一种快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒，其包括针对‑‑

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测地中海贫血的试剂盒，具体涉及一种快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒。

背景技术

地中海贫血是热带、亚热带地区高发的单基因遗传病。重度β地贫患者需要常规输血和去铁治疗，生活质量低下。广西和广东是地中海贫血高发区，约7％的人口为β地贫基因携带者。由于该地区人群地贫致病等位基因携带率较高，因此同型地贫等位基因携带者婚配的几率也较高，导致重症地贫新生儿出生的概率较大。降低重症地贫患者出生几率的途径为加强该地区婚育人群的地贫筛查，而地贫基因诊断则是明确个体是否携带地贫等位基因的方法。

已有的研究(庞婉容,龙驹,叶学和,等.广西北部湾地区人群地中海贫血基因突变分析.中国优生与遗传杂志,2016(1):39-42.)表明，广西人群中α地贫基因的主要类型为--^SEA、--^THAI、-α^4.2、-α^3.7、-α^2.4、-α^21.9、α^CSα、α^QSα和α^Westmeadα等位基因，而β地贫基因的主要类型为β^-90、β^-29、β^-28、β^Cap+40-43、β^IntM、β^IntCD、β^CD14-15、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^IVS-I-5、β^CD37、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^CD95、β^IVS-II-654、HPFH-SEA、^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰(简称DBT)等位基因。前述非缺失型地贫等位基因的简称和HGVS(Human>

表1：

国内在地中海贫血的诊断中，检测地中海贫血基因型的方法通常为Gap-PCR和PCR-RDB。Gap-PCR诊断地贫的原理是通过设计跨越断点式引物对样本进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，而PCR-RDB法则需要完成扩增、杂交等过程方可完成分析。由于这两种方法检测条件和操作方法均不一致，须分开独立操作，而PCR-RDB操作繁琐，且扩增片段较短，容易产生PCR产物污染。而前期所开发出的试剂盒的检测范围也有一定局限性，因此对检测范围的调整和检测方法的改进将为地贫防治工作提供支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒，该试剂盒可实现两管多重PCR技术对α地中海贫血的--^SEA、--^THAI、-α^4.2、-α^3.7、-α^2.4、-α^21.9、Hb>CSα、α^QSα和α^Westmeadα等位基因，以及β地中海贫血的β^-90、β^-29、β^-28、β^Cap+40-43、β^IntM、β^IntCD、β^CD14-15、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^IVS-I-5、β^CD37、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^CD95、β^IVS-II-654、HPFH-SEA、^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰等位基因和AMEL基因座的联合检测，并可混合于一个测序管内一次完成片段分析检测的地贫检测试剂盒。

本发明所述的快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒，包括针对缺失型地贫基因--^SEA、--^THAI、-α^2.4、-α^21.9、HPFH-SEA和^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰设计的引物，针对缺失型地贫基因-α^4.2和-α^3.7采用Y1区段和Y2区段相对定量分析设计的引物，针对非缺失型地贫等位基因HbQ-Thailand、α^CSα、α^QSα、α^Westmeadα、β^-90、β^-29、β^-28、β^Cap+40-43、β^IntM、β^IntCD、β^CD14-15、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^IVS-I-5、β^CD37、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^CD95、β^IVS-II-654设计的引物，针对非缺失型地贫等位基因α^CSα、α^QSα、α^Westmeadα、β^-28、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^IVS-II-654设计的正常对照引物，以及检测性别的AMXY引物，这些引物分2个检测管分装，2个检测管分别记为tube1和tube2，其中：

