一种穗菝葜的种质资源鉴定方法

摘要

本发明涉及一种利用SSR分子标记快速鉴定穗菝葜种质资源的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，用基于穗菝葜转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行测序分型和基因片段长度读取；（4）利用遗传学分析软件建立穗菝葜的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架并进行有效性验证。该方法能够对来自欧洲、非洲、亚洲的不同产地，及地区内不同自然群体来源的穗菝葜进行有效、快速的分类和鉴定，结果准确可靠，该方法简单易行，适用性高，可有效运用于穗菝葜的种质资源鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及植物种质资源鉴定中引物组的开发和应用，通过转录组测序的方法，高效开发了47对特异性强、灵敏度佳的SSR引物，以欧洲、亚洲、非洲产的穗菝葜植物资源为材料，覆盖其自然分布区，以此建立穗菝葜植物的SSR遗传信息特征库和种质资源鉴定框架，并进行快速种质资源鉴定的方法。

背景技术

穗菝葜(Smilax aspera Linnaeus，英文名Italian sarsaparilla、roughbindweed)为菝葜科菝葜属多年生攀援藤本或小灌木，广布于欧洲地中海地区、非洲东部、亚洲南部地区，我国产于云南(西南部)和西藏(聂拉木、吉隆等地)。经国内外学者研究发现穗菝葜植株各部位具有潜在药用及经济价值：其叶提取物富含维他命E族(α生育酚、β生育酚、γ生育酚)抗氧化物；其浆果提取物富含花青素(矢车菊素-3-O-芦丁糖甙、天竺葵素-3-O-芦丁糖苷)，可作为天然色素良好来源；其根部提取物含有呋甾皂苷、甾体皂苷、菝葜皂苷、白藜芦醇、反式白藜芦醇等成分，有抗炎、抗真菌、抗麻风等活性，具有镇痛、利尿、发汗、滋补、净化等功效；穗菝葜的根部提取物也是生产沙士饮料的原料之一，该类型产品占台湾碳酸饮料市场三成以上。虽然在研究和应用领域越来越受到关注，但由于其分布范围广，横跨欧洲、非洲、亚洲三个大陆，不同地区种质资源在有效成分和遗传物质上存在差异，如能有效甄别穗菝葜的种质资源类型，将给后续植物资源的合理利用和开发带来便利。

SSR分子标记作为一项方法成熟、操作快捷、结果可靠的技术已广泛用于植物的种质资源鉴定。邱杨等(植物遗传资源学报2014，15(3)：648-654)利用SSR分子标记技术对75份不同来源的萝卜样本进行了种质资源鉴定，并建立了分子身份证；王瑞等(中国农学通报2016，32(34)：135-142)利用SSR分子标记技术对南瓜的不同品种进行了种质资源分析，将南瓜分为中国南瓜、印度南瓜及美洲南瓜3个类群。

目前虽然已有报道对穗菝葜进行分子标记开发的案例，但无论是实施方案和可行性方面，都存在不足。Xu等(American Journal of Botany:e64–e66.2011)通过双重抑制法开发了少量穗菝葜SSR引物，但该方法仅获得了两碱基重复单元或两碱基重复组合单元类型的SSR标记，遗传多样性不高，位点覆盖度不足，多态性丰富度低，且仅适用于希腊与意大利的穗菝葜植物群体，不能够有效地鉴定不同种源穗菝葜。此外，该方法开发周期长，一次开发获得引物通量低，单位标记成本相对较高。若通过DNA基因片段对穗菝葜进行鉴定，从其鉴别效率看，该方法不能有效甄别区域内群体间的种质资源，通常标记来自于叶绿体单倍型，只能检测单亲母系遗传的遗传信息，而且 如果对所有基因片段进行测序，其费用高昂，面对大批量样本可实施性不佳。因此，需要开发出一种成本相对低廉，且能快速高效鉴定穗菝葜种质资源的方法。利用转录组数据设计开发的简单重复序列(SSR)在技术和实施上都具有一定优势，相比于传统的SSR分子标记开发方法，借助高通量测序技术批量开发SSR引物，可以获得覆盖面更广、遗传多样性更高的位点，可更高效地鉴定物种种质资源，在已有的开发案例中，Wei et al.(BMC Genomics 2011,12:451)通过对芝麻花组织的转录组测序，批量开发SSR引物，有效用于油用经济作物芝麻的种质资源鉴定。本发明通过利用穗菝葜的转录组信息批量开发SSR引物，从欧洲、亚洲、非洲各地的大量穗菝葜野生群体获取丰富的SSR遗传多样性信息，并建立穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库库和种质资源鉴定框架，并进行快速鉴定，该方法技术成熟、实施流程便捷且鉴定效果明显，将为后续穗菝葜植物资源的科学利用和开发提供便利。

