净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及复合亲和柱

摘要

本发明涉及净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及复合亲和柱。所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的伏马毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的伏马毒素抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞株Fm7A11已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学。装载有权利要求1所述的伏马毒素B

说明书

技术领域

本发明涉及一种净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及复合亲和柱。

背景技术

伏马毒素是由镰刀菌属在一定的温度和湿度下产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物。伏马毒素能在较低的浓度范围内干扰植物正常生理功能，是对植物代谢有毒害作用的非酶类化合物，属于真菌毒素和非寄主专化型毒素。主要分布在以玉米、高粱、小麦为主的农作物上，可造成秧苗枯萎，根、茎、种子腐烂等农业经济损失。伏马毒素对畜禽和实验动物可引起各种具有特异性的毒理作用，如马、兔的脑白质软化症，其表现为:神经性中毒，意识障碍、失明和运动失调等症状，严重者甚至造成死亡。还可造成猪的肺水肿和水胸，肝脏和食道损伤"伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化，鼠、羔羊、小牛的肝细胞凋亡和肾毒性，还有肝毒性和致癌效应，给畜牧业带来严重经济损失。

黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。根据在紫外照射下荧光发生的不同，天然产生的黄曲霉毒素分为两大类，即B族(荧光为蓝色，blue)和G族(荧光为绿色，green)，B族包括黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素B2(AFB2)，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生，G族包括黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)，主要由黄曲霉菌产生。黄曲霉毒素广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中,具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用。而黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最强，其作用的靶器官主要是肝脏，被公认为致肝癌物质，长期食用含有低水平黄曲霉毒素食物的人其肝脏也将受到损害。国际癌症中心将其定为一类致癌剂。

赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素，可分为A和B两种类型，A的毒性较大。赭曲霉毒素在4℃的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉毒素。动物摄入1ppm体重剂量的赭曲霉毒素A可在5～6天致死。常见的病变是肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含1ppm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。

玉米赤霉烯酮又称F-2毒素,它首先从有赤霉病的玉米中分离得到.玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属的菌侏,如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌.玉米赤霉烯酮主要污染玉米,小麦,大米,大麦,小米和燕麦等谷物,其中玉米的阳性检出率为45％,最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％,含毒量为0.364～11.05mg/kg.玉米赤霉烯酮的耐热性较强,110℃下处理1h才被完全破坏.玉米赤霉烯酮具有雌激素作用,主要作用于生殖系统,可使家畜,家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症.妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产,死胎和畸胎.食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状,如恶心,发冷,头痛,神智抑郁和共济失调等。

目前，伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等这些真菌毒素检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法(ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。薄层层析法要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量。由于采用了先进的生物技术，该方法可以检测出伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量，而不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷。因此，当务之急，要制备出性能稳定的免疫亲和柱，并建立一种经济，快捷，精确，安全的试验方法。

发明内容

为了解决现有技术中检测伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮亟需性能稳定的免疫亲和柱的问题，本发明提供了一种净化伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱及其制备方法与应用。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案是：

伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮抗体免疫吸附剂，所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的伏马毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的伏马毒素抗体为由保藏编号为CCTCC>

按上述方案，所述固相载体为琼脂糖凝胶。

装载有伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮抗体免疫吸附剂的净化伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱。

净化伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱的制备，包括：

a)基质制备

将CNBr活化的琼脂糖凝胶基质粉末在pH2-3的条件下用HCl洗涤除杂；CNBr活化的琼脂糖凝胶是以冻干形式提供。在与目的配体偶联前在低pH(pH2-3)条件下用HCl洗涤予以洗去这些添加剂。

b)配体偶联

使用偶联缓冲液溶解待偶联的伏马毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素B1单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到上述抗体溶液中，室温条件(20-25℃)下充分混匀上述混和物2-4h；

c)配体封闭

封闭所有残留的活性基团；

d)除去偶联后未偶联上的多余的配体；

e)装柱。

按上述方案，所述步骤a)中洗涤用HCl浓度为1mmol/L，洗涤时间为15min。

按上述方案，步骤b)中的偶联缓冲液为0.2mol/L Na₂HCO₃，pH8.3，每个抗体溶液浓度为10-15mg/mL。

按上述方案，步骤c)的配体封闭过程为：转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/LTris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h。

按上述方案，步骤d)为：依次用pH值为4和pH值为8的缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；pH值为4和pH值为8的缓冲液分别可选0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液。

