一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中类胡萝卜素含量的方法

摘要

本发明公开了一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中类胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：1)将茶叶样品放在样品台上，采用拉曼光谱仪，获取茶叶样本的拉曼光谱信息，并进行全波段积分校正；2)利用17个特征波数处的拉曼光谱强度建立线性模型；3)采集待测茶叶样本在17个特征波数处的校正光谱强度，利用线性模型，预测茶叶中的类胡萝卜素含量，实现茶叶类胡萝卜素含量的无损、快速检测。本发明可快速有效地实现茶叶中类胡萝卜素含量的快速、无损、低成本、环保地检测，无需对茶叶样本进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，快速获取茶叶中类胡萝卜素成分的信息，提高了测量的准确率。

说明书

技术领域

本发明涉及类胡萝卜素含量检测技术领域，具体涉及一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中类胡萝卜素含量的方法。

背景技术

类胡萝卜素是一种黄红色的色素，广泛存在于微生物、植物、动物及人体内，是生物体必不可少的组成成分。类胡萝卜素在植物体的光合作用中主要有二个方面的作用，一是在过分光辐照条件下对光合作用系统进行保护，二是作为天线染料吸收光能。

植被色素含量与其光合能力、发育阶段和营养状况有较好的相关性，通常是植被环境胁迫、光合作用能力和植被发育阶段的指示器。类胡萝卜素不仅赋予各种生物绚丽的色彩，而且作为光合作用的辅助色素，既参与执行光能传递，又具有执行抗强光敏化和淬灭自由基等重要生理学功能，保护生物体免受不利环境因素的伤害。植被在不同的生长状态下，色素含量常发生变化，因此，可以通过研究植物叶片色素含量的变化来检测植物的生理生态情状。

茶是世界三大饮料之一，20多亿人消费茶叶，茶叶已成为世界性饮料。我国是茶叶的故乡，也是世界茶叶生产、消费和出口的大国。在茶叶的消费和生产中，茶叶的色泽起着举足轻重的作用。茶叶的色泽影响着茶汤的颜色、香气及口味等品质，是茶叶品级优劣评判的最直观的因素。

传统的类胡萝卜素检测方法包括分光光度计法、高效液相色谱法、原子吸收法等。传统的检测方法具有破坏性、检测步骤繁琐，且无法实现在线检测。同时，茶叶中的类胡萝卜素的性质不是很稳定，在实验过程中容易受光、氧、热的作用而发生改变，传统的化学方法测定茶叶中的类胡萝卜素精确度易受实验条件、和实验操作的影响而降低，因此，需要一种快速无损检测茶叶中的类胡萝卜素含量的方法。

发明内容

本发明提供了一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中类胡萝卜素含量的方法，实现了茶叶中类胡萝卜素含量的快速、无损、低成本检测。

一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中类胡萝卜素含量的方法，包括：

步骤1，采集待测茶叶样本在激发波长532nm时的拉曼光谱，在特征波数处，利用下式计算矫正系数：

$K=\frac{A_2+A_3}{A_2-A_3}$

式中，A₂为1000cm^-1处的拉曼光谱的强度；A₃为1131cm^-1处的拉曼光谱的强度；

所述特征波数分别为：945cm^-1、1000cm^-1、1131cm^-1、1144cm^-1、1160cm^-1、1171cm^-1、1184cm^-1、1357cm^-1、1500cm^-1、1515cm^-1、1520cm^-1、1525cm^-1、1821cm^-1、2314cm^-1、2622cm^-1、2845cm^-1、3062cm^-1；

步骤2，在特征波数处，拉曼光谱强度与对应的矫正系数的乘积作为矫正后的拉曼光谱强度；

步骤3，依据下式计算类胡萝卜素含量：

Y_{类胡萝卜素}＝0.8607+10^-5×(-0.04342A₁-0.02019A₂-0.08837A₃

+1.913A₄+0.3478A₅+0.04585A₆-0.08407A₇-1.036A₈

-0.6588A₉+0.7149A₁₀-0.00313A₁₁-0.6912A₁₂

+1.588A₁₃-0.9491A₁₄+0.02077A₁₅+0.08245A₁₆

-0.005A₁₇)