参考文献：

Xu,X.,Wan,Y.,Qi,Z.C.,Qiu,Y.,Fu,C.X.,2011.Isolation of compoundmicrosatellite markers for the common Mediterranean shrub Smilax aspera(Smilacaceae).Am.J.Bot.98,e64–e66.

Wei,W.,Qi,X.,Wang,L.,Zhang,Y.,Hua,W.,Li,D.,Lv,H.,Zhang,X.,2011.Characterization of the sesame(Sesamum indicum L.)global transcriptomeusing Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers.BMCGenomics 12,451.

邱杨,李锡香,李清霞,陈亦辰,沈镝,王海平,宋江萍,2014.利用SSR标记构建萝卜种质资源分子身份证.植物遗传资源学报15,648–654.

王瑞,吴廷全,钟玉娟,黄河勋,2016.95份南瓜种质资源亲缘关系的SSR分析.中国农学通报,135–142.

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种利用SSR标记鉴定穗菝葜种质资源的方法。

具体技术方案如下：

一种穗菝葜种质资源鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，用基于穗菝葜转录组序列的SSR引物组合进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)所得不同长度的扩增产物进行测序，通过GENEIOUS 9.0.2软件进行等位基因的读取，形成等位基因矩阵；

(4)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用CERVUS 3.0软件计算等位基因数(A)、观察与期望杂合度(H_o、H_e)、多态性信息量(PIC)；

(5)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用GenAlEx 6.5软件进行SSR引物(位点)基于不同群体的等位基因的统计和列举，形成穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库，并选取随机样本进行验证；

(6)对步骤(3)所得到的等位基因矩阵利用GenAlEx 6.5软件生成遗传距离矩阵，并通过MEGA 6软件进行遗传距离聚类分析，构建UPGMA树，建立穗菝葜种质资源鉴定框架；

(7)随机盲选10份穗菝葜样本，利用相同47对SSR引物PCR扩增，得到等位基因数据，加入到上述构建穗菝葜种质资源鉴定的等位基因矩阵中，通过遗传距离聚类分析评估与鉴定10份样本种质资源状况与来源。

该方法能够对来自欧洲、非洲、亚洲的不同产地，及地区内不同自然群体来源的穗菝葜进行有效、快速的分类和鉴定，结果准确可靠，该方法简单易行，适用性高，可有效运用于穗菝葜的种质资源鉴定。

其中，步骤(2)所述引物组合包括下述47对SSR引物，每对SSR引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3-SEQID NO.4、SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9-SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15-SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27-SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33-SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39-SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45-SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51-SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57-SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59-SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63-SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75-SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.77-SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79-SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.81-SEQ IDNO.82、SEQ ID NO.83-SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.87-SEQ IDNO.88、SEQ ID NO.89-SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.91-SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93-SEQ IDNO.94，所述引物编号为奇数的核苷酸序列为上游引物，引物编号为偶数的核苷酸序列为下游引物；所述PCR扩增所用到的引物还包括一个5’端用荧光标记的通用引物，所述通用引物的序列为SEQ ID NO.95；

其中，步骤(2)中所述基于转录组序列的SSR引物组合是由以下方法筛选得到：搜索转录组数据中的SSR位点，针对SSR位点设计、开发并且合成目标引物，对所合成的引物进行最适退火温度的筛选和通用性检测，对筛选得到的引物进行PCR扩增，再对扩增产物通过毛细管电泳与GENEIOUS 9.0.2软件进行等位基因的读取，确定用于穗菝葜种质资源鉴定的引物组合。

其中，SSR位点的搜索限制条件为：单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复单元的SSR区域，筛选相应重复次数至少为10次、6次、5次、4次、3次、3次，若两个相邻SSR之间的碱基距离小于100bp则视为复合型SSR。

