一种理气舒心片HPLC特征图谱的构建方法

摘要

理气舒心片特征图谱的构建方法，包括以下步骤：(1) 参照物溶液的制备：取柚皮苷精密称定，加甲醇制成每的溶液，(2) 供试品溶液的制备：取理气舒心片研细，精密称定，精密加甲醇超声处理补足减失甲醇，滤过；(3) 色谱条件设定；(4) 测定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到理气舒心片特征图谱。本发明所建立的方法，能比较全面的反映所含化学成分的种类和数量，能有效表征其质量，有利于全面控制产品质量，克服了原质量控制方法的片面性，是质量控质方法的有效补充。中药特征图谱技术是一种多指标的质量控制模式，能够全面、综合地反映和控制中药质量。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种中药的质量检测方法。

背景技术

中成药理气舒心片由当归、沉香、茯苓、木香、香附(醋制)、姜黄、莪术(醋制)、蒲黄、佛手、五灵脂、陈皮、枳实(炒)、青皮(醋制)、枳壳(炒)、麦芽(炒)、香橼、三棱(醋制)、丹参等18味中草药组成。本品主要功能为解肝郁，行气滞，祛胸痹。用于气滞血瘀症冠心病，心绞痛，心律不齐，气短腹胀，胸闷心悸。目前所执行标准收载于中药部颁标准，标准编号：WS3-B-0827-91，标准中无薄层鉴别及含量测定等质量控制项，不利于有效监控药品的质量和疗效。为提高理气舒心片药品质量，前期已经对全方进行质量控制方法研究，但因中药复方制剂药味多，成分复杂相互干扰不易有效检测等特点，方中只有几中药味能建立起专属性强的定性定量检测方法，不能全面监控产品质量，目前还没查到有关理气舒心片的质量研究和标准提升相关文献资料。

中药复方是中医临床用药的主要形式，其质量是临床疗效的关键。如何建立科学合理的、体现中药复方特点的质量控制方法就显得尤为重要，而中药复方质量控制方法一直是中药科研领域热点研究方向之一。如何科学合理选定质量控制的特征有效指标性成分，对中药复方进行有效的质量控制，是建立中药复方质量控制方法的关键所在。因此，本发明中我们对理气舒心片进行了特征图谱试验研究，建立了特征图谱测定方法，并对建立方法进行了重复性、精密度等方法学验证试验，结果表明方法稳定可行。现行标准不利于有效控制药品的质量和疗效，目前还没查到有关理气舒心片的质量研究和标准提升相关文献资料。

发明内容

本发明的目的之一是提供理气舒心片HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)参照物溶液的制备：取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含100～300μg的溶液，即得。

(2)供试品溶液的制备：取理气舒心片研细，取约1～3g，精密称定，精密加入60～80％的甲醇12.5～50ml，称定重量，超声处理10～30分钟，放冷，用60～80％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液3→70∶97→30的梯度混合溶液；紫外检测波长为286nm；流速为1.0ml/min；

(4)测定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到理气舒心片特征图谱。

(5)方法学考察

精密度试验：取理气舒心片，按步骤(2)方法制成供试品溶液，连续进样5次，依法检测。结果，5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.11％，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取理气舒心片，按步骤(2)方法制成供试品溶液，分别在0、4、8、12小时依法进行检测。结果：4次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.62％，表明供试品溶液在12小时之间稳定。

重复性试验：取同一批理气舒心片，按步骤(2)方法制备6份供试品溶液，依法测定。结果，6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值为0～0.51％，表明方法的重复性较好。

优选地，步骤(1)所述参照物溶液的浓度为每1ml甲醇含200μg对照品。

优选地，步骤(2)所述供试品溶液的制备步骤如下：取理气舒心片研细，取约2g，精密称定，精密加入70％的甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

优选地，步骤(3)所述流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液3→70∶97→30的梯度混合溶液。

在一个优选的实施方案中，理气舒心片流动相洗脱梯度如表1所示：

表1理气舒心片特征图谱流动相梯度

时间(分钟)乙腈(％)0.1％磷酸溶液(％)0～353→2597→7535～4025→3075→7040～5530→7070→3055～70703070～7570→330→97

本发明的另一个目的是提供理气舒心片的HPLC对照特征图谱的构建方法，按照前述方法构建10批理气舒心片HPLC特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由10个共有峰构成的理气舒心片HPLC对照特征图谱，共有峰中第5号峰为柚皮苷峰，第6号峰为橙皮苷峰，第7号峰为新橙皮苷峰，第8号峰为丹酚酸B峰。

在对照特征图谱中，以柚皮苷峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间， 所述相对保留时间在规定值的±5％之内，所述规定值分别为：0.22-峰1、0.28-峰2、0.66-峰3、0.96-峰4、1.00-峰5、1.03-峰6、1.07-峰7、1.20-峰8、1.58-峰9、1.64-峰10。

取理气舒心片样品，按上述同法操作，得到理气舒心片样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对理气舒心片的对照物征图谱和样品指纹图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的质量检测方法能有效地监控理气舒心片的质量，保证其质量的稳定、可控。具有方法简便，精密度高、重现性好等优点，能有效表征理气舒心片中特征性成分，有利于监控产品的质量。