tube1检测管包含的引物名称及序列如下：

Beta1-FAM-F：5’-6FAM-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGC-3’；

Beta2-FAM-R：5’-6FAM-CCTGAGACTTCCACACTGATGC-3’；

Beta3-FAM-R：5’-6FAM-AGTTGGACTTAGGGAACAAAGGAAC-3’；

CQW-co-ROX-R：5’-ROX-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’；

AMXY-6FAM-F：5’-6-FAM-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3’；

AMXY–R：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’；

CD37M-R：5’-GGACTCAAAGAACCTCTGGGACT-3’；

IntM-R：5’-AAAAAAACAAAAATCCTCAGGAGTCAGTTGCACT-3’；

-90M-R：5’-GTAGATTGGCCAACCCAAGGGTA-3’；

-28M-R：5’-CAAAACAATAGATGGCTCTGCCCTGACTAC-3’；

-29M-R：5’-GATGGCTCTGCCCTGCCTTTC-3’；

IntCD-R：5’-CCTCAGGAGTCAGATGCATCC-3’；

CD17M-R：5’-AAAAACAACTTCATCCACGTTCGCCTA-3’；

Cap+40-43M-R：5’-AAAAGATGCACCATGGTGTCTGAGG-3’；

CD14-15(+G)M-R：5’-CCACGTTCACCTTGCTCTACCA-3’；

CD26M-R：5’-ACCAACCTGCACAGGGTCTT-3’；

IVS-Ⅰ-1M-R：5’-CTGTCTTGTAACCTTGATGCCAAA-3’；

IVS-Ⅰ-5M-R：5’-AACTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGACAG-3’；

CD27/28(+C)M-R：5’-TTTTGATACCAACCTGACCAGGAGC-3’；

CD71-72(+A)M-F：5’-CAAGAAAGTGCTCGGTGCCTGTAA-3’；

CD95M-F：5’-GTGAGCTGCACTGTGACGAAG-3’；

CD43M-F：5’-CCTTGGACCCAGAGGTTCGTTT-3’；

CD41-42M-F：5’-CAAAAAAAAAACAAAACTACCCTTGGACCCAGAT GTTG-3’；

654M-F：5’-CAGTGATAATTTCTGGGTTGAGGT-3’；

WS-N-F：5’-AGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3’；

CS-N-F：5’-CGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3’；

QS-N-F：5’-CTGCGGTGCAAGCCTACCT-3’；

Y1-Y2-HEX-F：5’-HEX-CAGGGATGCACCCACTGGCA-3’；

Y1-Y2-R：5’-CTCGACACGCATCTGCTCAGGGGTGAGGAAGGAAGG GGTG-3’；

Tube2检测管包含的引物名称及序列如下：

Beta1-TAMRA-F：5’-TAMRA-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGC-3’；

