一种混合菌生物传感器检测污染物生物毒性的方法

摘要

本发明公开一种混合菌生物传感器检测污染物生物毒性的方法，包括如下步骤：1)制备微生物菌液，其包括酵母菌液、大肠杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液；2)将所述微生物菌液与混合溶胶混合均匀后涂覆于柔性薄膜上，制得微生物薄膜；3)将所述微生物薄膜组装到电极上，即制得混合菌生物传感器；4)检测待测样品；5)评价待测样本的生物毒性。所述混合菌生物传感器，可用于评价重金属、酚和/或农药的单一毒性及联合毒性。检测具有便捷快速的特点，同时可以避免单一菌种对有毒物质敏感性具有差异的限制。不仅提高水体复合污染体系综合毒性分析的灵敏度，而且能反映污染物毒性的真实情况。

说明书

技术领域

本发明涉及生物毒性检测领域，具体地涉及由真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌组成的混合菌作为受试微生物制备成的混合菌生物传感器，对环境污染物进行生物毒性检测。

背景技术

随着工农业生产的快速发展和人们生活水平的提高，人工合成化学物质的种类及用量急剧增加，农药、化肥、重金属、工业废水和生活垃圾等大量排入环境，对环境造成了严重污染。因此检测环境中污染物的生物毒性在判断环境的生物安全程度、环境治理和农业种植安全方面都有着重要的作用。

现在存在利用单一微生物检测环境污染物生物毒性的方法，然而利用单一微生物细胞进行生物毒性检测时，易受到微生物种类的影响，因为不同种类的微生物对污染物毒性的敏感性不同，所以基于单一菌株的毒性评价具有不能客观反映污染物真实毒性作用的局限性。另外，现有的活性污泥法评价生物毒性有一定局限性，因为不同地点、不同时间采集的活性污泥菌群组成差异较大，使得毒性检测结果没有对比性。

另外，在自然环境中，污染不仅由一种物质导致，存在两种或多种化学物质时，不同物质之间的生物毒性会产生协同作用，即会引起与各物质单独作用时完全不同的毒性反应。迄今为止，大多数生物毒性检测都是针对单一污染物的实验，现行的水质标准也是根据单一金属的毒性试验确定的，不能有效地反映出多种有毒物质的协同毒性效应。因此研究两种或多种化学品的联合毒性效应逐渐成为环境毒理学研究的重要方向，它能为环境标准的制定和生态风险评价提供更可靠的依据。

因此，需要提供一种检测环境污染物的方法，其能够检测环境污染物的生物毒性，同时可避免单一微生物对毒性物质的敏感程度的局限性，还能客观反映多种毒性物质的毒性协同作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种混合菌生物传感器检测污染物生物毒性的方法，包括如下步骤：

1)制备微生物菌液，其包括酵母菌液、大肠杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液；

2)将所述微生物菌液与混合溶胶混合后涂覆于柔性薄膜上，制得微生物薄膜；

3)将所述微生物薄膜组装到电极上，即制得混合菌生物传感器；

4)检测待测样品；

5)评价待测样本的生物毒性。

其中制备微生物菌液的方法为：

1)将微生物接种于培养基中培养至对数生长期；

2)收集菌体，获得菌体沉淀；

3)洗涤菌体沉淀；

4)用分散液分散菌体沉淀，制成微生物分散液；

5)按比例混合不同种类的微生物分散液，制成微生物菌液。

上述方法中，培养微生物的培养基为本领域所公知的适于微生物生长的培养基，例如大肠杆菌接种的培养基为LB培养基、SOB培养基或SOC培养基等，优选LB培养基；所述枯草芽孢杆菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或LBG培养基，优选为牛肉膏蛋白胨培养基；所述酵母菌的培养基为YPD培养基、YPED培养基或YPEG培养基等，优选YPED培养基。

进一步地，微生物的培养条件也是本领域公知的，包括但不限于，大肠杆菌的培养条件为37℃于LB培养基中培养16-24h；枯草芽孢杆菌的培养条件为37℃于牛肉膏蛋白胨培养基培养16-24小时；酵母菌的培养条件为30℃于YPED培养基中培养24-30小时。