(2)本发明的方法以柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为对照品，建立的理气舒心片HPLC对照特征图谱注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征有利于全面监控产品的质量，为药品的质量检测提供可靠的依据。

(3)本发明的最佳紫外吸收波长为286nm。采用本发明中方法用DAD检测器对理气舒心片进行测定，根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图，当检测波长为286时，特征峰数目较多，各峰面积较高且各特征峰之间分离效果也最好。

本发明所建立的方法，能比较全面的反映所含化学成分的种类和数量，能有效表征其质量，有利于全面控制产品质量，克服了原质量控制方法的片面性，是质量控质方法的有效补充。中药特征图谱技术是一种多指标的质量控制模式，能够全面、综合地反映和控制中药质量，值得推广并应用。

附图说明

图1为理气舒心片HPLC特征图谱；

图2为理气舒心片的10批次原始特征图谱；

图3为理气舒心片的对照特征图谱。

具体实施方式

实施例1构建理气舒心片的HPLC特征图谱

1.仪器、试药

1.1仪器：安捷伦1200高效液相色谱仪；戴安双三元高效液相色谱仪；MS205DU型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)。

1.2试药：柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、丹酚酸B对照品(购于国 食品药品检定研究院)。甲醇为分析纯，乙腈、磷酸均为色谱纯，水为纯化水。

2.方法

2.1参照物溶液的制备：取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含200μg的溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备：取理气舒心片研细，取约2g，精密称定，精密加入70％的甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

2.3色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液按表1中规定梯度进行洗脱；紫外检测波长为286nm；流速为1.0ml/min；理论板数按柚皮苷峰计算应不低于100000。

2.4测定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到特征图谱，如图1所示。

实施例2构建理气舒心片的HPLC对照特征图谱

取理气舒心片10批次(A公司8批、B公司1批、C公司1批)，按实施例1条件进行检测，得10批次样品的HPLC图谱，如图2所示。通过10批HPLC图谱的比较，采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似性评价系统》软件对HPLC图谱进行相似度评价，确定共有特征峰，得到理气舒心片对照特征图谱。

在理气舒心片对照特征图谱中含有10个共有特征峰，其中参照峰为柚皮苷(5号峰)。

相似度评价：以《中药色谱指纹图谱相似性评价系统》软件分析，计算供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度，结果均大于0.90。相似度评价结果见表2。

表2HPLC特征图谱相似度评价结果

样品批次相似度样品批次相似度10.9960.9020.9970.9930.9980.9940.9990.9950.90100.90

通过上述方法所建立的理气舒心片HPLC对照特征图谱如图3所示。

实施例3理气舒心片的质量检测方法

取7批理气舒心片样品(A公司3批、B公司1批、C公司1批、D公司1批、E公司 1批)按实施例1的条件同法操作，得到理气舒心片样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对理气舒心片对照特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。

检测结果表明，A公司、B公司、C公司样品为合格样品，D公司、E公司样品为不合格样品。

综上所述，本发明质量检测方法的稳定性好、重复性好，因此，本发明的技术方案具有可行性。利用本发明质量检测方法检测合格的理气舒心片，药效确切，作用稳定。以下利用实验例具体说明。

实施例4药理学实验

1.实验材料

1.1实验动物

大鼠250士20g，ICR小鼠20士2g,来源：吉林大学白求恩医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(吉)2014-0003。

1.2实验仪器、试剂

BL-410生物信号采集系统：购自成都泰盟有限公司；SOD、MDA、CK、LDH、AST试剂盒购于南京建成生物技术有限责任公司。

1.3实验药品：

实验所用对照药A为利用本发明质量检测方法检测合格的理气舒心片，对照药E为利用本发明质量检测方法检测不合格的理气舒心片。

1.4剂量设计

理气舒心片临床给药剂量为17.622g(生药)/日/人,本实验采用临床的2倍剂量进行药效学实验比较，即折合大鼠实验剂量为：3.2g(生药)/kg,小鼠实验剂量为:4.6g(生药)/kg。

2.实验方法

2.1对大鼠急性心肌缺血的作用

Wistar雄性大鼠50只,随机分为5组，分别是假手术组，模型组，阳性药银杏叶组，理气舒心片对照药A、理气舒心片对照药E。每天灌胃给药1次，连续给药7天。最后一次给药后30min，腹腔注射3％的戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉动物，将动物仰卧位固定在手术台上，颈部去毛，75％酒精消毒，沿胸骨上窝上正中切开皮肤约0.5cm，钝性分离推开下颌下腺，分离气管前肌肉，使气管充分暴露。于第2～3气管环间行气管横行切开，切口长度不超过气管周径的1/3，清理气管内容物，迅速插入气管插管，深度为0.5～1cm。连接小动物呼吸机，呼吸频率90次/min，潮气量10～12ml，呼吸比为1:2。左前胸去毛，75％酒精消毒，胸骨左 缘切开皮肤，长约2cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，在第4～5肋间开胸，拉钩扩胸，钝性去除心包膜，暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳下2～3mm处结扎左冠状动脉前降支，迅速把心脏放回胸腔，挤出胸腔内的气体，缝合胸壁。假手术组实验操作基本相同，只是在冠状动脉左前降支处穿线而不结扎。术后6h，经腹主动脉采血，3000rmp/min离心10min制备血清，用于检测SOD，MDA，CK，LDH，AST。