Beta2-TAMRA-R：5’-TAMRA-CCTGAGACTTCCACACTGATGC-3’；

Beta3-TAMRA-R：5’-TAMRA-AGTTGGACTTAGGGAACAAAGGAAC-3’；

CQW-co-HEX-R：5’-HEX-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’；

-28N-R：5’-TAGATGGCTCTGCCCTGACATT-3’；

CD17N-R：5’-CAACTTCATCCACGTTCACCAT-3’；

CD26N-R：5’-ACCAACCTGCTCAGGGACTC-3’；

IVS-Ⅰ-1N-R：5’-CTGTCTTGTAACCTTGATACCATC-3’；

CD27/28N-R：5’-AAAATGATACCAACCTGCCCAGCGC-3’；

CD71-72N-F：5’-CAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTGAG-3’；

43/41-42N-F：5’-CCTTGGACCCAGAGGTTCCTTG-3’；

654N-F：5’-CAAAAAACAAAAAAAAAAAACAGTGATAAGTTCTGGG TTAAGGC-3’；

WS-M-F：5’-GAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3’；

CS-M-F：5’-CGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3’；

QS-M-F：5’-CTGCGGTGCACGGCTCACC-3’；

A1-74M-HEX-F：5’-HEX-AACGCCGTGGCGCACTTGC-3’；

A1-QT-R：5’-CAAAACAGCAGGCAGTGGCTTAGGAG-3’；

THAI-HEX-R：5’-HEX-CTTGGATCTGCACCTCTGGGTAGG-3’；

THAI-F：5’-GAATAAAGCGAGAGGAATCACATTCCTC-3’；

SEA-HEX-F：5’-HEX-AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’；

SEA-R：5’-TGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3’；

HPFH-F：5’-AAAACCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’；

HPFH-M-FAM-R：5’-6FAM-TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3’；

DBT-M-FAM-F：5’-6FAM-CCAGAAATTGCCTCATGTCTCT-3’；

DBT-R：5’-CACATATAAAATGCTGCTAATGCTTCATTAC-3’；

2.4-HEX-F：5’-HEX-ACCACGACCTCTAGGCCAGT-3’；

2.4R：5’-CAACCAGCCCTCTGCTGTAC-3’；

21.9-F：5’-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3’；

21.9-HEX-R：5’-HEX-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3’；

上述引物中，“M”代表突变位点，“N”代表正常对照位点，FAM是指羟基荧光素，ROX是指羧基-X-罗丹明，HEX是指六氯-6-甲基荧光素，TA MRA是指羧基四甲基罗丹明。上述引物的荧光标记组合可以根据测序仪的类型和设置采用其它荧光染料替代，如FAM、HEX、TAMRA和ROX为ABI测序仪中E5染料的一种组合，也可以选用G5设置中的FAM(蓝色)、VIC(绿色)、NED(黄色)和PET(红色)为组合，或者其它经过光谱校正的荧光染料组合。本申请中仅列出其中一种组合，但不仅限于上述的一种，采用其他染料组合也可以实现；所选择的荧光标注也不限于以上颜色，采用可区分的经光谱校正的荧光颜色组合均可。

上述技术方案中，所述Y1区段的序列为：5’-GTGATTTCTCAGGCTGTTTTCTCCTCAGTACCATCCCCCCAAAAAACATCACTTTTCATGCACAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGCTGGCCAGCCTCATCACCCCAACATCTCCCCACCTCCATTCTCCAACCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCCCCGAGCCAAGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCTCCACCTAATACATATCCTTAAGTCTCACCTCCTCCAGGAAGCCCTCAGACTAACCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGTCCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTGTACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTTACCTGTTTAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3’；Y2区段的序列为：5’-CACCGAGCCTGGCCAAACCATCACTTTTCATGAGCAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCCCCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTGTTTACAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3’。

本发明所述的快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、Mg²⁺(MgCl₂)和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于PCR反应的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStar>

采用上述试剂盒快速检测地中海贫血常见突变基因的方法包括以下步骤：

1)抽提样本基因组DNA，采用现有常规方法制备DNA模板；

2)配制反应体系，具体为：

Tube1检测管：取待检测DNA、Tube1检测管所包括的各引物、PCR缓冲液、酶液、MgCl₂、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；其中，各组分的浓度通常为：待检测DNA：20-50ng；各引物：0.038～0.36μmol/L；Mg²⁺：1.6～1.8mmol/L；反应体系的终体积可以是10μL、20μL或25μL；

Tube2检测管：取待检测DNA、Tube2检测管所包括的各引物、PCR缓冲液、酶液、MgCl₂、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；其中，各组分的浓度通常为：待检测DNA：20～50ng；各引物：0.08～0.54μmol/L；Mg²⁺：1.6～1.8mmol/L；反应体系的终体积可以是10μL、20μL或25μL；

3)样本检测：2个检测管分别运行PCR反应程序，取2个检测管中的PCR产物各0.4μL，混合测序系统的分子量内参，混合测序上样载体去离子甲酰胺(HiDi)10μL，混匀后采用测序仪进行上样测序，采用片段分析方法检测结果；

4)数据分析及结果判定：

采用GeneMapper软件进行数据读取和分析，其中Tube1的PCR产物所对应的等位基因、最终PCR产物荧光颜色和产物长度如表2所示；Tube2的PCR产物所对应的等位基因、最终PCR产物荧光颜色和产物长度如表3所示；表4则是-α^3.7和-α^4.2的判断依据。