按上述方案，步骤e)为用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

上述赭曲霉毒素A抗体可选由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生的单克隆抗体。玉米赤霉烯酮抗体可选由保藏编号为为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生的单克隆抗体。所述的伏马毒素抗体可选由保藏编号为CCTCCNO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体；上述黄曲霉毒素抗体可选黄曲霉毒素通用单克隆抗体，如为由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的黄曲霉毒素通用单克隆抗体。

在此基础上本发明建立了免疫亲和柱净化-液质联用法检测伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的方法，当含有伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂会特异性的吸附伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，洗脱流速1mL/min～2mL/min，将伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮从柱子中洗脱下来，样品即得到了很好的净化，由此收集的洗脱液供高效液相色谱-质谱联用仪检测用；

基于上述复合亲和柱检测伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的方法，将含有伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂会特异性的吸附伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，收集洗脱液即净化浓缩后的样品供高效液相色谱-质谱联用仪检测，得各毒素含量；

高效液相色谱-质谱联用仪条件：

a流动相：A，0.05％甲酸/水溶液；B，0.05％甲酸/乙腈溶液；

b梯度洗脱：0-3min,15％-50％B；4-5min,50％-70％B；6.5-8min,70％-100％B；8-10min,100％-50％B；10-11min,50％-15％B；11-15min,15％B.

c色谱柱：C-18柱；

d流速：200μL/min；

各种毒素检测的质谱扫描参数如表1所示

表1各种毒素的扫描参数

具体定量方法可采用如下方式：用进样器吸取不同浓度的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准工作液注入高效液相色谱-质谱联用仪，在上述条件下测定标准溶液的峰面积，绘制各种毒素的标准曲线，然后利用外标法标算出各毒素的含量。

按上述方案，所述的洗脱流速1mL/min～2mL/min，

本发明的有益效果：本发明制备的亲和柱可以用于伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的高效液相色谱-质谱检测，其性能稳定。通过使用本亲和柱建立了一种经济，快捷，精确，安全的检测方法，可同时用于这几种毒素样品的净化，七种之间无相互干涉影响。

附图说明

图1为伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的质谱色谱图；(从上到下依次是：玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1。

具体实施方式

实例一：

实施例1黄曲霉毒素通用单克隆抗体的获得

黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，具体根据授权号为ZL 201010245095.5的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集小鼠的腹水，纯化处理后获得黄曲霉毒素通用B单克隆抗体。其中，纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的黄曲霉毒素通用单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得；

实施例2赭曲霉毒素A单克隆抗体的获得；

赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，具体根据申请号为201310115921.8的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株1H2注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化即得赭曲霉毒素A单克隆抗体。所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的赭曲霉毒素A单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；

实施例3玉米赤霉烯酮单克隆抗体的获得

玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生，具体根据申请号为201310115825.3的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株2D3注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化即得玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；

实施例4杂色曲霉毒素单克隆抗体的获得

杂色曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生，具体根据申请号为201410115952.8的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株ST03注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的Balb/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化后得到杂色曲霉毒素单克隆抗体。所述的纯化为辛酸-硫酸铵纯化法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的杂色曲霉毒素单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得。

实施例5伏马毒素B1单克隆抗体的获得

杂交瘤细胞株Fm7A11的筛选

1.抗原合成及动物免疫

购买市售的伏马毒素B₁标准品进行完全抗原合成，具体合成步骤如下:将2mg的FB₁标准品粉末与2mg的EDC分别溶于500μL的0.01mol/LPBS溶液，得到EDC溶液和FB₁溶液，将4mg/mL(溶液为0.01mol/LPBS)的EDC溶液逐滴加入溶解好的FB₁溶液中，室温下轻轻搅拌10分钟。将5mg/mL(溶液为0.01mol/LPBS)的BSA溶液逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌反应4小时。透析3天。最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明FB₁-BSA完全抗原制备成功。

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫实验室合成的伏马毒素完全抗原FB₁-BSA。第一次免疫将伏马毒素完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的伏马毒素完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三次与第四次免疫分别与上一次免疫间隔两周，免疫方式与第二次相同。四次免疫剂量相同，仅为100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前量的2倍。

2.细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死待融合小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，1200rpm，离心5min。弃去上清，控干，加入1mLPEG，融合1分钟，缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，弃上清，沉淀即为融合细胞，用20mL完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。

