昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在害虫防治中的应用

摘要

本发明公开了昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在害虫防治中的应用。本发明采用瞬时RNAi对斜纹夜蛾和家蚕

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在鳞翅目害虫防治中的应用。Dnmt1调控昆虫幼虫生长，从而围绕昆虫Dnmt1开展转基因或抑制剂研发，达到害虫防治的目的。

背景技术

DNA甲基化作为一种普遍存在于真核生物中重要的表观遗传修饰，对生物生长发育的调控具有重要作用。近年来，随着DNA甲基化研究方法的不断改进和创新，特别是大规模测序技术的飞跃发展，使得从整个基因组水平测定和分析甲基化谱成为可能，有关昆虫的甲基化研究取得了一定的进展和成果。已报道的功能主要涉及到调节胚胎发育、基因印迹、翅的分化、性别决定和抗药性形成等， 较多的研究报道集中在蜜蜂分化为工蜂和蜂王中其幼虫与成虫的DNA甲基化基因的分析， 而作为农业害虫主要所在的鳞翅目昆虫，一直被认为其DNA甲基化率较低，对生长发育的影响不是很重要，仅有的家蚕卵注射DNMT>

在细胞中，DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化完成。DNMTs可依据活性的不同进行分类，在哺乳动物中，DNMTs 的作用可分为从头合成甲基化和维系甲基化两类。具初始合成功能的DNA甲基化酶类以DNMT3蛋白质家族为代表，负责基因组中新的甲基化模式的产生，而具维系现状功能的DNA甲基化酶类以DNMT1 蛋白质家族为代表，负责复制过程中已有甲基化模式的维系。最近的研究表明DNMT2 蛋白质家族作用是对 tRNA进行甲基化。Mitsudome等人发现家蚕BmDNMT不仅可以和半甲基化的DNA结合起维持甲基化的作用，也可以和无甲基化的DNA结合，起到从头甲基化的作用，但它与无甲基化DNA的结合效率低于与半甲基化DNA的结合效率。

斜纹夜蛾（Spodoptera>）属鳞翅目夜蛾科斜纹夜蛾属的一个物种。农作物害虫。世界性分布。中国除青海、新疆未明外，各省（自治区）都有发现。幼虫取食甘薯、棉花、芋、莲、田菁、大豆、烟草、甜菜和十字花科和茄科蔬菜等近 300种植物的叶片，间歇性猖獗为害。家蚕是大部分农业害虫所属的鳞翅目模式昆虫，对它的研究将指导鳞翅目其他害虫的防治。

发明内容

本发明的目的在于提供昆虫甲基化转移酶Dnmt1的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

昆虫甲基转移酶Dnmt1作为害虫防治靶点的应用。

昆虫甲基转移酶Dnmt1的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

进一步的，所述Dnmt1的抑制剂为抑制基因Dnmt1表达的物质。

进一步的，所述抑制基因Dnmt1表达的物质为基因Dnmt1的RNAi序列。

进一步的，所述基因Dnmt1的RNAi序列选自SEQ>

进一步的，所述的昆虫为鳞翅目昆虫。

进一步的，所述鳞翅目昆虫为蚕、斜纹夜蛾。

进一步的，所述昆虫甲基转移酶Dnmt1的抑制剂为特异性抑制甲基转移酶Dnmt1活性的抑制剂。

一种防治虫害的质粒或载体，所述质粒或载体能够表达出特异性抑制或沉默昆虫基因Dnmt1的表达的RNAi序列。

一种提高植物防虫害的的方法，通过转基因技术，使植物体内表达能够特异性抑制或沉默昆虫基因Dnmt1表达的RNAi序列。

本发明的有益效果是：

1）Dnmt1是一种甲基转移酶，普遍存在于各种原核及真核动植物。我们采用瞬时RNAi对斜纹夜蛾和家蚕Dnmt1的研究发现，Dnmt1调控鳞翅目昆虫的生长发育，如果幼虫期抑制Dnmt1的表达，昆虫出现发育不良、生长缓慢和死亡等症状。基于此，本发明首次提出可以将抑制Dnmt1表达的抑制剂用于杀虫剂的制备中。本发明首次发现家蚕和斜纹夜蛾Dnmt1被干扰后，虫体明显变小，幼虫死亡率增加（但并不是马上全部杀死幼虫）。这说明Dnmt1被干扰后虫体生长延缓，不正常，进食减少，可实现对害虫生长、数量的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。

