一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及细胞工程和组织领域，具体而言，涉及一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法。本发明通过对现有的分离培养方法进行了改进，在Ⅰ型胶原酶消化后，采用冷消化技术处理细胞，通过加入研磨珠的方式充分分离前体脂肪细胞，并且取消了尼龙筛过滤、离心和红细胞裂解的操作，从而取得了提高实验的时间进行自由度、前体脂肪细胞分离程度更彻底以及简化操作流程、减小污染几率、降低对前体脂肪细胞的损伤等技术效果。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程和组织领域，具体而言，涉及一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法。

背景技术

从脂肪组织中分离培养的细胞多称为“前体脂肪细胞”。前体脂肪细胞是一类具有增殖分化能力的脂肪细胞前体，在体内多种因素的影响下聚脂分化而成为成熟脂肪细胞。前体脂肪细胞的体外培养不仅能完整地认识脂肪组织发生和增生的全过程，并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控。此外，脂肪细胞增殖和分化失控会导致肥胖，并与糖及脂肪代谢、机体能量平衡、肥胖症、II型糖尿病等有非常密切的关系。因此，选择合适的动物模型在体外重现前体脂肪细胞增殖肥大的全过程对于探讨上述生命和疾病过程具有重要意义。

猪是肥胖程度最高的动物，脂肪沉积最迅速，且与啮齿类哺乳动物及禽类的脂肪沉积部位及沉积模式啮齿类哺乳动物及禽类的脂肪沉积部位及沉积模式存在显著差异，与人的更为接近，因而猪的脂肪细胞增殖与分化模式为研究人类机体脂肪沉积提供了一个理想模型，同时为研究不同动物的脂肪沉积模式提供参考。目前，国内己成功建立了大鼠、小鼠、人、棋牛和兔的前体脂肪细胞体外分离培养模型，但猪前体脂肪细胞培养体系的建立还不够成熟，目前仍然存在着猪前体脂肪细胞操作繁琐、脂肪细胞分离程度不够、分离过程中细胞易受污染等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，所述的分离培养方法具有操作简便、脂肪细胞分离程度高、分离过程中细胞不易受到污染等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)、分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织并去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；漂洗并将组织剪碎后与研磨珠一起加入到盛有Ⅰ型胶原酶溶液的容器中进行消化得到消化液；

2)、消化结束后通过加入细胞培养液混匀后静置分层的方法除去Ⅰ型胶原酶溶液；摇动所述容器使得研磨珠将剩余的组织研碎后接种到培养瓶中进行培养；

3)、待细胞培养至融合度为75％～85％后对细胞进行消化并接种于培养板中培养备用。

脂肪细胞的增殖、分化与人类肥胖和畜禽体脂过渡沉积密切相关，关于人类肥胖和动物体脂的过度沉积更是国内外学者关注的热点问题。而脂肪前体细胞培养通常是这些研究的基础。

由于3～5日龄猪体内含有较多的前体脂肪组织，故而选择此阶段的仔猪作为实验动物。但是此阶段的仔猪脂肪组织的量较少，所以每次获得前体脂肪细胞的量有限，本方法在现有的技术基础上，加入了研磨珠撞击组织块的操作，可以最大程度的将细胞分离出来，大大增加了脂肪细胞的获取量。

此外，现有技术将消化物需要经过2次尼龙筛过滤(用100μm和25μm)消化产物和3次离心处理，污染几率增加。而本发明去掉尼龙筛过滤和离心步骤，简化了操作流程，降低了污染几率，同时也降低了操作过程对细胞的伤害。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，在步骤1)中，去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织之前还包括：

用含双抗的PBS缓冲液浸泡仔猪皮下脂肪组织8min～15min。

用含双抗的PBS缓冲液浸泡可软化脂肪组织，并使操作视野清晰，易于血管和结缔组织剥离的操作。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，在步骤1)中，所述漂洗具体为用含双抗的PBS缓冲液漂洗2～3次。

双抗指青霉素和链霉素。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，所述将组织剪碎具体为将组织剪成0.5mm³～1.5mm³的小块。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，所述研磨珠为氧化锆珠、钢珠、玻璃珠、陶瓷珠中的一种或多种。

研磨珠的选择只要是满足高强度、高耐磨性和低吸油墨率等特性的珠子均可，如氧化铝研磨珠、硅酸锆珠等均可。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，在步骤1)中，所述Ⅰ型胶原酶溶液中Ⅰ型胶原酶的质量百分数为0.08％～0.12％；Ⅰ型胶原酶溶液的体积为剪碎后组织的2～4倍；

