葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记及应用，涉及果树遗传育种领域。本发明首次对决定葡萄抗炭疽病的数量性状位点进行了QTL定位，确定了葡萄抗炭疽病的主效QTL位点RA，位点的贡献率为71.5％，可解释37.7％的葡萄抗炭疽病特征。基于此位点筛选的连锁分子标记M1E12‑1500‑m提高了对目标性状判断的准确性，为实现基于分子育种的多基因控制性状的改良奠定了基础。另外，本发明中与主效QTL位点RA连锁的分子标记M1E12‑1500‑m距离为0.96cM，与目标位点表现为紧密连锁。因此，获得的标记具有良好的应用价值，可提高分子标记辅助选择的准确性和效率，加快对葡萄对炭疽病抗性改良的进度。

说明书

技术领域

本发明涉及果树遗传育种领域，尤其涉及一种葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记及应用。

背景技术

葡萄在我国果树生产中占有重要地位，2014年我国葡萄栽培面积为76.7万hm2，产量1250万t以上，分别位居世界第二位和首位(FAO，2014)，是我国农业产业和农民增收的重要经济支柱。随着葡萄产业的快速发展，病害成为葡萄高效优质生产的主要障碍。

葡萄炭疽病是危害葡萄生产的一种主要病害，可造成葡萄减产10％-20％，炭疽病导致果粒产生病斑，对葡萄品质造成严重危害。目前，对葡萄炭疽病的防治多采用化学药剂防治，但化学药剂会在葡萄果实和土壤中残留，对人体健康和环境均造成负面影响。

因此，培育葡萄抗炭疽病新品种是葡萄育种的重要目标之一。

目前，对于葡萄炭疽病，大多是针对葡萄炭疽病致病病原菌的致病力、病菌侵染寄主过程中的关键酶、调控菌株致病的基因等方面的研究。而对葡萄中抗葡萄炭疽病基因的研究还未见明确报道。利用葡萄中抗葡萄炭疽病基因进行育种也未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记及应用，从而解决现有技术中存在的前述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA的分子标记M1E12-1500-m，所述分子标记M1E12-1500-m的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述分子标记M1E12-1500-m的长度为1500bp，该分子标记M1E12-1500-m与葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA之间的遗传距离为0.96cM。

优选地，包括：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

一种鉴定葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA的分子标记方法，利用上述分子标记M1E12-1500-m的引物对为引物，对待鉴定的葡萄材料进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则标志葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA存在。

优选地，所述PCR的反应体系为：

10×缓冲液：2.0μL，dNTP：2.5mmol>-1×1.6μL，Mg²⁺：25mmol>-1×1.2μL，DNA模板：40ng>-1×2.0μL，ExTaq酶：5U>-1×0.2μL，正向引物：10mmol>-1×1.0μL，反向引物：10mmol>-1×1.0μL，用双蒸水补至20μL。

优选地，所述PCR的反应条件为：

94℃预变性5min；然后94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，共5个循环；然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃终延伸7min。

一种分子标记M1E12-1500-m的筛选方法，包括以下步骤：

S1，利用葡萄欧亚种‘里扎马特’和野生刺葡萄‘黑珍珠’，获得F1杂交后代群体；

S2，利用SSR分子标记方法，利用能扩增出父本特异性条带的引物对杂交后代的真伪性进行鉴别，鉴定出的真杂种用于下一步葡萄分子遗传图谱的构建及QTL定位；

S3，用SRAP、SSR两种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，获得多态性标记位点，然后对其进行连锁分析，构建葡萄的遗传连锁图谱；

S4，利用菌液接种法，对‘里扎马特’和‘黑珍珠’的杂交后代的炭疽病抗性进行鉴定；

S5，采用MapQTL5.0软件，选择区间作图法，将杂交群体每个单株的抗性与遗传图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥3.0为标准，大于3.0说明存在一个QTL位点，在葡萄的第12号连锁群上检测到抗炭疽病的QTL位点RA，其LOD值为3.03，是主效QTL，距离主效QTL最近的一个SRAP分子标记为M1E12-1500-m，大小为1500bp，距RA的距离为0.96cM，该标记可以作为葡萄抗炭疽病的标记，所获得的分子标记M1E12-1500-m的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，为：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′，反向引物序列SEQ ID NO.2所示，为：5′-GACTGCGTACGAATTCTC-3′。