2）本发明通过PCR实验发现，家蚕的Dnmt1在其幼虫和变态发育时期皆有表达。基于害虫防治主要在幼虫，我们选择在家蚕五龄幼虫注射Dnmt1>Dnmt1>

附图说明

图1为本实施例Dnmt1>dsRNA、已报道文献中Dnmt1>dsRNA分别与家蚕基BmDnmt1全长cDNA>

图2为家蚕BmDnmt1在不同发育时期的翅原基（左图）和脂肪体（右图）中mRNA水平分析，其中5L为5龄幼虫、W为游走期、PP为预蛹期、P为蛹期；

图3为家蚕五龄第1天注射BmDnmt1>

图4为SlDnmt1>

图5为SlDnmt1>SlDnmt1mRNA表达水平检测，图中dsGFP表示GFP>RNAi对照组，dsDNMT1表示SlDnmt1>

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1BmDnmt1被抑制表达的家蚕的表型

1）家蚕Dnmt1>

根据试剂盒T7 RiboMAX™ Express RNAi System（购自Promega公司）的说明书分别合成家蚕Dnmt1的dsRNA序列（SEQ>GFP的dsRNA序列（SEQ>Dnmt1dsRNA载体及空白对照载体，用于后续的RNAi干扰实验。

上述家蚕Dnmt1的dsRNA序列（SEQ>

5’-AUCAAGCUGGAGUUGCAGAAUGCAAGUGGGCUAUUGAAAACGUGGAAGCUGCUUCUCAUGCUUAUUCAUUAAAUAAUAAAAGUUGUAUUGUAUUUAAUGAAGACUGUAAUGCACUUUUGAAAACUGUAAUGUCUGGUGCUAAGCACAGCGCGAAUGGACUGCGGCUCCCCAUGCAAGGAGAAGUGGAGCUUUUAUGUGGCGGGCCACCAUGUCAAGGCUUCUCCGGAAUGAAUCGUUUUAAUUCAAGAGAGUAUUCAAACUUCAAAAACUCAUUAGUUGCAUCGUAUUUAUCGUUUUGUGAUUAUUACAGACCUAAAUAUUUUAUACUGGAAAACGUUCGUAACUUUGUGGCCUUUAA-3’（SEQ ID NO：1）。

GFP的dsRNA序列>

5’-UACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCAC-3’（SEQ ID NO：2）。

文献（Xiang H, Li X, Dai F, Xu X, Tan A, Chen L, Zhang G, Ding Y, LiQ, Lian J, Willden A, Guo Q, Xia Q, Wang J, Wang W. Comparative methylomicsbetween domesticated and wild silkworms implies possible epigeneticinfluences on silkworm domestication. BMC Genomics. 2013，23;14:646）中也涉及到了家蚕Dnmt1>dsRNA双链的设计和应用，但其所设计的Dnmt1>dsRNA序列与本实施例所用到的家蚕Dnmt1>dsRNA（SEQ ID NO：1）是两种完全不同的片段，文献中所述家蚕Dnmt1>dsRNA序列与BmDnmt1全长cDNA的序列比对图如图1A所示，本实施例家蚕Dnmt1>dsRNA（SEQ IDNO：1）与BmDnmt1全长cDNA的序列比对图如图1B所示，比对过程中，将dsRNA中的碱基U转换成T进行比对。从中可以看出该两个dsRNA>Dnmt1>

2）家蚕翅原基BmDnmt1表达谱分析

为了了解BmDnmt1是否在家蚕幼虫有表达，我们分别收集幼虫和变态时期的翅原基和脂肪体，进行分析。具体方法如下：

实验方法：

从5龄第一天大的家蚕开始，每天分别收集翅原基和脂肪体，按照TaKaRa公司RNAisoPlus总RNA提取试剂盒的说明进行总RNA提取，然后按照TAKARA公司的M-MLV RTase cDNASynthesis Kit试剂盒说明书进行cDNA的合成，接着进行定量PCR分析基因的表达量。