在上述方法中，优选地，用离心法收集培养的菌体，以获得菌体沉淀。

菌体沉淀的洗涤可采用常规的缓冲液，以去除菌体培养中可能影响后续测试结果的物质。如磷酸缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、HEPEs缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或氯化钠溶液。优选地，所述洗涤溶液为0.85％的氯化钠溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。

优选地，所述分散液为水溶液、氯化钠溶液或培养基，优选为氯化钠溶液，更优选为0.85％的氯化钠溶液。

微生物菌液中大肠杆菌：枯草芽孢杆菌：酵母菌为1-3:1-3:1；优选地，大肠杆菌：枯草芽孢杆菌：酵母菌为2:2:1。

所述混合溶胶为聚乙烯醇(PVA)溶胶、聚乙烯醇-4-乙基吡啶接枝聚合物溶胶、聚乙烯醇-硫酸钠溶胶或聚乙烯醇-海藻酸盐混合溶胶，优选为聚乙烯醇-海藻酸盐混合溶胶。

所述柔性薄膜为聚氨基甲酸酯薄膜、聚二甲基硅氧烷薄膜、聚氯乙烯薄膜或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜，优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜。

所述电极为铂电极、玻碳电极、金刚石电极，优选为铂电极。

所述混合菌生物传感器可置于4℃保存，保存时间为2-6小时。

所述待测样本检测的方法包括如下步骤：

1)加入呼吸介质；

2)施加电压，并检测电流。

3)加入苯醌溶液，并检测电流，获得第一电流强度；

4)加入待测样本；

5)检测电流，获得第二电流强度；

所述呼吸介质包括乳酸钠、琥珀酸、葡萄糖和氯化钠，优选为10mM乳酸钠、10mM琥珀酸钠、10mM葡萄糖和0.85％氯化钠。

所施加的电压为0.2V-0.7V(vs.Ag/AgCl)，优选为0.3V(vs.Ag/AgCl)。

所述苯醌溶液最终浓度为0.1mM-1mM，优选为0.4mM。

用抑制率评价待测样本的生物毒性，抑制率的计算公式如下：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是第一电流强度，I₂是第二电流强度。

通过检测不同浓度的待测样本可得到相应的抑制率，以待测样本的浓度对抑制率进行曲线拟合，抑制率为50％时的待测样本的浓度定义为该待测样本的IC50。并将IC50计为被测物质的1个毒性单位(TU)。

本发明检测原理见图1。

本发明的有益效果如下：

本发明以混合菌液作为受试微生物，制备混合菌生物传感器，可用于评价重金属、酚和/或农药的单一毒性及联合毒性。检测具有便捷快速的特点，同时可以避免单一菌种对毒物敏感性具有差异的限制。不仅提高水体复合污染体系综合毒性分析的灵敏度，而且能反映污染物毒性的真实情况。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出基于混合菌生物传感器检测有毒物质生物毒性的基本原理图。

图2示出混合菌生物传感器检测Cu²⁺生物毒性的结果。

图3示出混合菌生物传感器检测Cd²⁺生物毒性的结果。

图4示出混合菌生物传感器检测DCP生物毒性的结果。

图5示出混合菌生物传感器检测乙酰甲胺磷生物毒性的结果。

图6示出混合菌生物传感器检测莠灭净生物毒性的结果。

图7示出混合菌生物传感器检测实际废水生物毒性的结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

培养基的配制：

酿酒酵母的培养基(YEPD)配制方法如下：取1g酵母膏和2g蛋白胨溶于90ml超纯水中，取1g葡萄糖溶于10ml超纯水中，于120℃高压灭菌锅中分别灭菌20min，自然冷却后混合即可使用。

大肠杆菌的培养基(LB)配制方法如下：取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨和0.5g氯化钠溶于100mL超纯水中，调节pH至7.0-7.4，于高压蒸汽灭菌中120℃灭菌20min，自然冷却后即可使用。

枯草芽孢杆菌的培养基配置如下：取1g蛋白胨、0.3g牛肉提取物和0.5g氯化钠溶于100mL超纯水中，调节pH至7.0，于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，自然冷却。