表2：

表3：

表4：

由于2管PCR产物(Tube1和Tube2)是混在一个测序管内进行片段分析，因此单样本基因型的判读可在一个测序反应后完成。具体判读方式为：

M代表突变位点，N代表正常对照位点，3种非缺失型α地贫等位基因和9种非缺失型β地贫等位基因β^-28、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^IVS-II-654设计有正常对照SNP检测引物(β^CD41-42、β^CD43共用1条正常对照引物，因此共设置8条β地贫等位基因正常对照引物)。

A,设置有正常对照的检测位点，当未检出M所对应的颜色、长度信号时，则该样本不携带该等突变位基因；当同时检出M、N所对应的颜色、长度信号时，该样本在该检测位点的等位基因为突变杂合型；如仅检出M所对应的颜色、长度信号，但未检出N所对应的颜色、长度信号时，该样本在该检测位点为非缺失型纯合子。

B,未设置有正常对照的非缺失型地贫检测位点，当未检出M所对应的颜色、长度信号时，则该样本不携带该等突变位基因；未设置有正常对照的非缺失型地贫检测位点，当检出M所对应的颜色、长度信号时，则该样本携带该等突变位基因，由于未设置有正常对照的非缺失型地贫基因型在人群中所占比率较低，所以当检出M所对应的颜色、长度信号时一般为该位点的杂合子突变，但最好经过测序确认。

C，缺失型地贫判断方法为：当缺失型地贫对应荧光值的产物长度检出信号时，判断该样本携带该缺失型，但须综合非缺失型地贫正常对照位点，3个非缺失型α地贫的正常参照位点只要一个位点阳性就代表α2基因存在，只要1种非缺失型β地贫等位基因的正常参照位点为阳性，即证明β基因存在，须综合考虑。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、采用本发明所述试剂盒可实现2管对α地中海贫血的--^SEA、--^THAI、-α^2.4、-α^21.9、-α^4.2、-α^3.7、α^CSα、α^QSα、α^Westmeadα和Hb>Gγ⁺(^Aγδβ)⁰、β^-90、β^-29、β^-28、β^Cap+40-43、β^{Int>、βInt>、βCD14-15、βCD17、βCD26、β27/28、βIVS-I-1、βIVS-I-5、βCD37、βCD41-42、βCD43、βCD71–72、βCD95和βIVS-II-654采基因型进行检测，无需额外的琼脂糖凝胶电泳、杂交操作，避免了PCR产物污染。}

2、本发明所述试剂盒对检测位点的检测具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性；其中的引物具有良好的特异性及实验的可重复性；

3、荧光标记的采用，对受测样本的DNA浓度要求降低，可采用具毛囊的毛发、口腔拭子等进行DNA提取并完成检测；

4、本发明所述试剂盒可同时进行96个样本的检测，自动化检测平台减低人工参与度，减少人为操作失误；

5、本发明所述试剂盒具有检测快速(从DNA提取到结果获取仅需4-5个小时)、准确、操作简便、检测范围广、费用低廉的特点；

6、本发明所述试剂盒的检测范围适合检测中国人群地贫等位基因变异的检测机构使用。

附图说明

图1为本发明实施例1中2#样本的检测结果分型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果

1.试剂盒的组成

(1)引物，包括：

1.1)检测α地贫突变的引物：根据NCBI公开的α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)序列设计α地贫突变的检测引物，其中--^SEA、--^THAI、-α^2.4、-α^21.9采用Gap-PCR法设计引物，-α^4.2和-α^3.7则根据Y1区段和Y2区段的相对定量完成，α^CSα、α^QSα、α^Westmeadα和Hb>

1.2)检测β地贫突变的引物：根据NCBI公开的β-珠蛋白基因簇(NG_000007.3)序列进行设计，其中HPFH-SEA和^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰采用Gap-PCR法设计引物，β^-90、β^-29、β^-28、β^Cap+40-43、β^IntM、β^IntCD、β^CD14-15、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^IVS-I-5、β^CD37、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^CD95和β^IVS-II-654采用AS-PCR法设计引物，其中α^CSα、α^QSα、α^Westmeadα、β^-28、β^CD17、β^CD26、β^27/28、β^IVS-I-1、β^CD41-42、β^CD43、β^CD71–72、β^IVS-II-654设计有正常对照SNP检测引物。