所述消化的条件为：

2℃～6℃消化10h～16h，随后36～38℃消化15min～30min。

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。Ⅰ型胶原酶用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离，因此适用于本发明。

现有技术取样后，直接放入37℃消化60min～90min，从细胞分离到细胞接种，工作人员所耗时间长，有时由于时间的安排，就需要熬夜；而本方法采用冷消化法，在加入0.08％～0.12％的Ⅰ型胶原酶后可放入冰箱进行过夜消化，第2天再放入36℃～38℃消化15min～30min，工作人员可以根据时间安排情况，选择冷消化或热消化，提高了实验的选择空间和自由度。此外，37℃条件下消化容易过度消化，导致细胞贴壁、生长不佳，冷消化可对此进行改善。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，在步骤2)中，所述静置分层的方法具体为：

A)、消化结束后，向所述容器中加入与所述消化液等体积的细胞培养液，静置8min～12min后弃上清；

B)、再加入10ml～20ml细胞培养液，轻轻摇匀清洗消化物，静置8min～12min后弃上清；

C)、重复步骤B两次。

消化一般在50ml的锥形瓶中进行，静置分层的方法除去Ⅰ型胶原酶溶液，防止消化过度损伤细胞以及胶原酶残存导致细胞贴壁困难。

在步骤B)中，清洗的时候动作要轻，这个时候，前体脂肪细胞还没分离出来，清洗的目的是为了更好的去掉组织外面的消化酶。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，在步骤2)中，摇动所述容器使得研磨珠将剩余的组织研碎后接种到培养瓶中进行培养的操作具体包括：

弃上清后，均匀用力摇动所述容器，使所述研磨珠撞击消化物，摇1min～3min后加入10ml～20ml细胞培养液，继续摇1min～3min，将上层液体接种到培养瓶中。

经过前面的消化处理后，组织已经消化的很稀松了。此步骤的用力摇动，在研磨珠子的机械力冲击作用下，前体脂肪细胞就从小组织块里散出来。随后需要快速地将上层液体倒入培养瓶中，注意尽量不要把组织块倒进去。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，步骤3)的操作具体为：

细胞接种2～3h后换液、清洗，继续培养；待细胞培养至融合度为75％～85％后倒掉培养基，依次用PBS和0.2％～0.3％的胰蛋白酶消化液清洗细胞；

加入0.2％～0.3％的胰蛋白酶消化液孵育至85％～95％的细胞变圆后停止消化；

用细胞培养液清洗并吹打细胞使细胞从培养瓶瓶底脱落，接种于培养板中培养备用。

根据红细胞不贴壁的特点，2～3h后换液可以有效去除红细胞。现有技术中，通常会采用加入红细胞裂解液并配合离心的方法去除红细胞，但此操作会增加操作的工序，更重要的是红细胞裂解液可能会对前体脂肪细胞造成额外的损伤。本申请用2～3h后换液，并清洗1～2次的操作同样可达到去除红细胞的作用，条件更温和，对前体脂肪细胞的损伤更小。

重新接种的过程也是纯化细胞的一个过程，经过2～3h后的换液虽然已经去除了大部分的成肌细胞和红细胞，但是可能还存在其他少量的基质细胞，前体脂肪细胞占大部分；经过重新接种，少量的杂细胞生长不占优势，就可以被很好的去掉了。

其中，胰蛋白酶消化液的百分数为质量体积百分数，0.2％～0.3％的胰蛋白酶消化液即浓度0.2g/100ml～0.3g/100ml。

优选的，如上所述的猪前体脂肪细胞的分离培养方法，所述细胞培养液为含有体积百分数为8％～12％的FBS的DMEM/F12培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、现有技术取样后，直接放入37℃消化60min～90min，从细胞分离到细胞接种，工作人员所耗时间长，有时由于时间的安排，就需要熬夜；而本方法采用冷消化法，在加入0.08％～0.12％的Ⅰ型胶原酶后可放入冰箱进行过夜消化，第2天再放入36℃～38℃消化15min～30min，工作人员可以根据时间安排情况，选择冷消化或热消化，提高了实验的选择空间和自由度。此外，37℃条件下消化容易过度消化，导致细胞贴壁、生长不佳，冷消化可对此进行改善。

2)、由于3～5日龄猪，脂肪组织的量较少，所以每次获得前体脂肪细胞的量有限，本方法在现有的技术基础上，加了研磨珠撞击组织块，可以最大程度的将细胞分离出来。

3)、现有技术中，消化物需要经过2次尼龙筛过滤(用100μm和25μm)，污染几率增加。而本发明去掉尼龙筛过滤、离心和红细胞裂解步骤，简化了操作流程，也降低了污染几率，减小了对前体脂肪细胞造成的损伤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为现有技术和本申请实施例5分离得到的细胞培养后的细胞生长曲线；