微生物的培养：

向YPED培养基中接种酿酒酵母(S288C)，在30℃恒温水浴培养24h，摇床速度200rpm；

向LB培养基接种大肠杆菌(ATCC 25922)，培养条件为37℃恒温水浴培养16h，摇床速度180rpm；

向枯草芽孢杆菌的培养中接种枯草芽孢杆菌(菌号：1.1086)，培养条件是条件为37℃恒温水浴培养24h，摇床速度180rpm；

即将菌体培养至对数生长期。

菌体收集

酵母菌的收集：将培养所得的酵母菌离心分离，转速为10000rpm，离心10min，用PBS将离心所得的菌体沉淀清洗两次，然后将清洗后的菌体沉淀重新悬浮在PBS中，得到一定浓度的菌液待用；

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的收集：

第一次离心分离所采用的转速是6000rpm，时间为6min。随后用0.85％氯化钠溶液将菌体沉淀清洗两次，两次清洗采用的转速是5000rpm，时间为5min。最后将清洗后得到菌体沉淀分散到0.85％氯化钠溶液中，得到菌体分散液。

菌液混合：

将三种菌体混合配制成混合菌液，混合比例为大肠杆菌：枯草芽孢杆菌：酵母菌＝2:2:1。

生物薄膜的制备：

取100μl 10％(w/v)PVA溶胶(皂化值98％，聚合度2400)，10μl的1.0M硫酸钠，40μl 0.8％(w/v)海藻酸钠和50μl混合菌悬浮液混合均匀，将所得到的混合液旋涂于聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，将涂覆有混合菌的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜浸入到2％(w/v)CaCl₂中，在20-25℃条件下保持15-20min，干燥后即得到一次性使用的微生物薄膜，放入4℃冰箱中冷藏待用。

生物毒性的检测方法：

在室温条件下，将生物膜固定在铂电极表面，组装成混合菌生物传感器，向混合菌生物传感器中加入10ml pH＝7.0的呼吸基质，所述呼吸介质含有10mM乳酸钠、10mM琥珀酸钠、10mM葡萄糖和0.85％氯化钠，施加0.3V(vs.Ag/AgCl)的电压，采用计时电流法对电流大小进行实时的监测；待体系稳定5min后加入100μl苯醌溶液，其中苯醌的最终浓度为0.4mM，待电流信号稳定，记录第一电流值(I₁)，然后加入毒物，检测并记录第二电流值(I₂)。利用抑制率计算生物毒性，且根据IC50来判断生物毒性的强弱。将IC50计为被测物质的1个毒性单位(TU)。

联合生物毒性的检测方法：

将毒性单位相同的两种毒物按1:1混合制成混合样本，按照所述生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得该混合样本的实测IC50(IC50_obs)。通过比较预期IC50值(IC50_exp)和实测值IC50(IC50_obs)的大小来判断联合毒性的类型。其中预期IC50exp的计算方法为：将两种单一毒物的IC50值相加。当IC50_exp>IC50_obs就说明两种毒物的生物毒性具有拮抗作用；预期IC50_exp<IC50_obs说明两种毒物的生物毒性具有协同作用；IC50_exp＝IC50_obs，说明两种毒物的生物毒性具有相加作用。拮抗作用是联合生物毒性小于各化学物质单独作用于机体时产生的生物毒性的总和，即是某一化学物质能够减弱另一化学物质的生物毒性；协同作用则是联合生物毒性远远超过各化学物质单独作用于机体时产生的生物毒性的总和；相加作用是指多种环境化学物质同时作用于机体所产生的联合生物毒性是各化学物质单独作用于机体时产生的生物毒性的总和。

实施例1：检测Cu²⁺的生物毒性

制备10、15、20、25、30mg/L的Cu²⁺溶液，检测不同浓度的Cu²⁺的生物毒性并根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线。计算得到Cu²⁺的IC50。结果见表1和图2。

实施例2：检测Cd²⁺的生物毒性

制备10、15、20、25、30mg/L的Cd²⁺溶液，检测不同浓度的Cd²⁺的生物毒性并根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线。计算得到Cd²⁺的IC50。结果见表1和图3。

实施例3：检测3,5-二氯苯酚(DCP)的生物毒性

制备10、15、20、25、30mg/L(浓度)的3,5-二氯苯酚，按照实施例1的方法检测不同浓度的3,5-二氯苯酚(DCP)的生物毒性，并根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线。计算得到DCP的IC50。结果见表1和图4。

