6参与多个器官的纤维化，包括心肌纤维化、肾间质纤维化、肺纤维化等，同时也参与了腹膜炎症的发生发展。

HDAC抑制剂作为癌症相关疾病的治疗药物具有巨大潜力。本发明的工作证实HDACs参与包括肾纤维化，心肌纤维化，腹膜炎在内的多种疾病的发病机制。本发明的研究表明，组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化修饰可导致肾间质成纤维细胞的活化从而促进肾间质纤维化的发生和发展，提示HDAC抑制剂具有抗纤维化作用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明使用TA抑制HDAC6，可减轻高糖腹膜透析液刺激的腹膜病理学改变，改善腹膜功能。机制包括抑制纤维化信号通路，抑制炎症信号通路和炎症因子的释放，减少血管新生。因此，HDAC6可成为防治腹膜纤维化的重要靶点。

附图说明

图1显示TA抑制TGF-β诱导的腹膜间皮细胞转分化。

图2显示HDAC6 siRNA抑制腹膜间皮细胞转分化。

图3显示HDAC6与腹膜间皮细胞中TGF-β/Smad3信号通路的活化有关。

图4显示抑制HDAC6活性可抑制腹膜间皮细胞中EGFR和STAT3的磷酸化。

图5显示TA抑制高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化的发生。

图6显示TA特异性抑制HDAC6表达并上调乙酰化组蛋白H3和acytyl α-tubulin水平。

图7显示TA显著抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞活化和细胞外基质蛋白沉积。

图8显示TA靶向抑制HDAC6可阻断高糖腹透液诱导的腹膜TGF-β1/Smad3信号通路的活化。

图9显示TA可阻断高糖腹透液诱导的腹膜纤维化中EGFR和STAT3通路活化。

图10显示TA可阻断高糖腹透液诱导腹膜纤维化中NF-κB通路活化并抑制炎症因子的表达。

图11显示TA显著抑制高糖腹透液诱导腹膜纤维化中巨噬细胞浸润。

图12显示TA抑制4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中VEGF表达，减少了新生血管的形成。

具体实施方式

实施例1 材料和方法

1）p-STAT3,STAT3，p-Smad3,Smad3，p-NF-κBp65，NF-κBp65，p-EGFR,EGFR, HistoneH3, Acetyl-Histone H3和 HDAC6抗体均购于cell signaling Technology公司。collagenI (A2), TGF-β, CD68, EGFR, VEGF, CD31和GAPDH抗体购于Santa Cruz公司。TNF-α, IL-1β, MCP-1, IL-6和TGF-β1（ELISA）试剂盒购于Roche Life Science。Tubastatin A购于Selleckchem公司。α-SMA抗体和其他试剂购于Sigma公司。

腹膜纤维化模型和治疗分组

根据文献报道方法建立小鼠腹膜纤维化模型。小鼠随机分为四组，空白对照组腹腔注射0.9%生理盐水3ml/只，每日一次，连续4周。TA组腹腔注射TA 70mg/kg，每日一次，连续四周。模型组腹腔注射4.25%腹膜透析液3ml/只，每日一次，连续四周。防治组腹腔注射Tub A70mg/kg，每日一次，连续四周，同时腹腔注射4.25%腹膜透析液3ml/只，每日一次，连续四周。四周后处死小鼠，收集腹膜标本。所有动物实验均遵守中国实验动物管理和使用条例。

2）组织学和免疫荧光染色

腹膜组织经过4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。组织切片（3μm）进行Masson染色。每块腹膜组织均观察10个视野，测量5个不同位点腹膜组织厚度，其平均数值作为腹膜厚度的值。免疫荧光染色操作方法如前所述。一抗浓度α-SMA 1：50，HDAC6 1：50，荧光连接二抗浓度1：200。DAPI染色根据操作说明进行。

3）细胞培养及处理

人腹膜间皮细胞（HMrSV5）用含5%胎牛血清，0.5%青霉素和链霉素的DMEM/Highglucose培养液培养，培养条件为37°C，5%二氧化碳和95%空气。为研究TA的影响，细胞在含0.5%胎牛血清的高糖培养基饥饿24小时后，加入TA预处理1小时后，再加入TGF-β刺激，继续培养24小时。

4）Western blot

腹膜组织提取蛋白，按照文献方法操作。Western blot结果用Image J软件进行灰度分析。

5）统计分析

使用均值±SEM表示数据。多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两组间数据比较用T检验。以P<0.05为具有统计学意义。