实验结果：

结果表明BmDnmt1在幼虫和变态时期的翅原基和脂肪体中都有表达，只是在幼虫转为蛹的过渡时期（游走期W和预蛹期PP）mRNA水平较低（图2）。

3）BmDnmt1RNAi虫体的表型

实验方法：

将五龄第1天的家蚕幼虫分成2组，即BmDnmt1>RNAi组（实验组）和GFP>BmDnmt1>RNAi组对虫体注射30>BmDnmt1>BmDnmt1进行RNAi；GFP>GFP>

实验结果：

在家蚕五龄第1天进行BmDnmt1>BmDnmt1>Dnmt1被干扰后，可实现对害虫生长、数量的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。

实施例2 Dnmt1被抑制表达的斜纹夜蛾的表型

1）斜纹夜蛾Dnmt1序列的获得

从我们的未发表的斜纹夜蛾进食芥菜的中肠表达数据库中，获得了斜纹夜蛾Dnmt1cDNA序列，再经PCR获得了cDNA，并测序验证正确。斜纹夜蛾Dnmt1>ORF序列为（SEQ ID NO：3）：

5’-ATGGATGAATATATAGAAACTAAACACCTACTAGATATTGAAATGGATGAATATATAGAAACTAAACACCAACTAGATATTAAAATGGATGAAAATGAAAACAATAATGTTATAGCGAAAACAAAACCAATTGTTCTTGACAATGAGAAATGTGAAACCTGTGGCCAATTTCTCAATAATTCAGATATAATTTTCTATCAAGGACACCCACAGAATTCAGTGGAAGAGTATATAGCATTGACTAATGAGAAACTTGTTCTAGCATCAGGTGAAGAGGGTGATATAATGGAAAGACCACAAACCAATATAACCAGTTTCTGTATATTTGACGAGCAAGGCCACCTGGTACCAATTGATGGTGGTCTTGTTGAAAACGATGTGTGTATTTATATGTCAGGATACTTGAAGTCAATATGCACAGATTCACCGGAAATTGATGATGAATCGGTCCCTGTGAAAGATGTAGGCCCTATTATTGAATGGTTCATACATGGCTTTGACGGTGGTGAGAAAAACTGTATCACATTATCAACAGAATTTGGAGAATATAATTTATTGAAACCAAGTGAACAATACACACCTCTTATGAACAACCTCTATGAAAAGATATGGCTCAGCAAAATAGTCATAGAGTATTTGGAGGAGTATCATTATCTTCAACCTACATATGAGGATTTACTAGAACTGATCAGAGAGTGTACTATACCAGATTTGAATGACATGAGAATTACCGAGGAAATGCTTCACAAGCATGCACAGTTTGTGTGCGACCAAGTAGTCAGCTTAGAAGCAGACGAAGATGATGAACCACCACTTATAACTCTTCCGTGTATGAGGGAGTTAATTAAACTGATGGGCATAAAATTCGGCAAGCGTAAATTCCGCACTAAAATCGATTACAAAAAGATTGACAAAAAAGCTTGGACTAAAGCTACTACCACACCTCTTGTACGGAAAACTTTTGAAAGCTTTTTCACTAACCAATTAGATAAAACAAATCATGAGTTAGTGTTAAGAAGAAAGAGATGTGGAGTCTGTGAAGCTTGCCAGTTGCCTGATTGCGGCGAATGTAATGCGTGTCGGGCAATGGCTAAGTTCGGTGGACATGGACGCACTAAAAAAGCTTGTGTGCGACGATTTTGTCCTAACATGGCAGTAGAGCAGGCTGAAGATTCTGAACCAGATGATGAGGATGACTATCAACAAATGGCTGAGAAAAAACATCACGACAAGATAGAGGATGCAGTGCCTGTAAAGTTAACTGGGTCAAATAACAGGAAAATTAAATGGCTTGGTGAACCCACCAAGGCAGACACTACCAAAGTCTACTACGAAAAAGTTGAAATTGATGGCTCTGAACTTTGCAATGGTGACTTTGTAATGGTGGAAACTTCACAGTCAAATATTCCTGCTTTAGTTGCCAGAGTAGTGTACATGTGGAGGGAAACAATAAATTCTCAATCTGGTTATTTCCACGCAGAAGTGTTTATAAGAGCATCAGACACTGTCCTGGGTGAAGTGAGTGACCCCAGAGAAGTATTTTTAGGAGATAGATGTTGCCATGGCGCTCCACTCTCATCAATACTGCGTAAAGCTAGTGTAGAAAAAGGAGAAATTCCAGCTGATTGGTTTAGATTAGGTGGTAAGGAAATTGATGATAAGCATTTTGAGGATGATGGTAAAACATATTTTTACAATAAATATTATGAAAGATTCACTGCACGATTCGAGGATTTACCTGCAGATCCAAAATGTCCTAATCCCCTGAGACAGCACAGATTTTGTCCATCATGTGAAAGAAAAACTAGAAGGGATGCTAAGAATATACCAAAAGTTTTTGGGAAATTGTTGGAAAAATCCAGTGTTGTTACTGAATCTAATAGAACAGAATGGACACATGTGACATGGCAAGATTATGATTACAAGAAAGGTTGTAGTGTTTTTCTTAAACCAGGAACATTCAAACTAAAAAATAGTTTCAATAACAATGCAAATAACGTGAAACCAAAATTAGATAAAGTTGACGAAGACATATATCCCGAATATTACAGGAAGAGTGACAATAATTTACGTGGCTCAAATATAGACACGGGAGAACCATTTTGCATTGGTTATATTGCAGCTGTGACTGCCATTGGAGAAGGACCTTTGATTGTTCCACAAGATATTTATTTAAAAGTCAATGTCCTTTATAGACCTGAAAATACCACTAGTAGATTTCCACAGCACGAAGACCTCAATGTAGTCTACTGGAGTGACGAAATTCGCGATGTATCTTTTTCTGCAGTTGTAGGAGTATGTCAAGTATTCTATGAACAAAATATCCCTCTGCATTGTTCACTCACGGAGTGGCTTGAGAAAGACCCATGCAGGTTTTACTTTAGAATGGCTTTTGACAAATCATCCGGTCAGTTTGTAGATGTCCCACATAATGCTACGACTGTTGGACGCACATCTGATCGGAGCAAAGATAAGGGTAAAGGTAAAGGAAAATCCAGTAAGCCTGTGGAAAGCAACAAAAATAATGTTGAAACTTCCTCGGTGCGACCTTTAAGAACTCTTGACGTATTTGCGGGATGTGGTGGTCTTTCTGAAGGCTTACACCAGGCCGGAGTAGCAGAGTGCAGATGGGCCATTGAAAATGTTGAAGCTGCTGCTCATGCTTATGGTCTTAACAATAAGAACTGTATCGTTTTTCACGAAGACTGTAATGCTTTATTAAAAGAAGCGATGTCAGGGGCCACTCATAGTACTAATGGATTACGTCTACCAATGCAGGGCGAAGTAGAACTTTTATGCGGCGGACCACCGTGTCAGGGCTTCTCGGGTATGAATAGATTTAACTCCCGAGAGTACTCTAATTTCAAAAACTCGCTAGTAGCGTCGTACCTATCTTATTGTGATTATTACAGGCCCAAATATTTTATTCTTGAAAATGTGCGAAATTTTGTAGCTTTCAAAAAAGGCATGGTTTTAAAACTGACATTGAGGGCATTACTCGATATGGGTTATCAGTGCACATTTGGAATACTCCAGGCTGGCAACTATGGTGTACCTCAGACGAGAAGACGACTTATTATTTTAGCAGCAGCACCTGGGTATAAACTTCCATTCTATCCTGAACCAACGCACGTGTTTAGCAGACGTGCATGTTCACTAACTACCACAATAGACGGCAAACGTTTTGTTACTAACATAAATTGGGATGAATCCGCTCCTAGACGAACGTGTACCATTCGAGATGCTATGAGCGACTTGCCACGAATATGCAATGGTGCTAATAAAATAGAAATAGAATATGGGTCCATGCCAGAGAGCCATTTCCAAAGGCTCATCAGAAGTAAAAATGAAAATGCTAAACTACGAGATCATATTTGCAAAAATATGGCTCCATTAATTCAAGCTAGGATATGTAGAGTACCAACTACGCCTGGGTCGGATTGGAGAGATCTACCTAACATATCAGTGGCTTTATCAGATGGAACTAAATGCAAGGTGCTGCAGTATAGATACGATGACAAGCGCAACGGGCGATCGTCAAGCGGAGCGCTCCGTGGAGTGTGCGCGTGCGCGGCGGGCGGGCCCTGCAGCCCCGCAGACAAACAAGAGAACACGCTCATACCGTGGTGTCTGCCACACACGGGCAATCGACACAATAACTGGGCTGGCCTCTACGGTCGTGTTTGTTGGGATGGCTACTTTAGCACTACTGTGACAGATCCTGAACCAATGGGAAAGCAGGGCAGAGTGCTCCATCCTGAACAGAACCGCGTCGTATCAGTTCGTGAATGCGCCAGGTCGCAGGGCTTTCCTGATACGTACATATTCGCTGGCTCAGTACAAGACAAACACCGACAGGTCGGGAATGCTGTGCCACCTCCTTTGGGCGCTGCACTGGGTCGAGAGATAAAGAGGGCATTAGCTTCTAGTATATAG-3’（SEQ ID NO：3）。