所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗伏马毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用伏马毒素B₁作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株Fm7A11。

抗伏马毒素B₁单克隆抗体杂交瘤细胞株Fm7A11抗体可变区序列测定

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株Fm7A11的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCA GTGGAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer),其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCGTTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长379bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由126个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长348bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由116个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。

5.抗伏马毒素B₁单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将实施例1获得的抗伏马毒素B₁单克隆抗体杂交瘤细胞株Fm7A11注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗伏马毒素B₁单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株Fm7A11分泌的抗伏马毒素B1单克隆抗体的亚型为IgG2b。

用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到3.2×10⁵，即抗体稀释3.2×10⁵倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对伏马毒素B₁灵敏度为0.32ng/mL。对伏马毒素B₂、B₃的交叉反应率为4.3％和12.8％。与黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素的交叉反应率均小于0.1％。

实例二：

伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮复合免疫亲和柱的制备

1.基质制备

称取所需1gCNBr活化的琼脂糖凝胶(Sepharose)冻干基质粉末(每克冻干基质粉末可形成3.5mL终体积的溶胀基质)，溶于1mmol/L HCl中。基质将会立即溶胀，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min。

2.配体(抗体)偶联

a使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的上述伏马毒素B₁抗体、黄曲霉毒素抗体、赭曲霉毒素A抗体和玉米赤霉烯酮抗体，抗体浓度为12.5mg/mL，溶解的抗体置于冰浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联缓冲液。迅速将CNBr活化的Sepharose转移到抗体溶液中。室温条件(20-25℃)下充分混匀上述的混和物2-4h。

b偶联率的计算：2,000rpm离心，将sepharose离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，测定上清液的蛋白质含量值。计算偶联率为98.5％(说明偶联很成功)。取离心至管底的sepharose，使用偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体。

c封闭：转移基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中。室温条件下静置2-4h，封闭所有残留的活性基团。

d为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用pH值为4和8的缓冲液即0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对基质进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。每个洗涤循环步骤：先用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液进行洗涤。

e用5倍胶体积的0.01％NaN3-PBS洗涤，并使用0.01％NaN3-PBS保存。

3.装柱使用结合缓冲液制备浆液，以75％沉降基质和25％磷酸盐缓冲液(pH7.0)的比例进行混合。以连续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作，使用pH7.0的PBS缓冲液加入充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN3-PBS过柱，并使用0.01％NaN3-PBS保存，至此伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮亲和柱已装填并平衡完毕，可直接供使用。

实例三：大米中的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测

1.0大米中的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测。

大米添加回收实验，分别添加500μg/kg，1000μg/kg，2000μg/kg三个浓度梯度的伏马毒素B₁和10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三个浓度梯度的黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。每个实验做五组平行试验。

三个梯度：

第1个实验添加量：500μg/kg伏马毒素B₁、10μg/kg黄曲霉毒素B₁、10μg/kg黄曲霉毒素B₂、10μg/kg黄曲霉毒素G₁、10μg/kg黄曲霉毒素G₂、10μg/kg赭曲霉毒素A、10μg/kg玉米赤霉烯酮。

第2个实验添加量：1000μg/kg伏马毒素B₁、20μg/kg黄曲霉毒素B₁、20μg/kg黄曲霉毒素B₂、20μg/kg黄曲霉毒素G₁、20μg/kg黄曲霉毒素G₂、20μg/kg赭曲霉毒素A、20μg/kg玉米赤霉烯酮。

第3个实验添加量：2000μg/kg伏马毒素B₁、50μg/kg黄曲霉毒素B₁、50μg/kg黄曲霉毒素B₂、50μg/kg黄曲霉毒素G₁、50μg/kg黄曲霉毒素G₂、50μg/kg赭曲霉毒素A、50μg/kg玉米赤霉烯酮。

大米中伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的提取：

准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样20.0g于均质机中，加入100mL乙腈/水/甲酸(80+18+2)，均质高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取5.0mL滤液并加入15.0mLPH7.0PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清。将复合免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过复合免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL～3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.0高效液相色谱-质谱条件

a流动相：A，0.05％甲酸/水溶液；B，0.05％甲酸/乙腈溶液

b梯度洗脱：0-3min,15％-50％B；4-5min,50％-70％B；6.5-8min,70％-100％B；8-10min,100％-50％B；10-11min,50％-15％B；11-15min,15％B.