优选地，所述主效QTL位点RA位于欧亚种‘里扎马特’和野生刺葡萄‘黑珍珠’联合图谱的12连锁群上，该位点贡献率为71.5％。

一种用于筛选抗炭疽病葡萄的试剂盒，包括上述引物对。

上述引物对在抗炭疽病葡萄育种中的应用。

本发明的有益效果是：本发明实施例提供的葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记及应用，首次对决定葡萄抗炭疽病的数量性状位点进行了QTL定位，确定了葡萄抗炭疽病的主效QTL位点RA，位点的贡献率为71.5％，可解释37.7％的葡萄抗炭疽病特征。基于此位点筛选的连锁分子标记M1E12-1500-m提高了对目标性状判断的准确性，为实现基于分子育种的多基因控制性状的改良奠定了基础。另外，本发明中与主效QTL位点RA连锁的分子标记M1E12-1500-m距离为0.96cM，与目标位点表现为紧密连锁。因此，获得的标记具有良好的应用价值，可提高分子标记辅助选择的准确性和效率，缩短育种进程，加快对葡萄对炭疽病抗性改良的进度。

附图说明

图1是葡萄抗炭疽病QTL位点RA在染色体上的位置。

图中，LG代表的是葡萄的连锁群，LG后的数字代表连锁群数，连锁群上左侧的数字是分子标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标记的名称，共有SRAP、SSR两种分子标记，标记“-”后的数字是该标记扩增的多态性条带的大小，连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间RA。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

我国原产的野生葡萄中，刺葡萄、山葡萄、毛葡萄、华东葡萄、蘡薁等对炭疽病均有很强的抗性。但这些抗病的野生葡萄品质低劣，不宜直接利用。而我国主要栽培的欧亚种和欧美杂交种葡萄，对葡萄炭疽病的抗性较弱，但品质优良。因此利用中国野生葡萄的抗病性和欧亚种葡萄的优良品质培育新的抗性优良品种，是防治葡萄炭疽病的根本解决途径，也是最经济、有效、安全的方法。

国内外工作者构建出的葡萄分子遗传图谱已经涉及到欧亚种、美洲种的河岸葡萄和沙地葡萄，以及中国野生葡萄中的毛葡萄和山葡萄，且已检测到与抗葡萄皮尔斯病、抗霜霉病、抗黑腐病、抗白粉病、抗灰霉病、抗寒性相关的QTL而目前还未见与中国野生刺葡萄相关的分子遗传图谱。

如图1所示，本发明实施例提供了一种葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA的分子标记M1E12-1500-m，所述分子标记M1E12-1500-m的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性)技术是一种基于PCR的分子标记技术，又称基于序列扩增多态性(Sequence based AmplifiedPolymorphism，SBAP)，由美国加州大学蔬菜作物系的Li和Quiros博士在2001年提出，主要检测基因的开放读码框(ORFs)区域，具有简单、高效、重复性高、易测序等优点，适合于基因的定位与克隆等分子生物学的研究。引物序列参照Li和Quiros公布的引物序列(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1检测用的SRAP引物序列

所述分子标记M1E12-1500-m的长度为1500bp，该分子标记M1E12-1500-m与葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA之间的遗传距离为0.96cM。

分子标记M1E12-1500-m的筛选方法，包括以下步骤：

S1，利用葡萄欧亚种‘里扎马特’和野生刺葡萄‘黑珍珠’，获得F1杂交后代群体；

S2，利用SSR分子标记方法，利用能扩增出父本特异性条带的引物对杂交后代的真伪性进行鉴别，鉴定出的真杂种用于下一步葡萄分子遗传图谱的构建及QTL定位；

S3，用SRAP、SSR两种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，获得多态性标记位点，然后对其进行连锁分析，构建葡萄的遗传连锁图谱；