式中：A₁为945cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₂为1000cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₃为1131cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₄为1144cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₅为1160cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₆为1171cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₇为1184cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₈为1357cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₉为1500cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₀为1515cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₁为1520cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₂为1525cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₃为1821cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₄为2314cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₅为2622cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₆为2845cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₇为3062cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度。

其中，类胡罗卜素的主要特征峰1515cm^-1和1520cm^-1附近与v₂(C＝C)平面内伸缩振动有关；945cm^-1附近与v₄(C-H)平面外摆动相关；1000cm^-1附近与v₃(C-H₃)平面内摇摆振动相关；1131cm^-1、1144cm^-1和1160cm^-1附近与v₁(C-C)伸缩振动相关，其余的几个峰中，2314cm^-1附近为C-C伸缩振动基频的二级倍频。

拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法。拉曼光谱具有以下特点：1、可直接测定完整果蔬、果汁、果肉匀浆等；2、激光束聚焦直径小，样品可以是毫克甚至微克的数量级；3、灵活，无需样品预处理，可对果蔬样品进行非接触的无损伤检测；4.快速，可同时对果蔬样品多个组分或指标进行分析；5、拉曼光谱具有指纹光谱特性，选择性强；水是很弱的拉曼散射物质，无需考虑水分子振动的影响。

本发明采用拉曼光谱测量新鲜茶叶中类胡萝卜素含量，保证测量结果不受茶叶中其他物质的干扰。

多元线性回归分析用来研究一个因变量与一组自变量之间的依存关系，本发明以17个拉曼特征峰的校正强度(即特征波数处矫正后的拉曼光谱强度)作为自变量，以茶叶中类胡萝卜素含量作为因变量，根据所建立的线性回归模型，实现茶叶中类胡萝卜素含量的无损、快速检测。

作为优选，每个茶叶样本上选取3个点采集拉曼光谱，依据3条拉曼光谱的平均光谱计算类胡萝卜素含量。

作为优选，将茶叶样本置于样品台上进行检测，所述样品台包括：

载玻片，用于承载茶叶样本，载玻片的侧缘设有弹簧销；

盖玻片，与载玻片铰接，用于压平茶叶样本；

载物台，顶面设有与载玻片相配合的滑动槽，滑动槽的侧壁上设有与弹簧销相配合以定位载玻片位置的若干插孔。

进行拉曼光谱采集时，将茶叶样本放置在载玻片上，翻转盖玻片，使盖玻片压紧茶叶样本，移动载玻片，使载玻片侧缘的弹簧销与不同位置的插孔相配合，每个插孔对应为茶叶样本的一个检测位点。

盖玻片能够保证茶叶叶片表面的平整，同时保证检测茶叶样本上不同点时，物距尽可能保持一致，保证拉曼检测镜头能够准确定位在茶叶样本表面。

载玻片和盖玻片均采用石英材质。进行拉曼检测时，激发光通过盖玻片照射到茶叶样本表面。

载玻片为矩形，载玻片的两长边分别固定一条滑块，所述弹簧销固定设置在滑块上。盖玻片为矩形，盖玻片的长边与其中一条滑块铰接。

为了方便拉曼光谱的初始矫正，优选地，载玻片上嵌装一块用于光谱的初始矫正的硅片。进行拉曼光谱检测时，首先在532nm激发波长处，采集硅片的拉曼光谱，利用532cm^-1处的硅片光谱对拉曼光谱进行初始矫正。

插孔为沿直线排布的四个，其中一个插孔对应硅片的检测位点，其余插孔分别对应茶叶样本的不同检测位点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)不需要对茶叶样本进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，建立的线性模型准确度高，仅用了17个特征波数，即实现了精确度和稳定性的检测。

2)样品台结构简单，易于实现，成本低，结构和原理比较简单，体积较小，维护的成本低，且检测精度高。

3)具有良好的经济效益，茶叶中类胡萝卜素含量与茶叶的品质色泽、生理生长以及营养价值等都密切相关，传统的测量手段在提取、检测等方面需要耗费大量的试剂与人力，采用本发明方法能够避免由于操作人员操作不熟练，或者实验过程中温度、光照等造成茶叶色素含量变化等主观因素与客观因素带来的测量结果不准确等后果。