2）斜纹夜蛾Dnmt1>

根据试剂盒T7 RiboMAX™ Express RNAi System（购自Promega公司）的说明书分别合成斜纹夜蛾Dnmt1的dsRNA序列（SEQ>GFP的dsRNA序列（SEQ>Dnmt1dsRNA载体及空白对照载体，用于后续的RNAi干扰实验。相应dsRNA序列分别如下所示：

斜纹夜蛾Dnmt1>

5’-GGGAUGUGGUGGUCUUUCUGAAGGCUUACACCAGGCCGGAGUAGCAGAGUGCAGAUGGGCCAUUGAAAAUGUUGAAGCUGCUGCUCAUGCUUAUGGUCUUAACAAUAAGAACUGUAUCGUUUUUCACGAAGACUGUAAUGCUUUAUUAAAAGAAGCGAUGUCAGGGGCCACUCAUAGUACUAAUGGAUUACGUCUACCAAUGCAGGGCGAAGUAGAACUUUUAUGCGGCGGACCACCGUGUCAGGGCUUCUCGGGUAUGAAUAGAUUUAACUCCCGAGAGUACUCUAAUUUCAAAAACUCGCUAGUAGCGUCGUACCUAUCUUAUUGUGAUUAUUACAGGCCCAAAUAUUUUAUUCUUGAAAAUGUGCGAAAUUUUGUAGCUUUCAAAAAAGGCAUGGUUUUAAAACUGACAUUGAGGGCAUUACUC-3’（SEQ ID NO：4）。

3）斜纹夜蛾Dnmt1>

实验方法：

将5龄第0天的斜纹夜蛾幼虫分成2组，即SlDnmt1>GFP>SlDnmt1 RNAi组对虫体注射30>SlDnmt1>dsRNA，对虫体内的基因SlDnmt1进行RNAi；GFP>GFP>

实验结果：

在斜纹夜蛾的5龄第0天的虫子注射SlDnmt1>dsRNA48 h 后，其表征如图4所示。与对照组相比，发现SlDnmt1>SlDnmt1的确被干扰了，其mRNA水平显著下降（图5），说明所获得的虫表征是SlDnmt1>

SlDnmt1>Dnmt1被干扰后，可实现对害虫生长、数量的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

<120> 昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在害虫防治中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version3.5

<210> 1

<211> 358

<212> RNA

<213> Bombyx mori

<400> 1

aucaagcugg aguugcagaa ugcaaguggg cuauugaaaa cguggaagcu gcuucucaug 60

cuuauucauu aaauaauaaa aguuguauug uauuuaauga agacuguaau gcacuuuuga 120

aaacuguaau gucuggugcu aagcacagcg cgaauggacu gcggcucccc augcaaggag 180

aaguggagcu uuuauguggc gggccaccau gucaaggcuu cuccggaaug aaucguuuua 240

auucaagaga guauucaaac uucaaaaacu cauuaguugc aucguauuua ucguuuugug 300

auuauuacag accuaaauau uuuauacugg aaaacguucg uaacuuugug gccuuuaa 358

<210> 2

<211> 413

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uacggcgugc agugcuucag ccgcuacccc gaccacauga agcagcacga cuucuucaag 60