S4，利用菌液接种法，对‘里扎马特’和‘黑珍珠’的杂交后代的炭疽病抗性进行鉴定；

S5，采用MapQTL5.0软件，选择区间作图法，将杂交群体每个单株的抗性与遗传图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥3.0为标准，大于3.0说明存在一个QTL位点，在葡萄的第12号连锁群上检测到抗炭疽病的QTL位点RA，其LOD值为3.03，是主效QTL，距离主效QTL最近的一个SRAP分子标记为M1E12-1500-m，大小为1500bp，距RA的距离为0.96cM，该标记可以作为葡萄抗炭疽病的标记，所获得的分子标记M1E12-1500-m的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，为：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′，反向引物序列SEQ ID NO.2所示，为：5′-GACTGCGTACGAATTCTC-3′。

其中，所述PCR的反应体系为：

10×缓冲液：2.0μL，dNTP：2.5mmol>-1×1.6μL，Mg²⁺：25mmol>-1×1.2μL，DNA模板：40ng>-1×2.0μL，ExTaq酶：5U>-1×0.2μL，正向引物：10mmol>-1×1.0μL，反向引物：10mmol>-1×1.0μL，用双蒸水补至20μL。

所述PCR的反应条件为：

94℃预变性5min；然后94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，共5个循环；然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃终延伸7min。

本发明实施例提供了一种葡萄抗炭疽病主效QTL的分子标记M1E12-1500-m的引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明实施例提供了一种鉴定葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA的分子标记方法，利用分子标记M1E12-1500-m的引物对(正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示)为引物，对待鉴定的葡萄材料进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则标志葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA存在。

本发明实施例中，主效QTL位点RA位于欧亚种‘里扎马特’和野生刺葡萄‘黑珍珠’联合图谱的12连锁群上，该位点贡献率为71.5％。

本发明实施例提供了一种引物对(正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示)在抗炭疽病葡萄育种中的应用。

具体实施例1：葡萄抗炭疽病主效QTL及其与主效QTL连锁的分子标记的发现。

1)利用抗炭疽病的野生刺葡萄与对炭疽病敏感的欧亚种里扎马特，进行远缘杂交，获得了203株杂交群体。

2)利用SSR分子标记，对刺葡萄和里扎马特种间杂交后代的真伪性进行了鉴别。筛选出能扩增出父本特异性条带的引物，杂交后代进行鉴定，有92株后代具有父本的特异性条带，结合田间形态学分析，确认为真杂种。鉴定出的真杂种可以用于下一步构建分子遗传图谱及抗炭疽病的QTL。

3)用SRAP、SSR两种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。最终获得了128个SSRs和62个SRAPs等共190个多态性标记位点，然后利用Jionmap4.0作图软件对其进行连锁分析，构建了一张共包含109个多态性标记的葡萄遗传连锁图谱。

利用SRAP、SSR分子标记方法，对‘里扎马特’和‘黑珍珠’及后代进行分析，并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。

SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet，2001，103：455-461)的方法；SSR标记的实验操作程序参考Gabriele D.G.等(Molecular Breeding，2005，15：11-20)的方法。所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SRAP和SSR扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶强碱银染法检测。

将SRAP、SSR电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“1”，无带记为“0”，不清楚的带或缺失记为“-”，根据已知分子量的Marker(100bp DNA Ladder)计算各多态性条带的分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ2测验分析各标记分离是否符合3∶1或1∶1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。