4)本发明方法可以快速、准确的检测茶叶中的类胡萝卜素含量，可以为茶树栽培和采摘加工中开发快速原位检测的仪器提供有效的手段。

5)环保，不会像传统检测那样消耗大量化学试剂，因此不会对环境造成不利影响。

附图说明

图1为315片茶叶样本的原始拉曼光谱谱线；

图2为17个特征波数在茶叶拉曼光谱中的分布情况；

图3为建模集与预测集样本的类胡萝卜素含量的而预测值与测量值的散点分布图；

图4为实施例1中样品台的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。

实施例1

本发明提供的样品台结构如图4所示，包括：载玻片2、盖玻片1和载物台3。载玻片2和盖玻片1均采用石英材质。

载玻片2的表面用于放置茶叶样本，载玻片2为矩形，载玻片2的两长边分别固定一条滑块7，每条滑块7上固定有弹簧销，两条滑块7上的弹簧销位置对应。载玻片2上嵌装一块硅片5。

盖玻片1为矩形，盖玻片1的长边与其中一条滑块7铰接，盖玻片1翻转后压紧茶叶样本。盖玻片1用于保持茶叶叶片表面的平整，检测茶叶样本上不同点时，尽量减少物距变化，保证拉曼检测镜头能够准确定位在茶叶样本表面。

载物台3，顶面设有滑动槽4，载玻片2通过滑块7与滑动槽4配合，滑动槽4的侧壁上设有与弹簧销相配合的插孔6。插孔6为沿直线排布的四个，其中插孔6与硅片5的检测位点对应，其余三个插孔6分别对应茶叶样本的一个检测位点。

实施例2

取315片龙井43叶片，针对每个龙井43叶片，分别随机剪取叶脉两侧的叶片，得到两份茶叶样本，每份茶叶样本的质量约为0.1g，剪取完毕后，实际测量并记录湿重。其中一份直接置于袋中，并标号，作为拉曼光谱材料A，另一份剪碎置于离心管中，并标号，加入10mL质量分数为95％的酒精溶液，置于暗室保存约24h，作为紫外分光光度材料B。针对同一茶叶叶片，拉曼光谱材料A与紫外分光光度材料B的标号相同。

将拉曼光谱材料A固定于实施例1所述的拉曼载物台上，采用雷尼绍共聚焦激光显微拉曼仪(Renishaw in Via-Reflex 532/XYZ)，激发波长532nm；激光强度50mW；积分时间1s；拉曼光谱检测波长范围为579.175～3061.95cm^-1；分辨率0.2nm；选用放大倍数为5x的物镜。

针对每个拉曼光谱材料A检测3个不同位置的点，每个点得到一条拉曼光谱，利用三条拉曼光谱的平均光谱，建立数学模型。具体操作为：将茶叶样本至于载玻片上，盖玻片压平茶叶样本，通过移动滑块带动载玻片移动，滑块上的弹簧销插入不同插孔时，对应茶叶样本上的不同测量位点，分别采集对应的拉曼光谱，然后对拉曼光谱进行平均。整个实验都在恒温25℃条件下进行。

图1是茶叶样本的原始拉曼光谱，各光谱曲线中，在1155cm^-1与1528cm^-1处，都有比较明显的β-胡萝卜素等色素谱峰，另外在1006cm^-1和1192cm^-1处还有一些小峰，均为茶叶样本内色素对应的特征峰。

在得到的315个茶叶样本中，对315个样本以约3：1的比例进行建模集和预测集的划分。将各茶叶样本按其类胡萝卜素的化学浓度从小到大的顺序排列，对前312个样本依据次序每八个为一组，从每组中选择第2个、第7个样本归于预测集，余下的样本归于建模集。剩下的3个样本，第313、315号样本归于建模集，314号样本归于预测集，茶叶样本划分的具体信息如表1所示。

表1

最大值(mg)最小值(mg)平均值(mg)标准差个数建模集1.49170.19010.84470.2233236预测集1.47860.25570.84370.226979