其中，设计目标引物的参数为：产物长度18-27bp，退火温度(Tm)50-65℃，GC含量为50％-60％，产物长度100-500bp。

本发明的发明人通过大量的创造性试验，开发出一套利用基于转录组的SSR标记鉴定穗菝葜种质资源的数据库与方法，上述引物具有扩增稳定、遗传多态性高的优点，能准确鉴定来自欧洲、非洲以及亚洲不同来源穗菝葜，将为后续穗菝葜植物资源合理开发利用奠定基础。

本发明提供的利用SSR标记鉴定穗菝葜种质资源的方法，结果准确、可靠；可直接以植物新鲜或干燥组织为检测样品，快捷方便；通过遗传聚类分析进行判断，结果较为直观。本发明的方法鉴定易行、适用于穗菝葜种质资源鉴定。

一般性定义

术语“SSR”即简单重复序列，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，其广泛且均匀分布于真核生物染色体中，因其重复单元的数目存在高度变异，且SSR的侧翼序列相对保守，是一种理想的分子标记技术。

术语“转录组”是指在某一生理条件下，某一组织细胞内所有转录产物的集合，对于同一个体，其不同生长时期、不同组织部位的转录组往往是不同的。

术语“引物”是指一小段单链的核苷酸序列，与目标片段侧翼互补，用于PCR扩增时作为多核苷酸延伸的出发点。

术语“测序分型”是指通过测序仪，借助产物中的荧光信号来读取一对等位基因的碱基长度。

术语“基因矩阵”是指个体相对于SSR引物(位点)的等位基因长度的阵列集合，用于遗传参数的计算。

术语“种质资源”又称遗传资源，是指亲代传递给子代的遗传信息，对于同一物种来讲，由于不同的生态环境影响，在长期的演化进程中，来自不同地理分布的该物种在相应的基因座上存在遗传差异，通过分子标记技术能够检测到该差异，并对不同来源个体进行鉴定。

术语“种质资源鉴定框架”是指由MEGA6软件生成的基于测试穗菝葜样本的基因矩阵的UPGMA遗传聚类树，用于后续样本的种质资源鉴定。

术语“穗菝葜SSR遗传信息特征库”是指SSR引物(位点)在所有测试穗菝葜样本的等位基因长度的集合。

附图说明

图1为穗菝葜种质资源鉴定遗传聚类框架图；

图2为10份穗菝葜样本鉴定鉴定效果图(用方框标注的分支表示盲选的穗菝葜样本)。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例中所用到的穗菝葜材料如下：

(1)用于构建穗菝葜种质资源鉴定框架的穗菝葜样本：共12个群体，每个群体6个个体，总计72份植物材料，具体样品信息见表1。

表1穗菝葜样本信息一览

(2)用于验证的穗菝葜样本：在上述群体中，随机挑选10份穗菝葜样本。

实施例1.构建穗菝葜转录组数据库

(1)使用RNAprep Pure Plant Kit(北京天根)试剂盒进行穗菝葜新鲜叶片总RNA提取，送测序公司进行转录组测序。

(2)利用GENEIOUS 9.0.2的De novo assembly功能将短读长序列拼接成转录组框架数据，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，建立能够进行微卫星位点检索的转录组数据库。

实施例2.微卫星SSR引物的开发

(1)利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)软件对上述Unigene进行不同类型微卫星扫描，以识别和定位SSR位点，参数设置(misa.ini配置文件)如下：识别单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重复次数至少为10次、6次、5次、4次、3次、3次，若两个相邻SSR之间的碱基距离小于100bp则视为复合型SSR。

(2)将*.fasta、misa.pl和misa.ini都复制到同一文件夹目录下，在Perl环境下运行命令>misa.pl*.fasta，运行后得到*.fasta.misa和*.fasta.statistics两个文件，其中*.fasta.misa用于后续的引物设计。

(3)在Perl环境下利用Primer 3模块批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18-27bp，Tm设置为50-65℃，GC含量为50％-60％，产物长度100-500bp。将p3_in.pl和p3_out.pl以及primer3_core复制到同一目录下。

