一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法

摘要

本发明公开了一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法，包括以下步骤：仪器与试剂的准备；制备含铁氧化物纳米颗粒基质；制备外泌体样品，分别取不同比例稀释后的外泌体样品点样在靶板上，室温下干燥；在外泌体样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；进行质谱检测并对质谱检测结果进行分析，得出结论。该方法采用微纳颗粒材料作为基质，能够在质谱分析中快速、高效的使用极少量的生物样品实现待测分子的定性与定量检测；同时可以去除传统基质的背景干扰和热点效应，实现外泌体样本中代谢分子的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，尤其涉及一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测外泌体小分子代谢物的方法。

背景技术

外泌体是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。外泌体有很多重要的功能，例如执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。外泌体也运输核酸，参与细胞间通讯。总之，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的代谢小分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。目前，对外泌体的分析方法主要是涉及蛋白、多肽和基因，而代谢分子的检测与分析仍然存在很大的研究空缺。传统的分析方法如生化法和电喷雾电离质谱(ESI)因为其繁杂的样品预处理方法难以实现对于小分子快速高效的检测。同时，现在普遍使用的方法中单次检测通常需要毫升级别的样品量，这对于小分子的检测都带来了极大的障碍。故我们采用基质辅助激光解析电离质谱(MALDI)，MALDI作为一种新型的软电离生物样品分析方式，能够对不同分子量级别的物质进行分析。它代表了一种简单，快速，精准的方式，能够同时对多种生物分子进行检测。这种方法的有效性不仅在理论上，也在实际应用中得到了应证。但传统的基质容易在小分子量端(m/z<1000)产生背景噪声，对于小分子的检测带来极大的干扰。且在实际的生物体系当中，生物样品通常十分复杂。各种生物大分子的存在，以及不同的酸碱度，含盐量都会对小分子的检测带来阻碍。因此传统的基质难以满足对于小分子检测的需求，一种新型的可以用于生物体系检测，且具有一定的抗干扰和一定的耐盐性的基质材料亟待开发。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新型的基于颗粒辅助的质谱检测技术。通过采用微纳米级的颗粒材料作为基质，克服传统基质的缺陷，快速、高通量、高灵敏度地定量外泌体中待测分子。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法，包括以下步骤：

步骤1：仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，正离子模式检测，只有信噪比大于10的质谱信号用于定性和定量分析；

步骤2：制备含铁氧化物纳米颗粒基质，含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：

2.1：将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

2.2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

2.3：反应在铁氟龙高压反应釜中进行，150-195摄氏度条件下反应8小时以上，从而形成含铁氧化物纳米颗粒；

2.4：将步骤2.3中得到的含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～70摄氏度下干燥以备使用；

2.5：将含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中，作为基质使用；

步骤3：提取外泌体，将稀释后的外泌体样品点样在靶板上，室温下干燥；

步骤4：在外泌体样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；

步骤5：对步骤4中得到的外泌体样品进行质谱检测；

步骤6：对质谱检测结果进行分析，得出结论。

进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的直径小于1μm，颗粒粒度均一，含铁氧化物纳米颗粒基质具有粗糙表面。

进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质为Fe_xO_y或其混合物,其中x为小于等于10，y为大于等于0小于等于10。

进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的尺寸范围为200nm～300nm。

进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成。在性能方面，该含铁氧化物颗粒具有紫外吸收。

更进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的粗糙表面由直径为5nm～8nm的纳米小球组成。

进一步地，对外泌体的稀释倍数小于10000倍以得到外泌体样品。

进一步地，外泌体包括血清，血浆和细胞中提取的外泌体。

进一步地，检测分子量范围为小于等于10000Da。

进一步地，检测的分子包括糖类和氨基酸。

本发明的有益效果在于：微纳米级的含铁氧化物颗粒基质制备成本低，可以大批量制作，合成步骤简单；该微纳米级的含铁氧化物颗粒基质能够去除传统基质的背景干扰和热点效应，具有高耐盐性。本发明只需消耗痕量外泌体，在无需富集、分离操作的前提下即可快速、高效地定量检测分析外泌体中的代谢物；整个检测过程步骤简单、成本低、通量高；所获得的定量结果准确度高，可应用于临床中。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1为本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物颗粒的表征图片，图1a为SEM表征图片，图1b为TEM表征图片；

图2为具体实施例1中激光解析电离技术检测由血清提取的外泌体中代谢小分子的质谱图。▲表示尿素，表示乳酸，●表示半胱氨酸，■表示甘露醇；

图3为具体实施例2中激光解析电离技术检测由细胞提取的外泌体中代谢小分子的质谱图。▲表示尿素，表示乳酸，示缬氨酸，示精氨酸，示葡萄糖。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：

步骤1：将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

步骤2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

步骤3：反应将在铁氟龙高压反应釜中进行，在150-195摄氏度下反应8小时以上，形成含铁氧化物纳米颗粒；

步骤4：将步骤3中得到的含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～70摄氏度下干燥以备使用；

步骤5：将含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中，作为基质使用。

基质的表征：

表征所用仪器有：表征所用仪器有：采用JEOL JEM-2100F仪器获得透射电镜图片、高分辨透射电镜图片以及选区电子衍射花样；采用硅片制备扫描电镜样品，并通过Hitachi S-4800仪器获得扫描电镜图片；

表征结果为：

所获得的颗粒材料为球形，尺寸大小约为250 nm。如图1所示，通过透射电镜图片可以看出，颗粒材料具有亚单元结构，并且通过选取颗粒材料边缘区域获得高分辨率透射电镜图片也可以看出，规整的晶格图形进一步证明颗粒材料是由很多纳米晶体组成。根据测得的扫描电镜图片，可以看出颗粒材料表面呈现粗糙状，并且尺寸均一。以上结构是成为良好的生物分子质谱检测的基质材料的重要条件。

下面通过几个典型的应用实施例来进一步阐明基质辅助激光解析电离质谱在外泌体代谢分子的检测分析中的应用。

实施例1：血清提取的外泌体中代谢小分子的检测

(1)仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱仪，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM>

(2)制备含铁氧化物纳米颗粒。

(3)取1ml～10ml血清，15000-25000G转速下超高速离心4～10小时提取外泌体，配置0.1mg/ml～10mg/ml浓度的外泌体溶液。

(4)依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1.5小时。

(5)含铁氧化物纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散，与外泌体溶液混合，点样于干燥的MALDI靶板。

(6)样品干燥后，用激光解析离子化质谱检测。

结果如图2所示。

实施例2：细胞提取的外泌体中代谢小分子的检测

(1)仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱仪，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM>

(2)制备含铁氧化物纳米颗粒。

(3)取1ml-10ml细胞溶液(对各种类型的细胞适用)，15000-25000G转速下超高速离心4～10小时提取外泌体，配置0.1mg/ml～10mg/ml浓度的外泌体溶液。

(4)依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1.5小时。

(5)含铁氧化物纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散，与外泌体溶液混合，点样于干燥的MALDI靶板。

(6)样品干燥后，用激光解析离子化质谱检测。

结果如图3所示。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。