一种Smad4蛋白可结合DNA片段及在Smad4活性检测中的应用

摘要

本发明涉及一种Smad4蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个Smad4蛋白结合框；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内Smad4转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内Smad4的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析Smad4作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种Smad4蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内Smad4转录调控活性中的应用。

背景技术

Smad4是从染色体18q21.1分离出的一个肿瘤抑制基因，其编码的Smad4蛋白属于SMAD信号转导家族中的一员，是一类在真核生物中分布广泛的多功能转录调节因子，参与了转化生长因子TGF-β超家族细胞内信号传导过程，在基因转录水平的调控中发挥至关重要的作用，并参与多种生物学功能的调控。

Smad4蛋白由进化上高度保守的N末端MH1、C末端MH2结构域以及中间富含脯氨酸的高变连接区组成，Smad4蛋白可与其他种类的SMAD蛋白结合形成SMAD复合物，协同调节靶基因的转录，控制肿瘤细胞生长、分化及凋亡；还可通过结合DNA来发挥其生物学功能。Smad4作为转录调节因子的作用十分关键，TGF-β/Smads信号转导途径的异常可引起疾病的发生或肿瘤的形成。Smad4的缺失和突变可以导致胰腺癌、幼年息肉样综合征、遗传性出血性毛细血管综合征等重大疾病；Smad4基因沉默、活性位点突变等有可能促进裸鼠移植瘤增殖和微血管形成。Smad4表达水平的变化会影响疾病的发生发展，因此有可能作为研究这些疾病的病理学发展过程的标志之一。

目前，对Smad4的检测主要依靠Western Blot或者qRCR等技术。这类技术虽然灵敏度高，但检测到的只是Smad4蛋白含量的差异，并不能直接体现其结合到靶序列后活性的改变。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内Smad4转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，Smad4蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为5’-CAGAC-3’。

基于以上研究，本发明提供了一种Smad4蛋白可结合的DNA片段，其包含多个Smad4蛋白结合框，所述Smad4蛋白结合框的序列包含5’-CAGAC-3’，并且还包含一段富GC序列。每两个相邻的Smad4蛋白结合框之间具有间隔序列，并且所述间隔序列为AT。用多个结合框可提高Smad4蛋白的识别和结合效率，提高灵敏度。得到的DNA片段序列如SEQ ID NO:1所示。在研究过程中，我们试验了多种组合，结果发现该序列的DNA片段比其他组合方式对Smad4蛋白的结合效率更高。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内Smad4转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内Smad4转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内Smad4转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为衡量Smad4转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将Smad4转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与HindIII位点之间得到。

优选地，所述对照质粒为phRL-TK。

优选地，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

优选地，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量Smad4转录调控活性的指标。

通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内Smad4的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析Smad4作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为Kpn I与Hind III对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染了pGL3.0-Smad4-Luc后再分别转染pcDNA3.1(+)-Smad4和pcDNA3.1(+)空载体的人胃细胞系SGC-7901、人前列腺癌PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa细胞中的相对Smad4活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建Smad4蛋白可结合的DNA片段

发明人对Smad4进行研究分析，发现Smad4蛋白结合的DNA序列为5’-CAGAC-3’。合成该DNA核心序列时，将这段DNA核心序列重复三次，并且在每段核心序列的5’端都连接富GC序列，以AT碱基进行间隔，其序列如SEQ ID NO:1所示，并连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入Kpn I酶切位点的粘性末端(CATGG)，在3’端加入Hind III酶切位点的粘性末端(TTCGA)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如SEQ IDNO:2和3所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含Kpn I酶切位点粘性末端和Hind III酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下：Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，设置PCR仪程序进行退火反应。DNA退火结束后可于﹣20℃冻存备用，或也可用于连接反应。如果退火结束后打算进行酶切反应，最好用纯化试剂盒进行纯化。

2.将Smad4蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述pGL3.0-Basic空载体进行双酶切，20μl 酶切体系如下：10x QuickCut Greenbuffer 2μl，Kpn I 1.5μl，HindIII1.5μl，pGL3.0-Basic空载体6μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，37℃酶切反应120分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒酶切情况判断是否酶切完全，切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为D0251)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链DNA连接至pGL3.0-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：DNA连接酶(购自TAKARA公司，货号为6022)5μl，双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将DNA片段与载体的摩尔比控制在8:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于PCR仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有Smad4蛋白结合的DNA片段的pGL3.0-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α,置于冰上解冻2-3分钟，分成3管，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育15-20分钟，42℃热激60秒，迅速放至冰上静置2-3分钟，然后加入500μl不含抗生素的LB液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时。取复苏后的菌液100μl均匀涂布于含氨苄青霉素抗性的LB固体选择培养基中，吸收10分钟后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中过夜。次日挑取单菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经37℃200转/分钟，摇菌12小时后提取质粒。

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道2、3和5显示为阳性克隆)。阳性质粒送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pGL3.0-Basic载体上。至此，含有Smad4蛋白结合的DNA片段的pGL3.0-Basic表达载体(以下均表示为pGL3.0-Smad4-Luc)构建成功。

3.pGL3.0-Smad4-Luc转染细胞

本发明实施例采用SGC-7901、人前列腺癌PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为TF20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，Neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pGL3.0-Basic空报告基因质粒、pGL3.0-Smad4-Luc(含有Smad4蛋白的核心DNA结合位点序列的pGL3.0-Basic报告基因质粒)、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的质粒)、pcDNA3.1(+)-Smad4(Smad4过表达质粒)。

4.计算Smad4的活性

将pGL3.0-Smad4-Luc重组质粒转染至细胞中，然后分别将pcDNA3.1(+)-Smad4(Smad4过表达质粒)和空载体导入细胞中，检测Smad4报告基因系统的活性。

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算Smad4活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xPBS清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。加入配制好的细胞裂解液，用移液器轻轻吹打几次，促进细胞充分裂解，室温放置5-10分钟后用来检测。萤火虫荧光酶的活性测定：取100μl Luciferase Assay Reagent加入测试管底部，加入20μl待测样品，轻轻混匀后，放入仪器进行检测。海肾荧光素酶活性测定：取100μl稀释好的Stop Reagent加入上述步骤的测定管中，混匀后，放入仪器进行检测。

测定结果如图2所示，外源导入Smad4后，阳性处理组(转染pcDNA3.1(+)-Smad4)荧光活性明显高于对照组(转染pcDNA3.1(+)空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种Smad4蛋白可结合DNA片段及在Smad4活性检测中的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtggggcagc catctatctc gggcagacat ccatgtcatt cagacttat 49

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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