(4)运行p3_in.pl，命令为>p3_in.pl C.fasta.misa，得到文件名为*.fasta.p3in的输入文件；Perl环境下运行primer3_core，命令为>primer3_core<*.fasta.p3in>*.fasta.p3out，产生文件*.fasta.p3out；最后运行p3_out.pl，命令为>p3_out.pl*.fasta.p3out*.fasta.misa，运行后得到*.fasta.results文件，获得符合标准批量引物信息。

(5)根据不同的SSR重复，从穗菝葜SSR引物库中随机挑选153对引物(SSR重复单元涵盖单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基和复合型型SSR)，上游引物5’端拼接M13序列，下游引物不变，共合成153对SSR引物。

实施例3.基因组DNA提取

使用PlantZol(杭州莱枫)试剂，采取改良的CTAB法，提取上述72份穗菝葜材料的基因组DNA，用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，USA)定量后，稀释到20ng/μl，4℃或-20℃保存待用。

实施例.SSR引物筛选和通用性检测

(1)以上述穗菝葜样本中群体编号为IL的一个个体DNA为模板，对合成的SSR引物进行最适退火温度的筛选。

PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物各0.2μM，2×Master Mix(杭州擎科，下同)5μL，反应体积为10μL，用ddH₂O补足体积。

PCR反应为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性45s，50-65℃(温度梯度)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，挑选有扩增条带并且条带单一的引物，确定该引物扩增条带最亮时的退火温度为其最适退火温度。

(2)从上述穗菝葜样本中每个群体挑选一个个体，共12个个体，对上述步骤中筛选到的SSR引物进行通用性检测。

PCR反应体系为：模板DNA 20ng，上下游引物各0.2μM，2×Master Mix 5μL，反应体积为10μL，用ddH₂O补足体积。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性45s，Tm(见表2)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。产物用2％的琼脂糖进行电泳检测，挑选至少在75％的个体中都有单一明亮条带的引物，作为穗菝葜种质资源鉴定的候选引物。

(3)综合以上2步，从合成的153对SSR引物中筛选得到64对候选SSR引物。

实施例5.SSR引物的群体扩增

(1)以全部72份穗菝葜样本DNA为模板，采用“三引物”、“两步走”的扩增策略进行PCR扩增，“三引物”包括一个上游引物、一个下游引物和一个5’端用荧光标记(FAM、HEX、TAMRA或ROX)的通用M13引物，所述上游引物为在步骤2合成的5’端拼接有5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’(M13)序列的上游引物，所述下游引物为步骤2合成的下游引物。拼接有“M13”的上游引物扩增后，为通用M13引物提供了反向互补序列，M13引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。“两步走”即PCR反应过程采取前后两步不同条件的程序，使荧光PCR产物更有效地扩增。整个PCR扩增反应过程的引物用量比例为SSR上游引物：SSR下游引物：M13通用荧光引物＝1:4:4。

(2)第一步扩增：DNA模板20ng，上游引物0.1μM，下游引物0.4μM，2×Master Mix 5μL，反应体积为10μL，用ddH₂O补足体积。反应程序为：94℃预变性5min，紧接着35个循环的94℃变性45s，Tm(见表2)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。

(3)第二步扩增：以第一步的扩增产物为模板，继续加入0.8μL(5μM)的M13通用荧光引物，5μL的2×Master Mix，反应体积20μL，用ddH₂O补足体积。反应程序为94℃预变性3min，紧接着20个循环的94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，最后保持72℃延伸10min。得到带有荧光信号的PCR扩增产物。

实施例6.穗菝葜种质资源鉴定框架和SSR遗传信息特征库的构建

(1)按照不同长度和不同荧光的PCR反应产物等比例混合，用3730xl DNA测序仪(ABI，USA)进行毛细管电泳，用GENEIOUS 9.0.2软件进行等位基因分型的判别和读取，形成等位基因矩阵。选择峰型较好，峰高大于200，且条带长度较好的，在所设计引物的扩增产物大小区间的作为有效引物。

(2)将上述步骤得到的等位基因矩阵利用CERVUS 3.0软件计算等位基因数(A)、观察与期望杂合度(H_o、H_e)、多态性信息量(PIC)，见表2；选择PIC值大于0.2的引物，用于构建穗菝葜种质资源鉴定框架和SSR遗传信息特征库，共有47对引物符合条件，每对引物由上游引物和下游引物组成，见表3。