采血后，迅速取出心脏，用预冷的生理盐水，除去血污，剔除多余的脂肪等非心肌组织。-20℃保持过夜，次日取出从心尖到心基底部平行切成5片，置于0.025％TTC溶液中，在37℃水浴中孵育15min，此过程要不断晃动染色液，使之充分的接触心肌组织。取出后立即用生理盐水冲洗到多余的染料。通过BI-2000医学图像分析系统进行分析，计算梗死面积。

将冲洗干净的心脏10％的中性甲醛溶液中固定，经石蜡包埋，固定，切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，HE染色，中性树脂封片等步骤。观察大鼠心肌组织的形态学改变。

结果:

1.对大鼠血清SOD、MDA的影响

SOD、MDA测定结果模型组SOD活力有降低，MDA含量有增加，与假手术组比较有显著差异(p<0.001)；阳性药银杏叶组SOD活力有升高，MDA含量明显降低，与模型组比较有显著差异(p<0.001)，理气舒心片对照药A SOD含量有明显增加，MDA含量明显降低，与模型组比较有显著差异(p<0.01)，对照药对照药ESOD活力有升高,与模型组比较比较有显著差异(p<0.05)，MDA含量降低，但与模型组比较无显著性差异。见表3。

表3对大鼠血清SOD、MDA的影响(x±S)

与假手术组比较**p<0.01、***p<0.001，；与模型组比较#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001

2.对大鼠血清CK、LDH、AST的影响

CK、LDH、AST测定结果模型组CK、LDH、AST含量明显增加，与假手术组比较具有显著差异(p<0.001)。理气舒心片对照药A CK、LDH、AST释放增加，与模型组比较具有差异(p<0.05、p<0.01)；对照药ECK释放均有增加，与模型组比较有显著性差异(p<0.05)，LDH、AST与模型组比较无显著性差异。见表4。

表4对大鼠血清CK、LDH、AST的影响(x±S)

与假手术组比较***p<0.001；与模型组比较#p<0.05、##p<0.01

3.对大鼠心肌梗死面积的影响

大鼠心肌梗死面积测定结果正常组未见心肌缺血，模型组心肌缺血最为严重，理气舒心片对照药A心肌梗死面积最轻，好于理气舒心片对照药E，见表5。

表5各组大鼠心肌梗死面积百分比

2.2对大鼠心律失常的影响

Wistar大鼠40只,雌雄各半，随机分为4组，分别是模型组，阳性药银杏叶组，理气舒心片对照药A、理气舒心片对照药E。每天灌胃给药1次，连续7天，模型对照组给予等容积CMC。各组大鼠于实验前12h禁食，不禁水。最后一次给药1h后，腹腔注射10％的水合氯醛麻醉。大鼠仰卧固定，以BL-410生物信号采集系统记录Ⅱ导联心电，稳定30s，弃去心电图不正常的大鼠。乌头碱(纯品)经大鼠舌静脉给药，剂量为20μg/kg体重，3s内注入。观察大鼠心电图的变化情况，记录大鼠出现心律失常的时间(潜伏期)和心律失常的持续时间。结果：理气舒心片对照药A、理气舒心片对照药E注射乌头碱后出现心律失常时间长于空白对照组(p<0.05、p<0.01、p<0.001)；理气舒心片对照药A首次恢复正常心电图和完全恢复正常心电图时间较模型组、理气舒心片对照药E早(P＜0.05、p<0.01)，有统计学差异，并且呈现一定的时效效关系，见表6。

表6大鼠心律失常时间比较(x±S,n＝10)

与对照组比较*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001；与理气舒心片对照药E比较#P＜0.05、##P＜0.01

2.3对小鼠常压耐缺氧的影响

ICR小鼠，雌雄各半，40只，随机分为4组，空白组、阳性药金纳多组，理气舒心片对照药A、理气舒心片对照药E，每组10只。实验组每日给药1次，连续7d，空白组给予等容积的纯化水，末次给药1h后把小鼠分别置于经容量标定的250ml广口瓶中，瓶内置一片滤纸和10g钠石灰以吸收水份和二氧化碳，瓶盖涂以凡士林密封，记录小鼠的死亡时间，即存活时间。

结果，理气舒心片对照药A能明显延长小鼠存活时间，与空白组比较有显著性差异(p<0.05)且小鼠存活时间长于理气舒心片对照药E。见表7。

表7对小鼠存活时间的影响(x±s)

与空白对照组比较*p<0.05

2.4结论

利用本发明质量检测方法监控合格的中成药理气舒心片的抗心肌缺血、抗心率不齐作用 比较明显且疗效稳定。