实施例2 TA抑制TGF-β诱导的腹膜间皮细胞转分化（EMT）

有报道表明HDAC6活化发生在肾间质纤维化的过程中。然而，HDAC6在腹膜纤维化中的作用尚不清楚。第一步我们要了解HDAC6是否参与了腹膜纤维化的过程，我们研究在腹膜间皮细胞中TA对于TGF-β诱导的腹膜间皮细胞纤维化的影响。加入TGF-β的细胞α-SMA和collagenⅠ这两种EMT生物标志物都显著升高，同时HDAC6的表达也有所升高，acetyl-histone H3表达下降。相反的，在TA干预组，抑制TGF-β诱导的α-SMA，collagenⅠ和HDAC6的升高，同时，上调了acetyl-histone H3表达，且在20μM浓度时达到最大（图1A-F）。因为histone H3是细胞核蛋白，我们的研究表明HDAC6作用于细胞核及其组成成分，并且与腹膜间皮细胞转分化密切相关。

实施例3 HDAC6 siRNA抑制腹膜间皮细胞转分化

为证明TA对于上皮间质细胞转分化的抑制作用，我们使用HDAC6 siRNA特异性敲除腹膜间皮细胞中的HDAC6。图2A-D表明通过特定的siRNA减少HDAC6的表达，同样可以降低TGF-β诱导的α-SMA和collagenⅠ。此外，下调HDAC6水平，还可以在不改变总的histone H3水平的情况下增加acetyle histone H3的表达（图2E和F）。这些结果表明HDAC6在介导腹膜间皮细胞发生上皮间质细胞转分化过程中其重要作用。

实施例4 HDAC6与腹膜间皮细胞中TGF-β/Smad3信号通路的活化有关

TGF-β/Smad3信号通路是公认的腹膜间皮细胞发生EMT的生物标志物。因此我们研究了HDAC6是否通过该信号通路调控EMT。如图3（A-D）所示，TA剂量依赖性抑制Smad3的磷酸化且不改变总的Smad3的表达，该抑制作用在20μM时达到最大。同样的，敲除HDAC6后Smad3的磷酸化也受到了抑制。这些结果表明HDAC6在TGF-β/Smad3信号通路活化中起到了关键性作用。

实施例5 抑制HDAC6活性可抑制腹膜间皮细胞中EGFR和STAT3的磷酸化

我们近期研究发现EGFR介导了肾脏纤维化和腹膜纤维化的发生与发展，且STAT3在EGFR下游发挥作用。为了证明HDAC6是否在EMT过程中调控EGFR的活化，我们检测了TA和HDAC6 siRNA 对于EGFR和STAT3磷酸化的影响。图4 （A-H）表明，TGF-β可诱导EGFR和STAT3发生磷酸化，TA可抑制磷酸化的发生，且在20μM时可抑制磷酸化至基础水平。敲除HDAC6后也同样抑制EGFR和STAT3的磷酸化。值得注意的是，TGF-β引起总的EGFR水平发生改变，敲除HDAC6后EGFR表达减低而总STAT3水平不发生改变（图4A和E）。这些结果表明HDAC6同样在EGFR和STAT3的活化过程中其重要作用。

实施例6 TA抑制高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化的发生

高糖腹膜透析液刺激腹膜发生硬化是腹膜纤维化发生的主要因素。在前面所述的HDAC6在腹膜间皮细胞EMT过程中的重要作用的基础上，我们进一步探讨了抑制HDAC6对于体内腹膜纤维化的影响。图5 (A-C)表明，连续28天，每天小鼠腹腔注射4.25%的高糖腹透液3ml可成功建立腹膜纤维化的动物模型，Masson染色可见该模型腹膜下区域明显增厚。在每天给小鼠注射TA70mg/kg后，可显著降低这些病理学改变，表明HDAC6对于介导腹膜纤维化起重要作用。

实施例7 TA特异性抑制HDAC6表达并上调乙酰化组蛋白H3和acytyl α-tubulin水平

为探讨TA在体内的作用，我们检测了TA 对于HDAC6, acetyle histone H3和acetylα-tubulin表达的影响。图6 (A-D)表明，在对照组中HDAC6表达较高，acetyl histone H3和acytyl α-tubulin仅有少量表达，在连续注射4.25%腹透液28天后，HDAC6表达显著上调，acetyl histone H3和acytyl α-tubulin表达下调。而TA干预组HDAC6下调至基础水平，acetyl histone H3和acytyl α-tubulin表达上调。免疫荧光(图6 E)也显示HDAC6主要表达于间皮下区域的细胞中，与α-SMA共定位。以上结果表明高糖腹透液可诱导HDAC6在肌成纤维细胞和受损的腹膜间皮细胞中表达。