uccgccaugc ccgaaggcua cguccaggag cgcaccaucu ucuucaagga cgacggcaac 120

uacaagaccc gcgccgaggu gaaguucgag ggcgacaccc uggugaaccg caucgagcug 180

aagggcaucg acuucaagga ggacggcaac auccuggggc acaagcugga guacaacuac 240

aacagccaca acgucuauau cauggccgac aagcagaaga acggcaucaa ggugaacuuc 300

aagauccgcc acaacaucga ggacggcagc gugcagcucg ccgaccacua ccagcagaac 360

acccccaucg gcgacggccc cgugcugcug cccgacaacc acuaccugag cac413

<210> 3

<211> 3936

<212> DNA

<213> Spodoptera litura

<400> 3

atggatgaat atatagaaac taaacaccta ctagatattg aaatggatga atatatagaa 60

actaaacacc aactagatat taaaatggat gaaaatgaaa acaataatgt tatagcgaaa 120

acaaaaccaa ttgttcttga caatgagaaa tgtgaaacct gtggccaatt tctcaataat 180

tcagatataa ttttctatca aggacaccca cagaattcag tggaagagta tatagcattg 240

actaatgaga aacttgttct agcatcaggt gaagagggtg atataatgga aagaccacaa 300

accaatataa ccagtttctg tatatttgac gagcaaggcc acctggtacc aattgatggt 360

ggtcttgttg aaaacgatgt gtgtatttat atgtcaggat acttgaagtc aatatgcaca 420

gattcaccgg aaattgatga tgaatcggtc cctgtgaaag atgtaggccc tattattgaa 480

tggttcatac atggctttga cggtggtgag aaaaactgta tcacattatc aacagaattt 540

ggagaatata atttattgaa accaagtgaa caatacacac ctcttatgaa caacctctat 600

gaaaagatat ggctcagcaa aatagtcata gagtatttgg aggagtatca ttatcttcaa 660

cctacatatg aggatttact agaactgatc agagagtgta ctataccaga tttgaatgac 720

atgagaatta ccgaggaaat gcttcacaag catgcacagt ttgtgtgcga ccaagtagtc 780

agcttagaag cagacgaaga tgatgaacca ccacttataa ctcttccgtg tatgagggag 840

ttaattaaac tgatgggcat aaaattcggc aagcgtaaat tccgcactaa aatcgattac 900

aaaaagattg acaaaaaagc ttggactaaa gctactacca cacctcttgt acggaaaact 960

tttgaaagct ttttcactaa ccaattagat aaaacaaatc atgagttagt gttaagaaga 1020

aagagatgtg gagtctgtga agcttgccag ttgcctgatt gcggcgaatg taatgcgtgt 1080

cgggcaatgg ctaagttcgg tggacatgga cgcactaaaa aagcttgtgt gcgacgattt 1140

tgtcctaaca tggcagtaga gcaggctgaa gattctgaac cagatgatga ggatgactat 1200

caacaaatgg ctgagaaaaa acatcacgac aagatagagg atgcagtgcc tgtaaagtta 1260

actgggtcaa ataacaggaa aattaaatgg cttggtgaac ccaccaaggc agacactacc 1320

aaagtctact acgaaaaagt tgaaattgat ggctctgaac tttgcaatgg tgactttgta 1380

atggtggaaa cttcacagtc aaatattcct gctttagttg ccagagtagt gtacatgtgg 1440

agggaaacaa taaattctca atctggttat ttccacgcag aagtgtttat aagagcatca 1500

gacactgtcc tgggtgaagt gagtgacccc agagaagtat ttttaggaga tagatgttgc 1560

catggcgctc cactctcatc aatactgcgt aaagctagtg tagaaaaagg agaaattcca 1620

gctgattggt ttagattagg tggtaaggaa attgatgata agcattttga ggatgatggt 1680

aaaacatatt tttacaataa atattatgaa agattcactg cacgattcga ggatttacct 1740

gcagatccaa aatgtcctaa tcccctgaga cagcacagat tttgtccatc atgtgaaaga 1800

aaaactagaa gggatgctaa gaatatacca aaagtttttg ggaaattgtt ggaaaaatcc 1860

agtgttgtta ctgaatctaa tagaacagaa tggacacatg tgacatggca agattatgat 1920

tacaagaaag gttgtagtgt ttttcttaaa ccaggaacat tcaaactaaa aaatagtttc 1980

aataacaatg caaataacgt gaaaccaaaa ttagataaag ttgacgaaga catatatccc 2040

