一种测定盐酸右美托咪啶中氯甲烷、氯乙烷的方法

摘要

本发明公开了一种测定盐酸右美托咪啶原料药中氯甲烷、氯乙烷的方法，它包括如下步骤：气相色谱仪的色谱柱为DB‑5毛细管，载气为氮气，检测器为ECD，进样方式为顶空进样。吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各1ml置顶空瓶中，密封，孵化，取上部气体100µl注入气相色谱仪，记录色谱图。氯甲烷的线性范围为0.1010‑0.6059µg/ml，氯乙烷的线性范围为0.1290‑0.7742µg/ml。本发明应用气相色谱法测定盐酸右美托咪啶原料药中氯甲烷、氯乙烷的残留，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，通过检测盐酸右美托咪啶原料药中氯甲烷、氯乙烷的残留量，能够更好控制盐酸右美托咪啶的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种气相色谱测定盐酸右美托咪啶中氯甲烷、氯乙烷的方法。

背景技术

盐酸右美托咪啶为是α2-肾上腺素受体激动剂，主要用用于行全身麻醉的手术患者气管插管和机械通气时的镇静。

盐酸右美托咪啶生产过程中会使用甲醇、乙醇作为溶剂，由于盐酸和甲醇、乙醇会产生亲核取代反应生成氯甲烷、氯乙烷。氯甲烷、氯乙烷属于卤代烷烃，具有基因毒性，为此需要对其残留量进行控制，实现氯甲烷、氯乙烷的分离检测，对其质量控制方面具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是建立一种测定盐酸右美托咪啶原料中氯甲烷、氯乙烷的方法，可以更好的控制盐酸右美托咪啶原料药中残留的氯甲烷、氯乙烷，可以更好的对盐酸右美托咪啶原料药中可能存在的基因毒杂质进行检测。

本发明的技术方案是，气相色谱测定盐酸右美托咪啶原料药中氯甲烷、氯乙烷的方法，它包括如下步骤：

对照溶液制备：取氯甲烷和氯乙烷适量，精密称定，用DMSO溶解制成每1ml中各约含0.6μg氯甲烷、0.6μg氯乙烷作为对照溶液；

供试品溶液制备：本品适量，加DMSO溶解液制成每1ml含盐酸右美托咪啶20mg的溶液，作为供试品溶液；

空白溶液的制备：DMSO；

色谱柱为：DB-5石英毛细管柱；

色谱条件：柱温初始为40℃，保持12分钟，以每分钟升温50℃的速率升至250℃，保持10分钟；再以每分钟升温50℃的速率升至40℃，保持5分钟；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；流速：0.8ml/min

顶空条件：加热炉温度：45℃；取样针温度：55℃，保温时间40min，进样量100µl。

进样：取对照溶液、供试品溶液、空白溶液各1ml，分别置10ml顶空瓶中，密封，放入顶空加热装置，顶空进样记录色谱图；

计算对照品溶液浓度的值与相应峰面积值的线性回归方程，相关系数而应不小于0.99，对照品溶液峰形对称，理论塔板数以氯甲烷计2000以上；供试品溶液色谱图中如有氯甲烷、氯乙烷色谱峰，应与对照溶液中氯甲烷、氯乙烷色谱峰保留时间一致，空白溶液色谱图，无与氯甲烷、氯乙烷对照品相同的峰出现，即空白溶液无干扰；

每克盐酸右美托咪啶原料中对氯甲烷、氯乙烷分别不得过30ug，氯甲烷的浓度范围为0.1010~0.6059µg/ml，氯乙烷的浓度范围为0.1290~0.7742µg/ml。

附图说明：图1检测器条件摸索色谱图；

图2 进样方式摸索色谱图；

图3选色谱柱的选择对比图；

图4空白干扰的排除色谱图；

图5色谱柱的确立色谱图；

图6色谱柱的筛选色谱图；

图7 氯甲烷的线性回归图；

图8 氯乙烷的线性回归图；

图9检测器温度变化测试结果对比图；

图10起始柱温变化测试结果对比图；

图11保温温度变化测试结果对比图；

图12进样量变化测试结果对比图；

图13流速变化测试结果对比图；

图14保温时间变化测试结果对比图；

图15分流比变化测试结果对比图。

以下通过实施例形式再对本发明的内容作进一步详细说明，但不应就此理解为本发明上述主题范围内仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本发明的范围内。

实施例1 试验方法筛选：检测器的条件摸索

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站；

试剂：氯甲烷、氯乙烷、DMSO；

色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm。

色谱条件：

色谱条件：柱温初始为40℃，保持7分钟，以每分钟升温50℃的速率升至250℃，保持25分钟；进样温度：200℃；检测器：FID；检测器温度：250℃；载气：N₂；流速：0.8ml/min分流：16ml/min。