图2为实施例5分离得到的细胞接种培养板24h后的培养照片；

图3为实施例5分离得到的细胞接种培养板5天后的培养照片；

图4为实施例5分离得到的细胞经诱导后分化为成熟脂肪细胞，用油红O染色，脂滴染成红色后的照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)、分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织并去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；漂洗并将组织剪碎后与研磨珠一起加入到盛有Ⅰ型胶原酶溶液的容器中进行消化得到消化液；

2)、消化结束后通过加入细胞培养液混匀后静置分层的方法除去Ⅰ型胶原酶溶液；摇动所述容器使得研磨珠将剩余的组织研碎后接种到培养瓶中进行培养；

3)、待细胞培养至融合度为75％～85％后对细胞进行消化并接种于培养板中培养备用。

实施例2

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)、分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织，用含双抗的PBS缓冲液浸泡仔猪皮下脂肪组织8分钟，去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织并用含双抗的PBS缓冲液漂洗3次；漂洗并将组织剪碎成0.5mm³～1.5mm³的小块后与氧化锆珠、陶瓷珠一起加入到盛有质量百分数0.08％的Ⅰ型胶原酶溶液的容器中进行消化，先于2℃消化16h，随后36℃消化30min。其中，Ⅰ型胶原酶溶液的体积为剪碎后组织的2倍；

2)、消化结束后，向所述容器中加入与所述消化液等体积的细胞培养液，静置8min后弃上清；再加入10ml细胞培养液，轻轻摇匀清洗消化物，静置8min后弃上清，重复该操作2次；

随后均匀用力摇动所述容器，使所述研磨珠撞击消化物，摇3min后加入10ml细胞培养液，继续摇1min，将上层液体接种到培养瓶中；

所述细胞培养液为含有体积百分数为8％的FBS的DMEM/F12培养基；

3)、待细胞培养至融合度为85％后对细胞进行消化并接种于培养板中培养备用。

实施例3

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)、分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织，用含双抗的PBS缓冲液浸泡仔猪皮下脂肪组织15分钟，去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织并用含双抗的PBS缓冲液漂洗2次；漂洗并将组织剪碎成0.5mm³～1.5mm³的小块后与研磨珠一起加入到盛有质量百分数0.12％的Ⅰ型胶原酶溶液的容器中进行消化，先于6℃消化10h，随后38℃消化15min。其中，Ⅰ型胶原酶溶液的体积为剪碎后组织的4倍；

2)、消化结束后，向所述容器中加入与所述消化液等体积的细胞培养液，静置12min后弃上清；再加入20ml细胞培养液，轻轻摇匀清洗消化物，静置12min后弃上清，重复该操作2次；

随后均匀用力摇动所述容器，使所述陶瓷珠撞击消化物，摇1min后加入20ml细胞培养液，继续摇3min，将上层液体接种到培养瓶中；

3)、细胞接种2h后换液、清洗，继续培养；待细胞培养至融合度为75％后倒掉培养基，依次用PBS和0.3％的胰蛋白酶消化液清洗细胞；

加入0.3％的胰蛋白酶消化液孵育至95％的细胞变圆后停止消化；

用细胞培养液清洗并吹打细胞使细胞从培养瓶瓶底脱落，接种于培养板中培养备用；

所述细胞培养液为含有体积百分数为12％的FBS的DMEM/F12培养基。

实施例4

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)、分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织，用含双抗的PBS缓冲液浸泡仔猪皮下脂肪组织10分钟，去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织并用含双抗的PBS缓冲液漂洗3次；漂洗并将组织剪碎成0.5mm³～1.5mm³的小块后与钢珠一起加入到盛有质量百分数0.1％的Ⅰ型胶原酶溶液的容器中进行消化，先于4℃消化14h，随后37℃消化15min。其中，Ⅰ型胶原酶溶液的体积为剪碎后组织的4倍；

2)、消化结束后，向所述容器中加入与所述消化液等体积的细胞培养液，静置10min后弃上清；再加入15ml细胞培养液，轻轻摇匀清洗消化物，静置10min后弃上清，重复该操作2次；