gaatattaca ggaagagtga caataattta cgtggctcaa atatagacac gggagaacca 2100

ttttgcattg gttatattgc agctgtgact gccattggag aaggaccttt gattgttcca 2160

caagatattt atttaaaagt caatgtcctt tatagacctg aaaataccac tagtagattt 2220

ccacagcacg aagacctcaa tgtagtctac tggagtgacg aaattcgcga tgtatctttt 2280

tctgcagttg taggagtatg tcaagtattc tatgaacaaa atatccctct gcattgttca 2340

ctcacggagt ggcttgagaa agacccatgc aggttttact ttagaatggc ttttgacaaa 2400

tcatccggtc agtttgtaga tgtcccacat aatgctacga ctgttggacg cacatctgat 2460

cggagcaaag ataagggtaa aggtaaagga aaatccagta agcctgtgga aagcaacaaa 2520

aataatgttg aaacttcctc ggtgcgacct ttaagaactc ttgacgtatt tgcgggatgt 2580

ggtggtcttt ctgaaggctt acaccaggcc ggagtagcag agtgcagatg ggccattgaa 2640

aatgttgaag ctgctgctca tgcttatggt cttaacaata agaactgtat cgtttttcac 2700

gaagactgta atgctttatt aaaagaagcg atgtcagggg ccactcatag tactaatgga 2760

ttacgtctac caatgcaggg cgaagtagaa cttttatgcg gcggaccacc gtgtcagggc 2820

ttctcgggta tgaatagatt taactcccga gagtactcta atttcaaaaa ctcgctagta 2880

gcgtcgtacc tatcttattg tgattattac aggcccaaat attttattct tgaaaatgtg 2940

cgaaattttg tagctttcaa aaaaggcatg gttttaaaac tgacattgag ggcattactc 3000

gatatgggtt atcagtgcac atttggaata ctccaggctg gcaactatgg tgtacctcag 3060

acgagaagac gacttattat tttagcagca gcacctgggt ataaacttcc attctatcct 3120

gaaccaacgc acgtgtttag cagacgtgca tgttcactaa ctaccacaat agacggcaaa 3180

cgttttgtta ctaacataaa ttgggatgaa tccgctccta gacgaacgtg taccattcga 3240

gatgctatga gcgacttgcc acgaatatgc aatggtgcta ataaaataga aatagaatat 3300

gggtccatgc cagagagcca tttccaaagg ctcatcagaa gtaaaaatga aaatgctaaa 3360

ctacgagatc atatttgcaa aaatatggct ccattaattc aagctaggat atgtagagta 3420

ccaactacgc ctgggtcgga ttggagagat ctacctaaca tatcagtggc tttatcagat 3480

ggaactaaat gcaaggtgct gcagtataga tacgatgaca agcgcaacgg gcgatcgtca 3540

agcggagcgc tccgtggagt gtgcgcgtgc gcggcgggcg ggccctgcag ccccgcagac 3600

aaacaagaga acacgctcat accgtggtgt ctgccacaca cgggcaatcg acacaataac 3660

tgggctggcc tctacggtcg tgtttgttgg gatggctact ttagcactac tgtgacagat 3720

cctgaaccaa tgggaaagca gggcagagtg ctccatcctg aacagaaccg cgtcgtatca 3780

gttcgtgaat gcgccaggtc gcagggcttt cctgatacgt acatattcgc tggctcagta 3840

caagacaaac accgacaggt cgggaatgct gtgccacctc ctttgggcgc tgcactgggt 3900

cgagagataa agagggcatt agcttctagt atatag 3936

<210> 4

<211> 427

<212> RNA

<213> Spodoptera litura

<400> 4

gggauguggu ggucuuucug aaggcuuaca ccaggccgga guagcagagu gcagaugggc 60

cauugaaaau guugaagcug cugcucaugc uuauggucuu aacaauaaga acuguaucgu 120

uuuucacgaa gacuguaaug cuuuauuaaa agaagcgaug ucaggggcca cucauaguac 180

uaauggauua cgucuaccaa ugcagggcga aguagaacuu uuaugcggcg gaccaccgug 240

ucagggcuuc ucggguauga auagauuuaa cucccgagag uacucuaauu ucaaaaacuc 300

gcuaguagcg ucguaccuau cuuauuguga uuauuacagg cccaaauauu uuauucuuga 360

aaaugugcga aauuuuguag cuuucaaaaa aggcaugguu uuaaaacuga cauugagggc 420

auuacuc 427