实施例8 TA显著抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞活化和细胞外基质蛋白沉积

腹膜纤维化与肌成纤维细胞的出现和细胞外基质的增多密切有关。为了探讨TA对于长期暴露于高糖腹透液中的腹膜肌成纤维细胞的活化和细胞外基质沉积的影响，我们使用免疫印迹分析检测了α-SMA的表达和免疫组化检测了collagen I的表达。图7A和B，α-SMA在正常小鼠腹膜中低表达，注射腹透液后显著升高，TA干预则显著抑制α-SMA的表达。免疫组化同样表明相较于注射腹透液组的小鼠，TA干预组小鼠间皮下区域collagen I表达降低（图7C和D）。因此，靶向抑制HDAC6可阻止腹膜纤维化的发生发展。

实施例9 TA靶向抑制HDAC6可阻断高糖腹透液诱导的腹膜TGF-β1/Smad3信号通路的活化

TGF-β信号通路在腹膜纤维化的发展过程中起着重要作用。为阐明腹膜纤维化时HDAC6在该信号通路活化过程中的作用，我们使用ELISA试剂盒检测TGF-β1的表达。图8A表明高糖透析液引起腹膜损伤后TGF-β1表达增加，而TA可以显著降低其表达。其次，我们使用Western Blot检测了TGFRI，p-Smad3和Smad3的表达。图8B-D表明在正常的腹膜组织中表达TGFRI和Smad3，而不表达p-Smad3。注射腹透液后会引起TGFRI表达增加，并导致Smad3发生磷酸化。TA干预则可抑制TGFRI的表达和Smad3的磷酸化。因此，我们的结果表明HDAC6可调控TGF-β信号通路活化，TA靶向抑制HDAC6可阻断高糖腹透液诱导的腹膜TGF-β1/Smad3信号通路的活化。

实施例10 TA可阻断高糖腹透液诱导的腹膜纤维化中EGFR和STAT3通路活化

EGFR和STAT3通路活化对腹膜纤维化的发生具有促进作用。为研究TA干预在调节4.25%高糖腹透液诱导的腹膜纤维化中EGFR和STAT3活化的影响，我们研究了TA对这两者磷酸化水平的影响。总的EGFR和p-EGFR、p-STAT3在4.25%高糖腹透液诱导的腹膜纤维化中表达量明显增高，TA可抑制两者的活化（图9A-E）。因此，我们的结果表明TA也可以调节4.25%高糖腹透液诱导的腹膜纤维化中EGFR和STAT3的活化。

实施例11 TA可阻断高糖腹透液诱导腹膜纤维化中NF-κB通路活化并抑制炎症因子的表达

已有研究证实在4.25%高糖腹透液诱导的腹膜纤维化过程中，炎症反应起了重要作用。NF-κB是调节多种细胞因子和趋化因子的转录因子，因此，我们研究了TA干预对NF-κB活化及炎症因子表达的影响。如图10 (A-F)所示，模型组磷酸化NF-κB和炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1）表达均明显增高，TA可抑制NF-κB磷酸化及炎症因子的表达。因此，HDAC6参与了NF-κB信号通路的活化，且在4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中对调节炎症因子的表达起作用。

实施例12 TA显著抑制高糖腹透液诱导腹膜纤维化组织中巨噬细胞浸润

研究证明巨噬细胞浸润增加对腹膜纤维化起重要的促进作用。CD68是巨噬细胞浸润的主要生物标记，我们研究了TA干预对4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中CD68表达的影响。图11A-D显示4.25%高糖腹透液诱导的CD68表达增加，可被TA抑制。因此，HDAC6在4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中对调节巨噬细胞浸润起作用。

实施例13 TA抑制4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中VEGF表达，减少了新生血管的形成

新生血管生成是长期腹膜透析的主要病理改变之一，且有研究表明腹膜纤维化中VEGF表达增加。为阐明TA干预对4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中新生血管生成的影响，我们研究了CD31和VEGF的表达。如图12 (A-C)所示，模型组CD31和VEGF阳性血管的表达显著增高，TA显著减少CD31和VEGF阳性血管数。无论是否给予TA在sham组几乎检测不到新生血管的形成。这些结果说明HDAC6在4.25%高糖腹透液诱导腹膜纤维化中对调节新生血管生成起关键作用。