实施例4：检测乙酰甲胺磷的生物毒性

制备10、20、30、40、50mg/L(浓度)的农药杀虫剂乙酰甲胺磷，按照实施例1的方法检测不同浓度的乙酰甲胺磷的生物毒性，并根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线。计算得到乙酰甲胺磷的IC50。结果见表1和图5。

实施例5：检测除草剂莠灭净的生物毒性

制备10、15、20、30、40mg/L(浓度)的除草剂莠灭净，按照实施例1的方法检测不同浓度的莠灭净的生物毒性，并根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线。计算得到Cd²⁺的IC50。计算得到莠灭净的IC50。结果见表1和图6。

表1:单一毒物的IC50值

毒物Cu²⁺Cd²⁺3,5-二氯苯酚(DCP)乙酰甲胺磷莠灭净IC50(mg/L)25.5016.5017.1028.3018.67

实施例6：对实际废水的生物毒性检测

对垃圾填埋场废水、电镀废水和实验室有机废水的生物毒性进行检测，检测方法同以上实施例1，其抑制率分别为39.83％，48.15％和51.77％，结果见图7。

实施例7：检测Cu²⁺和Cd²⁺的联合生物毒性

将毒性单位相同的Cu²⁺和Cd²⁺按1:1混合制成Cu²⁺-Cd²⁺混合样本，所选取的浓度梯度为20％TU、40％TU、60％TU、80％TU、100％TU、120％TU，按照联合生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得Cu²⁺-Cd²⁺混合样本的IC50_obs，并且对比IC50_obs和IC50_exp的大小，确定Cu²⁺和Cd²⁺的联合毒性类型。结果见表2。

实施例8：检测Cu²⁺和DCP的联合生物毒性

按照实施例7的方法制备Cu²⁺-DCP混合样本，按照联合生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得Cu²⁺-DCP混合样本的IC50_obs，并且对比IC50_obs和IC50_exp的大小，确定Cu²⁺和DCP的联合毒性类型。结果见表2。

实施例9：检测乙酰甲胺磷和DCP的联合生物毒性

按照实施例7的方法制备乙酰甲胺磷-DCP混合样本，按照联合生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得乙酰甲胺磷-DCP混合样本的IC50_obs，并且对比IC50_obs和IC50_exp的大小，确定乙酰甲胺磷和DCP的联合毒性类型。结果见表2。

实施例10：检测乙酰甲胺磷和Cu²⁺的联合生物毒性

按照实施例7的方法制备乙酰甲胺磷-Cu²⁺混合样本，按照联合生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得乙酰甲胺磷-Cu²⁺混合样本的IC50_obs，并且对比IC50_obs和IC50_exp的大小，确定乙酰甲胺磷和Cu²⁺的联合毒性类型。结果见表2。

实施例11：检测乙酰甲胺磷和莠灭净的联合生物毒性

按照实施例7的方法制备乙酰甲胺磷-莠灭净混合样本，按照联合生物毒性的检测方法检测该混合样本的抑制率，并绘制浓度-抑制率曲线，获得乙酰甲胺磷-莠灭净混合样本的IC50_obs，并且对比IC50_obs和IC50_exp的大小，确定乙酰甲胺磷和莠灭净的联合毒性类型。结果见表2。

表2混合毒物的毒性检测及其作用类型

实施例12：单一菌和混合菌生物传感器检测生物毒性的对比

利用单一大肠杆菌、单一枯草芽孢杆菌和单一酿酒酵母菌制备单菌种生物传感器，并分别对10mg/L的DCP，10mg/L的Cu²⁺和25mg/L的莠灭净的生物毒性进行检测。将实验结果分别与实施例3、实施例1和实施例5的结果进行对比，结果见表3。

单菌种生物传感器的制备方法与混合菌生物传感器的制备方法基本相同，不同之处仅在于，单菌种生物传感器只含有一种菌体，即含有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌中的一种，而混合菌生物传感器含有三种菌，即大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌。另外大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的菌体培养、菌体收集、菌体分散液的制备同实施例1。测试结果如表3。由下表可知，单菌种生物传感器的检测灵敏度无论是对有机毒物DCP、重金属离子Cu²⁺还是有机农药莠灭净均不如混合菌生物传感器。

表3：混合菌

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。