c色谱柱：C-18柱(柱长50mm，内径2.1mm，填料直径1.7μm)

d流速：200μL/min

e各种毒素检测的质谱扫描参数如表1所示。

3.0定量

用进样器吸取不同浓度的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准工作液注入高效液相色谱-质谱联用仪，在上述条件下测定标准溶液的峰面积，绘制各种毒素的标准曲线，然后利用外标法标算出各毒素的含量。

4.0结果

大米加标回收率结果都在85-105％之间，RSD均小于10％。结果表明该方法完全满足大米中伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮检测的分析要求。结果分别见表1-表7。

表1大米中伏马毒素B₁添加回收率结果

表2大米中黄曲霉毒素B₁添加回收率结果

表3大米中黄曲霉毒素B₂添加回收率结果

表4大米中黄曲霉毒素G₁添加回收率结果

表5大米中黄曲霉毒素G₂添加回收率结果

表6大米中赭曲霉毒素A添加回收率结果

表7大米中玉米赤霉烯酮添加回收率结果

实例四：食用油中的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测

1.0食用油中的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测

食用油加标回收实验，分别添加500μg/kg，1000μg/kg，2000μg/kg三个浓度梯度的伏马毒素B₁和10μg/kg，20μg/kg，50μg/kg三个浓度梯度的黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。每个实验做五组平行试验。

食用油中伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的提取：

植物油液态样品提取：准确称取5.0g植物油试样于50mL离心管中，加入15.0mL70％甲醇水溶液，漩涡混合器，振荡混匀2min，5 000r/min离心2min，移取10.0mL甲醇溶液层，用20.0mL水稀释，混合器混匀，经玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清。将复合免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过复合免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL～3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.0高效液相色谱-质谱条件

a流动相：A，0.05％甲酸/水溶液；B，0.05％甲酸/乙腈溶液

b梯度洗脱：0-3min,15％-50％B；4-5min,50％-70％B；6.5-8min,70％-100％B；8-10min,100％-50％B；10-11min,50％-15％B；11-15min,15％B.

c色谱柱：C-18柱(柱长50mm，内径2.1mm，填料直径1.7μm)

d流速：200μL/min

e各种毒素检测的质谱扫描参数如表1所示。

3.0定量

用进样器吸取不同浓度的伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准工作液注入高效液相色谱-质谱联用仪，在上述条件下测定标准溶液的峰面积，绘制各种毒素的标准曲线，然后利用外标法标算出各毒素的含量。

4.0结果

植物油添加回收率结果都在85-105％之间，RSD均小于10％。结果表明该方法完全满足大米中伏马毒素B₁、黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮检测的分析要求。结果分别见表8-表14。

表8植物油中伏马毒素B₁添加回收率结果

表9植物油中黄曲霉毒素B₁添加回收率结果

表10植物油中黄曲霉毒素B₂添加回收率结果

表11植物油中黄曲霉毒素G₁添加回收率结果

表12植物油中黄曲霉毒素G₂添加回收率结果

表13植物油中赭曲霉毒素A添加回收率结果

表14植物油中玉米赤霉烯酮添加回收率结果

序列表

＜110＞中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及复合亲和柱

＜160＞4

＜210＞1

＜211＞379bp

＜212＞DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 1

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag50

cctgtccatc acttgcactg tctctgggct ttcattaacc agctatggtg100

tacactgggt tcgtcaggcc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta150

atttggggtg gtggaaacac aaattataat tcggctctca tgtccagact200

gagcatcagc aaagacaact ccaggagcca agttttctta agaatgaaca250

gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact attgtgccag aggcaggatg300

gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcgtcag ccaaaacgac350

acccccatct gtctatccac tggcccctg 379

＜210＞1

＜211＞348bp

＜212＞DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 2

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga50

aagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattagt agctatttag100

gctggttaca gcagaaacca gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt150

gcaaacacat tggtagaagg ggtcccatcc agattcagtg gcagtggatc200

tggggaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat gaagatatgg250

gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg300

gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatcc348

＜210＞1

＜211＞126

＜212＞PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 15

Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr 30

Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 45

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 60

Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg 75

Ser Gln Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr 90

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln 105

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 120

Val Tyr Pro Leu Ala Pro 126

＜210＞1

＜211＞116

＜212＞PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 4

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu 15

Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser 30

Ser Tyr Leu Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys 45

Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 75

Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln 90

Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 105

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 116