表2基于穗菝葜转录组的SSR引物的最适退火温度及遗传参数

表3基于穗菝葜转录组开发的47对SSR引物及M13通用引物序列

(3)利用GenAlEx 6.5软件对等位基因矩阵进行SSR引物(位点)基于12个穗菝葜自然群体的等位基因片段长度的统计和列举，形成穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库，见表4。

表4穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库(单位：bp,0表示缺失)

(4)利用GenAlEx 6.5软件对等位基因矩阵生成遗传距离矩阵，并通过MEGA 6软件进行遗传距离聚类分析，构建UPGMA树，建立穗菝葜种质资源鉴定框架，见附图1。

附图1清晰地展示了72个不同穗菝葜样本的遗传聚类关系，来自同一群体的6个个体能够聚类到一个分支(SM-6、GC-2聚类到相邻群体内)。不同地理分布的群体能够清晰地分辨，UPGMA树分为2大支，一支为欧洲地中海支系，另一支为东非-南亚支系；同时2大支系内的穗菝葜群体也都按照不同的地理分布清晰地聚类，2大支系内的穗菝葜的遗传距离与地理距离一致，穗菝葜种质资源遗传距离鉴定框架可靠。

实施例7.穗菝葜种质资源鉴定的验证

(1)通过SSR遗传信息特征库进行鉴定

随机盲选穗菝葜样本10份(除去构建穗菝葜种质资源鉴定框架的个体)，分别标记为X-1～X-10,按照步骤3提取基因组DNA，按照步骤5的PCR过程进行产物扩增，用GENEIOUS9.0.2软件进行等位基因分型的判别和读取，具体信息见表6。

表6验证样本基于47对SSR引物的等位基因分型表(单位：bp，0表示缺失)

将验证样本的等位基因分型逐一与穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库进行比对，通过少于47对引物的组合，可以将验证样本定位到某一群体。通过该方法对10个随机抽样个体进行检测，对其群体尺度进行定位，鉴定效果见表7。

表7验证样本基于穗菝葜种质资源SSR遗传信息特征库的群体定位效果

通过对10个验证样本进行群体定位，其中5个样本完全符合其真实群体信息，成功率为50％，另5个样本定位到包含其真实群体和邻近群体的两个群体中，这可能是相邻地理距离的群体间遗传差异较小造成的，通过此法能够对穗菝葜样本进行初步鉴定。

(2)通过穗菝葜种质资源鉴定框架进行鉴定

对上述的10个穗菝葜样本，用47对SSR引物按照步骤5和步骤6进行等位基因分型。将等位基因矩阵加入到步骤6中的穗菝葜种质资源鉴定框架中，利用MEGA 6软件进行聚类，构建UPGMA遗传距离树(见附图2)，分析鉴定效果。

鉴定效果分析，查找X-1～X-10的来源信息，具体信息见表8。

表8验证样本信息及验证效果统计表

经过鉴定效果统计，10份样本中，有7份样本是能够准确鉴定其群体来源，成功率为70％；另外3份样本也未远离其真实群体，其遗传距离聚类与其真实群体靠近。

综上所述，采用上述(1)(2)两种鉴定方法组合的方式，被鉴定样本准确率将提升至70％，同时未能确定具体群体来源的样本也被鉴定到与其真实群体地理相邻的群体。说明本发明基于穗菝葜转录组开发的47对SSR引物组合、SSR遗传信息特征库、种质资源鉴定框架及两种鉴定方式能够有效确定穗菝葜样本的种质资源来源，将能有效地应用于未知样本的鉴定，同时本发明的方法快捷，结果准确、可靠，可为将来穗菝葜植物的种质资源鉴定带来便利。

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TCCCCATTTCTCCTCACTTG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GCCACTACAACAACTTAGTGATTTTG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GCCCACTTTCATTGCCTTTA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AATGTGGGCGTGGTAAAAAG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AAAGGGGATGAGGAGAAGGA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AAACCACCATGACTCCTCCA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTGCTTCCAGACAGAGGAGG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ACACTTCTTGGGTTGGCATC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GAGTGAGGAGGGAGGAGCTT

