一种克罗诺杆菌的物理化学联合杀菌方法与应用

摘要

本发明公开了一种克罗诺杆菌的物理化学联合杀菌方法与应用，属于杀菌方法技术领域。本发明所提供的方法是向待灭菌对象上喷淋消毒剂，消毒剂作用20‑40s后，利用紫外线进行辐照处理，辐照剂量达到0.2‑0.3J/cm

说明书

技术领域

本发明涉及一种克罗诺杆菌的物理化学联合杀菌方法与应用，属于杀菌方法技术领域。

背景技术

克罗诺杆菌(Cronobacter)原名阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，是婴儿配方乳粉(powdered infant formula，PIF)中的A类致病菌，能够通过污染PIF造成新生儿感染，致死率高达40％-80％。

阪崎克罗诺杆菌是具有极大危害的食源性病原菌，能引发严重的败血症、坏死性小肠结肠膜炎、脑膜炎以及脓毒症。此外，在一定条件下，该菌也可导致免疫力低下的成年人菌血症、局部感染及骨髓炎等。感染该菌的高危人群是体重偏轻的新生儿(低于2.5kg)和刚出生的婴儿(出生28天内)。

目前关于感染阪崎克罗诺杆菌的婴幼儿案例，集中于西方国家。刚出生一周左右的婴儿易被阪崎克罗诺杆菌所感染，使其患有脑膜炎。当被感染的新生儿表现出瞳孔散大、眼外肌麻痹以及上脸下垂等症状后，严重者会在几小时就死亡。致死率在40％以上，并且剩余存活者也会留下严重的神经后遗症，承受神经系统疾病的折磨。

世界卫生组织(WHO)和联合国粮食及农业组织(FAO)已确定克罗诺杆菌属中有六种菌具有毒性，毒性强弱存在差异。到目前为止，阪崎克罗诺杆菌的致病机制尚无定论，很多研究学者都从不同角度对其致病机制进行了探讨。致病机制可能是：外膜蛋白A黏附细胞的作用、脂多糖非特异致病作用、细菌间相互作用等。但是至今还没有系统解释该菌致病机理的报道，阪崎克罗诺杆菌的致病机制仍有待进一步阐明。

我国关于阪崎克罗诺杆菌的传播、感染的研究，主要在婴幼儿食品等方面。全国疾控中心在2010-2011年发布的报告称，广西省梧州市在175份食品样品中对阪崎克罗诺杆菌进行检测，检出率达到5.26％。在江苏省某市在891份样品的监测中，检测出该菌的概率是2.6％。由此可见，在我国食品中阪崎克罗诺杆菌污染的程度及其范围的广泛。

婴幼儿配方粉是克罗诺杆菌的主要污染源和污染渠道，而生产加工环节是克罗诺杆菌的主要污染环节。因此，对食品加工设备进行有效杀毒对杀灭克罗诺杆菌具有重要意义。在食品行业，目前的杀菌方法主要都集中在单一的化学或物理杀菌，来确保食品安全，很少使用联合杀菌方法。虽然目前对物理-化学联合杀菌方法的研究有所报道，但都处于就出研究阶段。由于加工场地的限制，很多研究中的方法并不具备可操作性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种克罗诺杆菌的物理化学联合杀菌方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种克罗诺杆菌的物理化学联合杀菌方法，该方法是向待灭菌对象上喷淋消毒剂，消毒剂作用20-40s后，利用紫外线进行辐照处理，辐照剂量达到0.2-0.3J/cm²后，停止紫外线辐照处理并利用无菌清水喷淋待灭菌对象；所述消毒剂是过氧乙酸、二氧化氯或过氧化氢。