1.3)检测性别的AMXY引物。

上述所有的引物分2个检测管分装，2个检测管分别记为tube1和tube2，其中：

tube1检测管包含的引物名称及序列如下述表5所示：

表5：

上述表5中，“M”代表突变位点，“N”代表正常对照位点，FAM是指羟基荧光素，ROX是指羧基-X-罗丹明，HEX是指六氯-6-甲基荧光素。表5中，Beta1-FAM-F、Beta2-FAM-R、Beta3-FAM-R为非缺失型β地贫等位基因扩增的公共标记引物端，突变端所包含的为扩增18种非缺失型β地贫等位基因的检测端；CQW-co-ROX-R为非缺失型α地贫等位基因扩增的公共引物端，检测端检测的是3种非缺失型地贫等位基因的正常对照点；AMXY引物对是检测性别的引物对，Y1-Y2引物对用以检测Y1和Y2拷贝数。表中所示数值为对应引物的扩增片段大小。

Y1和Y2拷贝数的检测用于提示-α^4.2和-α^3.7的存在，用Y1的检出峰值与Y2的检出峰值做比较，具体判断方法为：当Y1＝Y2，且非缺失型α地贫对照点检出产物峰时，则待测样本不包括-α^3.7或者-α^4.2；若Y1＝2Y2，且非缺失型α地贫对照点检出产物峰时，则待测样本的基因型含有-α^4.2，无其他α缺失；若2Y1＝Y2，且非缺失型α地贫对照点检出产物峰时，则待测样本的基因型含有-α^3.7，无其他α缺失；其余基因型需参考缺失型地贫等位基因的检出峰再作具体判断。

前述涉及的Y1区段的序列为：5’-GTGATTTCTCAGGCTGTTTTCTCCTCAGTACCATCCCCCCAAAAAACATCACTTTTCATGCACAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCTGCAGGAGCTGGCCAGCCTCATCACCCCAACATCTCCCCACCTCCATTCTCCAACCACAGGGCCCTTGTCTCCTCTGTCCTTTCCCCTCCCCGAGCCAAGCCTCCTCCCTCCTCCACCTCCTCCACCTAATACATATCCTTAAGTCTCACCTCCTCCAGGAAGCCCTCAGACTAACCCTGGTCACCTTGAATGCCTCGTCCACACCTCCAGACTTCCTCAGGGCCTGTGATGAGGTCTGCACCTCTGTGTGTACTTGTGTGATGGTTAGAGGACTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGCTCCAGCCGGTTCCAGCTATTGCTTTGTTTACCTGTTTAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3’(SEQ ID NO：30)；该Y1区段的特征序列y1为：5’-CAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTTCCCCAGAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCC-3’(SEQ ID NO：31)。涉及的Y2区段的序列为：5’-CACCGAGCCTGGCCAAACCATCACTTTTCATGAGCAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCAACCACAGGGGCCTTCTCTCCCCTGTCCTTTCCCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTATCTGTTTACAACCAGTATTTACCTAGCAAGTCTTCCATCAGATAG-3’(SEQ ID NO：32)；该Y2区段的特征序列y2为：5’-CAGGGATGCACCCACTGGCACTCCTGCACCTCCCACCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACCC-3’(SEQ ID NO：33)。

Tube2检测管包含的引物名称及序列如下述表6所示：

表6：

表6中，“M”代表突变位点，“N”代表正常对照位点，FAM是指羟基荧光素，HEX是指六氯-6-甲基荧光素，TAMRA是指羧基四甲基罗丹明。表6中，Beta1-TAMRA-F、Beta2-TAMRA-R、Beta3-TAMRA-R为非缺失型β地贫等位基因扩增的公共标记引物端，突变端所包含的为扩增9种非缺失型β地贫等位基因的参考正常位点的检测端，其中43/41-42N-F检测的为CD43M和CD41-42M的共用参考位点；CQW-co-HEX-R为非缺失型α地贫等位基因扩增的公共引物端，检测端检测的是3种非缺失型地贫等位基因；该检测管还包括检测缺失型α地贫--^SEA、--^THAI、-α^2.4和-α^21.9的引物对，以及检测缺失型β地贫HPFH-SEA和^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰的引物对。表中所示数值为对应引物的扩增片段大小。