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CCGGAGAACCAGATGAAGAC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AGAACTTGAGGGTGTGTGGG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TTCATGCATACTTTTGCCGA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TAATCCCTCGCGAAATCAAG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CCCAAAATCGATCGAGAAAA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AAGCCAAGCAAACCCATTTA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CACCCTCTGACTCCGAAGAG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CAGGGAGTTGGTCCTCAAAA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ATGGTTGCAAAGAAACACCC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTAAGGCGATATCCTCAGCG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CAGCCACTTGGTATCCACCT

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AAGGGACATTTTTGTTCCCC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GCAAGTTAAGCAACACAGTTAAGG

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

AGATCCACAGTTCCACCTGC

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

GCGCTTGATGTGCTCAAATA

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

GATCTGGGTTTCTCGTTGGA

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

GGCCATTTGGAAGAGACTGA

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

GAGATTTCCAGCAAAACCCA

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

AGTTTCTGGGCCCTCTGTCT

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

CCATGGTGGACGACTTTCTT

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

GCATGGAAACGCCTATGATT

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

CTTGGCAACACCAATCAATG

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

TGCACGTGATCACTGGATCT

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

CATTTCGATGAATCGTGTGG

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

GTAGGGTTCGGTGCTGATGT

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

TCGATTTCCACCCATTTCTC

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

GCTGAGTACTTGAGGGCGTC

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

CAGTGCCTCTTCCTTGCTTC

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

TATACCCAGGTCTCCGAACG

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ATTTCGCCACTACCTTGCAC

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ATCCTTCATTCAATGCCGAG

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

GGACTGGATTCCGTTTTGCT

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

AGCCAGGACATTGCCTTTAC

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

TGTTGGGTGAGCAAAACAAA

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ACCTTTCTCCCCACTTGCTT

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

TAATTGGCTTCGGATTGACC

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

GGAATTCGTTCTTCCCCATT

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

GGACTTGGTCATCAGGTCGT

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

TTGTGCAACCAAACTCCAGA

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

CACAAGCTTGATGAGGTCCA

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

AAGGACACGGACCATGAAAG

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

AGCAGCCTTGGGCTTATTTT

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

TTCTGTTGTGCGGATATTGG

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

GAAGGGAGGGAGGAGAAGTG

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

CCGTTTAAAGATCCCGTCAA

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

TGCTGGAAGAACAACGACTG

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

GTTACCGTTGGTCACCTGCT

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

TGGATTCATGTGTTTGGCTG

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

AAATCAGGCCTCCTCATTGTAA

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

CACCTTCTCCTCCTCTTCCC

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

TCATCTCCCCTCTTCTTCCC

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

CTGGAGATCTCACCCTCTCG

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

CAATGAGACAGTCCGGATCA

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

AATTGGGATTTGATGATCGC

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

CCAAAAACCCACGAGAGAAA

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

GCTGGTACTTCTTCTTGCCG

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

ACTTCGAGAACAGCCTCCAA

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

CCCTTCTCTCCTCCCATTTC

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ACGCTGATGACCTGCTTCTT

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

TCACGTGTGAGGTTCTAGCG

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

TGGCGTCCCAGTGAGTGT

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ACGTAACTCTCGGTGCCATC

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

CGTGTGGAAGGGAGGTAAAA

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ATGACATCCCCTCCCTCTCT

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

CCCCACCATTGTCTTGAAGT

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

AGGCCAAGACTATCAGCGAA

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

TCTTTCTTGCTCCAGGCATT

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

GGGAACACTACCTTCTGCCA

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

TTGAGATCTGGGGAGGTTTG

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

TGTGGTGCTTGATGAGCTTC

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

CGTTGCACAGAGCGAATAAA

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

CTTCTCCGCATACCACCTGT

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

GCTCTGCGTCTGTTCCATTT

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ATGCTTGACACGCTTGATTG

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

AGCTGCTTGGACAGCAAAAT

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ACGGTCTCTTTCAAGAAGGG

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

GATGAAGGAGAACGCAAAGC

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

GAGAGCCCACGTGAAGTGAT

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

CCCCATAAATGTGGGAGATG

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

GCAAAGCTCTTCTCCTCCCT

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

CTGGATGGCTTTGGATAGGA

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

GACCCCATGGATACGAGAAC

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

CTAAACCCGACTCCCCAAAT

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

AGAACCAGCAGAGCGACATT

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

TTGCGTCAGCTTACCCTTCT