所述杀菌方法的步骤如下：

1)向待灭菌对象中喷淋过氧乙酸、二氧化氯或过氧化氢溶液，作用20-40s；

2)对步骤1)经过消毒处理的待灭菌对象进行辐照剂量为0.2-0.3J/cm²的紫外线辐照处理；

3)利用无菌清水对喷淋清洗待灭菌对象。

优选地，步骤1)所述待灭菌对象为工厂生产设备或包装材料。

更优选地，所述待灭菌对象的材料是不锈钢、马口铁、铝塑复合膜、玻璃或水泥。

优选地，步骤1)所述过氧乙酸溶液的质量分数为0.1-0.15％；所述二氧化氯添加量为500-1000ppm；所述过氧化氢的质量分数为1.5-2.0％。

更优选地，所述方法的具体步骤如下：

1)向工厂生产设备或包装材料上喷淋质量分数为1.5-2.0％的过氧化氢，作用30s；

2)利用紫外线消毒灯对步骤1)经过过氧化氢处理的生产设备或包装材料进行紫外线辐照处理，处理剂量达到0.2-0.3J/cm²后结束；

3)在利用无菌清水对步骤2)经过紫外辐照处理的生产设备或包装材料进行清洗。

以上所述任一方法可在食品生产设备和包装材料的灭菌消毒过程中应用。

本发明获得的有益效果：

本发明所提供的方法具有杀菌彻底，可操作性强的特点，能够有效杀灭污染到食品加工设备和包装材料上的克罗诺杆菌，保证加工产品的安全性。本发明所提供的方法可以在使用较低消毒剂和较低紫外线辐照剂量的情况下获得较好的杀灭克罗诺杆菌的效果。既可以降低生产成本，可以降低食品安全风险。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

发明人所用菌株见表1，均分离自2007年至2015年期间，婴幼儿配方粉生产企业的加工环境和成品，共计4株阪崎克罗诺杆菌分离株。

所用菌株的选取主要是依据两个原则：第一，选取主要ST型的菌株作为试验的代表菌株。第二，根据发明人近9年采样结果，分析发现在喷雾干燥后、流化床出口、传送带等生产环节以及婴儿配方粉易被阪崎克罗诺杆菌污染。故选取这几株分离株作为实验菌株。

表1本发明所用克罗诺杆菌菌株及其来源

上述菌种的活化培养方法是：取出保存在-80℃，用甘油作保护剂的含有阪崎克罗诺杆菌的冻存管。将其恢复到室温，以2％的接种量接种于TSB液体培养基中，37℃条件下在摇床上培养12h进行活化。再用接种环取活化后的菌液在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)固体培养基三区划线，在37℃下培养24h。挑取典型大小为1～1.5mm的黄色单菌落，将其接种到10mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中进行纯培养，连续传代2次，方可进行后续试验。

将上述4株阪崎克罗诺杆菌的待用菌液用涡旋器震荡混匀，用移液枪分别从待测溶液取菌悬液滴分别滴加到不锈钢片、马口铁、铝塑复合膜表面上，在生物安全柜中室温下，干燥2h之后马上进行实验处理。

紫外剂量的换算

紫外剂量等于紫外强度与紫外辐射时间的乘积，具体公式如下：

紫外剂量(J/cm²)＝紫外强度(W/cm²)×辐照时间(s)

实施例1过氧乙酸处理对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

将经过灭菌处理并污染克罗诺杆菌并干燥2小时后的不锈钢片、马口铁片和铝塑复合膜上滴加浓度为0.1％，0.15％，0.2％，0.25％和0.3％的过氧乙酸溶液，作用10min后利用中止剂终止反应。在利用直径为0.5mm的玻璃珠将材料商的菌进行洗脱，并进行培养计数。以无菌硬质水代替过氧乙酸进行同样操作作为空白对照。试验结果以过氧乙酸处理前后材料表面菌数减少量的Log值表示。具体结果如表1所述。

表1不同浓度过氧乙酸对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

注:每行中字母的不同表示存在显著性差异(P＜0.05)

“ND”表示未检出

从表1可知，过氧乙酸浓度越高杀菌效果越好。当浓度达到0.3％时，克罗诺杆菌未被检测到。同时，可知不同的菌株在不同的材料上对过氧乙酸的耐受程度不同。

实施例2二氧化氯处理对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

本实施例采用500ppm，1000ppm，1500ppm，2000ppm，2500ppm，3000ppm的二氧化氯代替过氧乙酸对污染有四种不同克罗诺杆菌的不锈钢片、马口铁片和铝塑复合膜进行处理，处理条件与实施例1的条件相同。实验结果如表2所示。

表2不同浓度二氧化氯对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

从表2可知，随二氧化氯浓度的增加，4株菌经处理后的减少量均逐渐提高，当二氧化氯浓度为3000ppm时，处理后，经洗脱，未检测出菌。4株菌在用500ppm较低浓度和2500ppm较高二氧化氯处理时，经SPSS差异性分析，显示在三种材料上4株菌之间都无显著性差异(P＞0.05)。

实施例3过氧化氢处理对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

本实施例采用1.0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％的过氧化氢代替过氧乙酸处理污染有四种不同克罗诺杆菌的不锈钢片、马口铁片和铝塑复合膜进行处理，处理条件与实施例1的条件相同。实验结果如表3所示。

表3不同浓度过氧化氢对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

注:每行中字母的不同表示存在显著性差异(P＜0.05)

“ND”表示未检出。

从表3可知，随着过氧化氢浓度的增大，4株菌在三种材料上菌的减少量也随之增加。当过氧化氢的浓度达到3.5％时，四株菌在三种材料上经处理后，均未检测出。在过氧化氢的浓度为3％时，四株菌无显著性差异。