随后均匀用力摇动所述容器，使所述研磨珠撞击消化物，摇2min后加入20ml细胞培养液，继续摇3min，将上层液体接种到培养瓶中；

3)、细胞接种3h后换液、清洗，继续培养；待细胞培养至融合度为85％后倒掉培养基，依次用PBS和0.2％的胰蛋白酶消化液清洗细胞；

加入0.2％的胰蛋白酶消化液孵育至85％的细胞变圆后停止消化；

用细胞培养液清洗并吹打细胞使细胞从培养瓶瓶底脱落，接种于培养板中培养备用；

所述细胞培养液为含有体积百分数为10％的FBS的DMEM/F12培养基。

实施例5

一种猪前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1、猪脂肪组织的分离和消化

无菌条件下分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织，把剪下的脂肪组织方在玻璃皿中，用含双抗的PBS缓冲液浸泡10min，去除肉眼可见的结缔组织和血管后，用含双抗的PBS缓冲液清洗2次，将脂肪组织转移到另一个干净的玻璃皿中，用眼科手术剪将脂肪组织剪成1mm³左右的小块，之后将脂肪组织小块转入一个50ml的带盖锥形瓶中(瓶中加有5～10颗灭菌的小玻璃珠)，向锥形瓶中加入约为组织块3倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，盖好盖子，用封口膜将瓶口封好，放入4℃冰箱进行消化12h，第2天再放入37℃震荡水浴锅消化20min。

2、前体脂肪细胞的接种培养

消化结束后，向锥形瓶中加入等体积的10％FBS的DMEM/F12培养基，静置10min后，弃上清，再加入15ml 10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，轻轻摇匀，清洗消化物，静置10min后弃上清，重复洗两次，弃上清后，均匀用力摇锥形瓶，让玻璃珠撞击消化物，摇2min后，加入15ml 10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，继续摇2min后，快速将上层液体接种到培养瓶中。置于37℃、5％CO₂培养箱培养。2h后换液，用无血清DMEM/F12培养基洗去未贴壁的细胞，继续置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

3、前体脂肪细胞的纯化

细胞接种2h后，换液，PBS洗细胞2次，加入10％的FBS的DMEM/F12继续培养，待细胞培养至80％融合后，倒掉培养基，用PBS清洗1次，用温育过的0.25％的胰蛋白酶消化液清洗细胞1次，然后重新加入3ml 0.25％的胰蛋白酶消化液，孵育片刻，显微镜下观察到90％的细胞均变圆，掉到消化液，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基清洗1次，然后加入6ml10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，以5×10⁴/cm²密度接种于培养板，即可用于后续研究。

实验例

取脂肪组织10ml分别采用现有技术和最佳实施例——实施例5(即图1中的改进技术)中的方法进行消化分离获得的前体脂肪细胞，经台盼蓝染色，计数分析，选用相同的原料，实施例5的方法分离得到的猪前体脂肪细胞浓度为8.7×10⁴个/ml，而现有技术仅为5.6×10⁴个/ml，即改进后的提取方法分离获得猪前体脂肪细胞的量显著高于现有技术所获得细胞的量。两种细胞生长曲线都呈S型(图1)。改进方法获得的细胞形态与现有技术没有差别，在接种培养板24h后，细胞均已贴壁，呈梭型或不规则形(图2)，接种培养板5天后，随着细胞增殖，细胞之间开始融合(图3)。经诱导，实施例5分离的细胞也可分化为成熟脂肪细胞，用油红O染色，脂滴可染成红色(图4)。

为叙述方便，本发明仅在实验例中给出了最佳实施例5的效果，但实际上在本申请权利要求的记载范围内该效果均可实现，实施例1～4的细胞生长曲线与现有技术相比均无显著性差异，且细胞形态也大致相同。

由此可见，经过本发明提供的猪前体脂肪细胞的分离培养方法分离得到猪前体脂肪细胞在取得了提高实验的时间进行自由度、前体脂肪细胞分离程度更高以及减小污染几率等技术效果的前提下，还保持了正常的生长状态。

注：现有技术的实施方式为：

无菌条件下分离3～5日龄仔猪皮下脂肪组织，PBS清洗3次，去除肉眼可见的结缔组织和血管后，用剪刀剪成1mm³左右的小组织块，放入带盖小瓶中，加入0.1％Ⅰ型胶原酶37℃消化60min～90min左右(每5min震荡一次)，再用100μm和25μm的双层尼龙筛过滤消化物，将滤液1500r/m离心10min，弃上清液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min，再1000r/m离心5min，弃上清液，加入无血清培养液，吹打均匀，即可获得猪前体脂肪细胞，5×10⁴个/cm²的密度将前体脂肪细胞接种于6孔培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。