4)用Joinmap4.0分析软件构建葡萄的分子遗传连锁图谱。

将第3)步骤中得到的多态性标记条带根据亲本及后代的分离类型，按照CP模型进行分类统计。将标记在后代中产生分离的数据导入作图软件Joinmap 4.0Dataset菜单下选择Create new dataset，检查数据格式是否正确，在High light error命令下检测正确无误后，在Create population node窗口下转至数据分析状态。在Calculate options窗口下设置LOD值，最大重组率等。在数据分析状态下，依次在individual genot.freq、similarity of loci和similarity of individual命令下排除不适合作图的个体或标记，然后利用Locus genot.freq对各标记进行检测并分析其偏分离情况。在Grouping菜单下使用Create groups for mapping命令获得图谱连锁群，点击Calculate map，创建出每个连锁群的连锁图，最后选择各个连锁群的Map，选择Join菜单下的Combine maps合并图谱。

5)对该F1群体单株对炭疽病的抗性进行了鉴定。将炭疽病抗性等级和连锁图谱中的相关文件导入MapQTL5.0作图软件，采用区间作图法，以LOD值≥3.0为标准，对炭疽病抗性在葡萄的连锁图谱上进行QTL分析和定位。

结果表明，在葡萄的第12连锁群上检测到抗炭疽病的QTL位点RA(参见图1)，LOD值为3.03，与最近的SRAP分子标记M1E12-1500-m的连锁距离为0.96cM，对该性状的贡献率为71.5％，可解释37.7％的葡萄抗炭疽病特征。因此,该QTL位点为主效QTL，其最近标记的距离也远小于可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的所要求的最大距离。

以其中的SRAP标记为例：

SRAP的PCR反应扩增体系总体积为20μL，10×Buffer 2.0μL，dNTP(2.5mmol·L^-1)1.6μL，Mg²⁺(25mmol·L^-1)1.2μL，DNA模板(40ng·μL^-1)2.0μL，ExTaq酶(5U·μL^-1)0.2μL，上、下游引物(10mmol·L^-1)各1.0μL，最后用双蒸水补至20μL。

扩增引物：

Me1：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′；

Em12：5′-GACTGCGTACGAATTCTC-3′。

SRAP引物PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，共5个循环；然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。

PCR扩增的产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，共扩增出了10条条带，其中大小为1500bp的条带就是目标条带M1E12-1500-m。

具体实施例2：葡萄抗炭疽病主效QTL位点RA和分子标记M1E12-1500-m在葡萄育种中的应用

利用筛选到的与葡萄抗炭疽病主效QTL相连锁的分子标记对‘黑珍珠’与‘里扎马特’的92株F1杂交后代进行初步检测，以检测该方法在葡萄炭疽病抗性分子标记辅助选择中的实用价值。用该92株后代的基因组DNA及SRAP选择性扩增引物组合Me1Em12进行PCR反应，反应的操作过程同实施例1中的SRAP分子标记方法，PCR扩增结果在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(结果如图)，电泳后根据M1E12-1500-m条带的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记，说明该单株对炭疽病的抗性高，不存在则说明对炭疽病的抗性低，同时用实际鉴定的葡萄炭疽病抗性与分子标记检测结果进行验证。

结果显示，在‘黑珍珠’和‘里扎马特’的92株F1杂交后代中，共有73株的DNA扩增结果出现M1E12-1500-m条带，这73株当中有28株的抗性属于高抗，有33株的抗性属于抗，有12株的抗性属于中抗；共有19株后代的DNA扩增结果不出现M1E12-1500-m条带，其中14株的抗性属于敏感，5株的抗性属于高感。用M1E12-1500-m预测葡萄炭疽病抗性有较好的预测效果。

通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：本发明首次对决定葡萄抗炭疽病的数量性状位点进行了QTL定位，确定了葡萄抗炭疽病的主效QTL位点，位点的贡献率为71.5％，可解释37.7％的葡萄抗炭疽病特征。因此，基于此位点筛选的连锁分子标记提高了对目标性状判断的准确性，为实现基于分子育种的多基因控制性状的改良奠定了基础。另外，本发明中与主效QTL连锁的标记距离为0.96cM，与目标位点表现为紧密连锁。因此，获得的标记具有良好的应用价值，可提高分子标记辅助选择的准确性和效率，缩短育种进程，加快对葡萄对炭疽病抗性改良的进度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。