实施例4不同紫外线辐照剂量对不同材料上克罗诺杆菌的杀灭效果

本实施例采用了辐照剂量为0.1J/cm²、0.2J/cm²、0.3J/cm²、0.4J/cm²、0.5J/cm²的紫外线来代替过氧乙酸对对污染有四种不同克罗诺杆菌的不锈钢片、马口铁片和铝塑复合膜进行处理，处理条件与实施例1的条件相同。实验结果如表4所示。

表4不同紫外线辐照强度对不同材料上克罗诺杆菌的没杀效果

注:每行中字母的不同表示存在显著性差异(P＜0.05)

“ND”表示未检出

从表4可知，随着紫外剂量的增加，各ST型的菌在材料上的减少量也随之增加。当紫外剂量达到0.5J/cm²时，在材料上未检测出菌。当紫外剂量为0.1J/cm²、0.5J/cm²时，在三种材料上4株菌都无显著性差异。当紫外剂量为0.2J/cm²、0.3J/cm²、0.4J/cm²时，CE63(ST1)与CE64(ST4)存在明显差异(P＜0.05)，且CE63(ST1)减少的菌数多，CE64(ST4)与CE26(ST268)之间差异不明显。

实施例5紫外线-消毒剂联合处理对克罗诺杆菌的灭杀效果

根据实施例1-4的结果，本实施例对紫外线-消毒剂联合处理对克罗诺杆菌的灭杀效果进行研究。消毒剂的浓度选取为：过氧乙酸的浓度为0.1％、0.15％，二氧化氯浓度为500ppm、1000ppm，过氧化氢浓度为1.5％、2.0％。紫外线剂量选取0.2J/cm²、0.3J/cm²。在处理过程中，先向经过克罗诺杆菌污染的三种材料上喷淋消毒剂，作用时间30s后，进行紫外线辐照处理，处理后在使用无菌废水进行喷淋处理，处理后再将获得的菌体进行培养计数。

协同效果通过以下公式进行判定：

协同作用效果＝联合处理减少的菌数-(紫外减少的菌数+消毒剂减少的菌数)联合处理的后的协同效果分析结果，如表5所示。

表5紫外线-消毒剂联合处理对克罗诺杆菌的灭杀效果

注：“ND”表示未检出

协同作用效果＝联合处理减少的菌数-(紫外减少的菌数+消毒剂减少的菌数)为正数时表示存在协同效应。为负数时，表示二者具有杀菌效力相消的现象。

从表5可知，当三种消毒剂与紫外联用时，都表现出正的协同效应，即联用后比两者单独应用后累加的杀菌效果好。紫外和消毒剂联用存在明显的协同效应，能够在两者剂量较低时，就产生一个较好的杀菌影响。尤其是在过氧化氢浓度为2.0％，紫外线辐照强度为0.2J/cm²时，协同效应显著高于其他组别的技术效果。

实施例6

根据实施例5的结果，发明人调低了紫外辐照的强度和消毒剂的用量，采用消毒剂浓度为：过氧乙酸的浓度为0.05％，二氧化氯浓度为400ppm，过氧化氢浓度为1.0％。紫外线剂量选取0.1J/cm²对克罗诺杆菌进行处理。结果表明，紫外线处理与三种消毒剂联合处理对四种克罗诺杆菌的平均协同作用效果分别为马口铁：过氧乙酸0.11，二氧化氯0.07，过氧化氢0.26；不锈钢：过氧乙酸0.12，二氧化氯0.05，过氧化氢0.18；铝塑复合膜：过氧乙酸0.08，二氧化氯0.09，过氧化氢0.34。协同作用效果明显低于实施例5。

实施例7

根据实施例5的结果，发明人调高紫外线辐照剂量的水平为0.4J/cm²，消毒剂的用量水平为：过氧乙酸的浓度为0.1％，二氧化氯浓度为500ppm，过氧化氢浓度为1.5％。利用上述条件(其他条件与实施例5相同)对克罗诺杆菌进行处理。结果表明，过氧乙酸、二氧化氯和过氧化氢三种消毒剂与紫外线联合使用对四种克罗诺杆菌的平均协同效果依次为：马口铁：过氧乙酸0.89，二氧化氯0.58，过氧化氢0.77；不锈钢：过氧乙酸0.78，二氧化氯0.33，过氧化氢1.11；铝塑复合膜：过氧乙酸0.88，二氧化氯0.51，过氧化氢1.23。从上述结果可知，协同作用的效果没有提高，反而普遍低于实施例5协同效应的结果。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。