对测得的茶叶样本的拉曼光谱进行校正，首先，获取1000cm^-1和1131cm^-1处的拉曼强度，然后依据计算矫正系数K，式中，A₂为1000cm^-1处的拉曼强度，A₃为1131cm^-1处的拉曼强度。

通过对拉曼光谱强度进行校正，能够减少拉曼光谱受激光强度、积分强度和不同仪器测定时不同基线漂移的影响，大大提高了测试的准确性。

通过某一个测试样本的Raman光谱很难准确的确定类胡萝卜素的特征指纹峰，本发明通过对大样本进行统计学分析，能够准确的找出类胡萝卜素振动相关的特征指纹峰(即特征波数)，选取17个特征波数分别为：945cm^-1、1000cm^-1、1131cm^-1、1144cm^-1、1160cm^-1、1171cm^-1、1184cm^-1、1357cm^-1、1500cm^-1、1515cm^-1、1520cm^-1、1525cm^-1、1821cm^-1、2314cm^-1、2622cm^-1、2845cm^-1、3062cm^-1，图2为17个特征波数在茶叶拉曼光谱中的分布情况，计算每个特征波数处的拉曼光谱的强度与矫正系数的乘积，得到矫正后的拉曼强度。

针对建模集样品，采用紫外分光光度计测量得到各茶叶样品中的类胡萝卜素含量作为类胡罗卜素含量的测量值，依据类胡萝卜素含量的测量值，以及17个特征波数处矫正后的拉曼强度，建立线性回归模型，线性回归模型如下：

Y_{类胡萝卜素}＝0.8607+10^-5×(-0.04342A₁-0.02019A₂-0.08837A₃

+1.913A₄+0.3478A₅+0.04585A₆-0.08407A₇-1.036A₈

-0.6588A₉+0.7149A₁₀-0.00313A₁₁-0.6912A₁₂

+1.588A₁₃-0.9491A₁₄+0.02077A₁₅+0.08245A₁₆

-0.005A₁₇)

式中：A₁为945cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₂为1000cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₃为1131cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₄为1144cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₅为1160cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₆为1171cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₇为1184cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₈为1357cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₉为1500cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₀为1515cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₁为1520cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₂为1525cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₃为1821cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₄为2314cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₅为2622cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₆为2845cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度；

A₁₇为3062cm^-1处的矫正后的拉曼光谱强度。

针对建模集样品，将17个特征波数处矫正后的拉曼强度代入线性回归模型中，计算得到类胡萝卜素含量的预测值。

针对预测集样品，采用紫外分光光度计测量得到各茶叶样品中的类胡萝卜素含量作为类胡罗卜素含量的测量值，将17个特征波数处矫正后的拉曼强度代入建模集样品建立的线性回归模型中，计算得到类胡罗卜素含量的预测值。

图3为建模集与预测集中各个茶叶样本的类胡萝卜素含量的预测值与测量值的散点分布图，其中圆代表建模集中的茶叶样本，三角形代表预测集中的茶叶样本，横坐标代表茶叶样本的类胡萝卜素含量的真实值(即测量值)，纵坐标代表类胡萝卜素含量的预测值。

从图3可以看出，采用上述方法得到的建模集和预测集样本的类胡萝卜素含量预测值与真实值呈明显的线性关系，且建模集和预测集的相关系数见表2，相关系数在0.75以上。相关系数为在因变量的总平方和中，由自变量引起的平方和所占的比例的平方根，其值越大，自变量对因变量的解释程度越高，均方根误差为预测值与测量值偏差的平方和与观测次数间比值的平方根，能够很好地反映出预测的精确度，值越小精度越高，由表2可以看出本实施例提供的能够获得可靠的类胡萝卜素含量。

表2

相关系数均方根误差建模集0.70170.1573预测集0.73290.1534

针对待检测的茶叶样本，获取茶叶样本在设定波数范围内以硅片为衬底时的拉曼光谱，计算该拉曼光谱在17个特征波数处的强度与矫正系数的乘积，代入建立的线性模型中计算待检测茶叶样本中类胡萝卜素的含量。

以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。