Tube1检测管包含的引物和Tube2检测管包含的引物在试剂盒中的最终组成浓度分别如下述表7和表8所示：

表7：

表8：

(2)其它组分：

GoldStar Taq DNA Polymerase、与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液和dNTPs均购自康为世纪，MgCl₂购自Life>

分别按下述表9和表10配制Tube1检测管和Tube2检测管的PCR反应体系：

表9：

表10：

2.实施方法

PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：PCR反应程序为，95℃10分钟，94℃30秒、62.5℃30秒和72℃30秒、28-35个循环，62℃60分钟延伸。

样本处理：通用DNA试剂盒抽提DNA，以双蒸水稀释至20～50ng/μL备用。

样本检测：将已知基因型待检样本(20份，分别编号为1#、2#......20#)按Tube1体系和Tube2体系分别配置、置于PCR仪中并运行PCR反应程序。PCR程序运行结束后分别取Tube1检测管PCR产物和Tube2检测管PCR产物各0.4μl，混合测序系统的分子量内参，混合测序上样载体去离子甲酰胺(HiDi)10μl，混匀后采用测序仪进行上样测序，采用片段分析方法检测结果。

3.样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术或测序技术确定基因型的DNA样本。

4.数据分析及结果判定：采用GeneMapper软件读取并分析结果，综合检测结果判读基因型，结果如下：

1#样本为男性αα/αα,β^CD17/β^N；

2#样本为女性αα/αα,β^-28/β^-28，其检测结果分型图如图1所示；

3#样本为男性αα/αα,β^-29/β^N；

4#样本为男性-α^3.7/αα,β^CD14-15/β^N；

5#样本为男性-α^3.7/α^CSα,β^N/β^N；

6#样本为女性-α^4.2/α^Westmeadα,β^N/β^N；

7#样本为女性αα/αα,β^27/28/β^N；

8#样本为女性αα/αα,β^CD37/β^N；

9#样本为男性αα/αα,β^CD41-42/β^N；

10#样本为女性αα/αα,β^-28/β^CD71–72；

11#样本为男性αα/αα,β^IVS-II-654/β^IVS-II-654；

12#样本为男性αα/αα,β^-90/β^N；

13#样本为男性αα/αα,β^Cap+40-43/β^N；

14#样本为男性αα/αα,β^CD26/β^N；

15#样本为男性α^Westmeadα/αα,β^CD95/β^N；

16#样本为女性αα/αα,^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰/β^N；

17#样本为女性αα/αα,HPFH-SEA/β^N；

18#样本为男性αα/αα,β^IntCD/β^N；

19#样本为女性αα/αα,β^IntM/β^N；

20#样本为女性αα/αα,β^IVS-I-5/β^N。

由结果可见，本发明所述试剂盒可区分各种常见基因型；且检测的所有样本的基因型与其经常规Gap-PCR、PCR-RDB技术确定的基因型相同，说明本发明所述试剂盒在对已知基因型样本的检测时具有很好的准确性。

SEQUENCE LISTING

<110> 黄, 德珍

<120> 一种快速检测地中海贫血常见突变基因的试剂盒

<130> 2017

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctaagcca gtgccagaag agc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgagactt ccacactgat gc 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agttggactt agggaacaaa ggaac 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acctccattg ttggcacatt cc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcagagctt aaactgggaa gctg 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggactcaaag aacctctggg act 23

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaaaaacaa aaatcctcag gagtcagttg cact 34

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtagattggc caacccaagg gta 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaaacaata gatggctctg ccctgactac 30

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatggctctg ccctgccttt c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctcaggagt cagatgcatc c 21

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaaaacaact tcatccacgt tcgccta 27

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaagatgca ccatggtgtc tgagg 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccacgttcac cttgctctac ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

accaacctgc acagggtctt 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgtcttgta accttgatgc caaa 24

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacttaaacc tgtcttgtaa ccttgacag 29

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttttgatacc aacctgacca ggagc 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

caagaaagtg ctcggtgcct gtaa 24

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtgagctgca ctgtgacgaa g 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccttggaccc agaggttcgt tt 22

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

caaaaaaaaa acaaaactac ccttggaccc agatgttg 38

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cagtgataat ttctgggttg aggt 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agttcacctc tgcggtgcac 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgtgctgacc tccaaatact gtt 23

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctgcggtgca agcctacct 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cagggatgca cccactggca 20

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctcgacacgc atctgctcag gggtgaggaa ggaaggggtg 40

<210> 30

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gtgatttctc aggctgtttt ctcctcagta ccatcccccc aaaaaacatc acttttcatg 60

cacagggatg cacccactgg cactcctgca cctcccaccc ttccccagaa gtccacccct 120

tccttcctca ccctgcagga gctggccagc ctcatcaccc caacatctcc ccacctccat 180

tctccaacca cagggccctt gtctcctctg tcctttcccc tccccgagcc aagcctcctc 240

cctcctccac ctcctccacc taatacatat ccttaagtct cacctcctcc aggaagccct 300

cagactaacc ctggtcacct tgaatgcctc gtccacacct ccagacttcc tcagggcctg 360

tgatgaggtc tgcacctctg tgtgtacttg tgtgatggtt agaggactgc ctacctccca 420

gaggaggttg aatgctccag ccggttccag ctattgcttt gtttacctgt ttaaccagta 480

tttacctagc aagtcttcca tcagatag 508

<210> 31

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cagggatgca cccactggca ctcctgcacc tcccaccctt ccccagaagt ccaccccttc 60

cttcctcacc c 71

<210> 32

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

caccgagcct ggccaaacca tcacttttca tgagcaggga tgcacccact ggcactcctg 60

cacctcccac cctccccctc gccaagtcca ccccttcctt cctcacccca catcccctca 120

cctacattct gcaaccacag gggccttctc tcccctgtcc tttccctacc cagagccaag 180

tttgtttatc tgtttacaac cagtatttac ctagcaagtc ttccatcaga tag 233

<210> 33

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cagggatgca cccactggca ctcctgcacc tcccaccctc cccctcgcca agtccacccc 60

ttccttcctc accc 74

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tcctaagcca gtgccagaag agc 23

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cctgagactt ccacactgat gc 22

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agttggactt agggaacaaa ggaac 25

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

acctccattg ttggcacatt cc 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tagatggctc tgccctgaca tt 22

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

caacttcatc cacgttcacc at 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

accaacctgc tcagggactc 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ctgtcttgta accttgatac catc 24

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aaaatgatac caacctgccc agcgc 25

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

caagaaagtg ctcggtgcct tgag 24

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ccttggaccc agaggttcct tg 22

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

caaaaaacaa aaaaaaaaaa cagtgataag ttctgggtta aggc 44

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gagttcaccc ctgcggttca g 21

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cgtgctgacc tccaaataca gtc 23

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ctgcggtgca cggctcacc 19

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

cttggatctg cacctctggg tagg 24

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gaataaagcg agaggaatca cattcctc 28

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

agaagctgag tgatgggtcc g 21

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tggacttaag tgatcctcct gccc 24

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

aaaaccagcc tcatggtagc agaatc 26

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

tggtatctgc agcagttgcc 20

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ccagaaattg cctcatgtct ct 22

<210> 56

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cacatataaa atgctgctaa tgcttcatta c 31

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

accacgacct ctaggccagt 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

caaccagccc tctgctgtac 20

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ggagcttttc cttccctgga acg 23

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tgtggttgga gaatggaggt gg 22

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

aacgccgtgg cgcacttgc 19

<210> 62

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caaaacagca ggcagtggct taggag 26