顶空条件：加热炉温度：45℃；取样针温度：55℃，保温时间40min，进样量100µl。

供试溶液的制备：

0.01N氯甲烷溶液，取1.0Mol/L氯甲烷吸1ml至100ml，即得；

0.02N氯乙烷储备溶液，取2.0Mol/L氯乙烷吸1ml至100ml，即得；

空白溶液，DMSO；

样品10%，样品100mg加1mlDMSO。

结果见图1。

结论：在该色谱条件下使用FID检测器检测，氯甲烷的出峰时间为6.867min，氯乙烷的出峰时间为8.248min，DMSO出峰时间为11min左右，色谱图中有DMSO色谱峰，以及其他未知溶剂峰出现，这些色谱峰的出现会干扰氯甲烷、氯乙烷的检测。

实施例2 试验方法筛选：进样方式的摸索

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持10分钟，以每分钟升温50℃的速率升至220℃，保持25分钟；进样方式：液体进样；流速：0.8ml/min；进样量：1µl；进样温度：200℃；

检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；分流比：1：20。

对照品储备液的配制：精密量取5mg/ml的氯甲烷甲醇溶液0.5ml，于25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为对照品储备液。

对照溶液的配制：精密量取对照品储备液5ml，于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1ml中约含0.05mg氯甲烷溶液，作为对照溶液。

供试溶液的配制：精密称取本品100mg，到2ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1ml中约含50mg的样品，作为供试品溶液。

加样回收样品溶液配制：精密称取样品100mg，到2ml量瓶中，加入100µl对照品储备液，加甲醇定容至刻度，作为回收率100%的样品溶液。

取对照溶液、供试溶液、加样回收样品溶液分别吸取1µl进样，记录色谱图。

在7.8min处有溶剂峰，氯甲烷在5.8min处出峰。

结论：在该方法条件下，采用液体进样对氯甲烷的回收率试验的测定有干扰，导致氯甲烷响应值没有顶空气体进样高。结果见图2。

实施例3 试验方法筛选：程序升温的条件摸索

仪器与试剂：

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持7分钟，以每分钟升温50℃的速率升至250℃，保持25分钟；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；流速：0.8ml/min分流：16ml/min；

顶空条件：加热炉温度：45℃；取样针温度：55℃，保温时间40min，进样量100µl

0.01N氯甲烷溶液，0.02N氯乙烷储备溶液，DMSO；

2%样品，取20mg样品至1ml加DMSO溶解；

取上述溶液分别进样，记录色谱图。

结论：在该色谱条件下氯甲烷的出峰时间为9.240min，进样浓度大色谱峰拖尾。

氯乙烷的出峰时间为11.170min，进样浓度大色谱峰拖尾，且氯乙烷峰出现在程序升温以后，色谱基线不平。DMSO在7.253min处有色谱峰出现。

10%的样品在6.578分钟有峰出现。由于平衡时间短，初始基线不平。

实施例4 试验方法筛选：色谱柱的选择条件摸索

仪器：气相色谱仪（TrermoscientificTrace1300）Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持10分钟，以每分钟升温50℃的速率升至220℃，保持25分钟；进样方式：顶空进样；载气流速：0.8ml/min；进样量：100µl；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；分流比：1：20；顶空加热炉温度：45℃；保温时间：30min。

结果见图3，在7.2min、9.3min处有空气峰，氯甲烷在9.3min处出峰。

结论：在该方法条件下，采用DB-624石英毛细管柱氯甲烷峰和空气峰有干扰。

实施例5 试验方法筛选：色谱柱的选择条件摸索

仪器：气相色谱仪（TrermoscientificTrace1300）Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-WAX石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持10分钟，以每分钟升温50℃的速率升至220℃，保持25分钟；进样方式：顶空进样；载气流速：0.8ml/min；进样量：100µl；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；分流比：1：20；顶空加热炉温度：45℃；保温时间：30min。

对照品储备液的配制：精密量取5mg/ml的氯甲烷甲醇溶液0.5ml，于25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为对照品储备液。

对照溶液的配制：精密量取对照品储备液5ml，于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1ml中约含0.05mg氯甲烷溶液，作为对照溶液。

供试溶液的配制：精密称取本品100mg，到顶空瓶中，加入2ml的甲醇，制成每1ml中约含50mg的样品，作为供试品溶液。

加样回收样品溶液配制：精密称取本品100mg，到顶空瓶中，加入2ml的对照溶液，作为回收率100%的样品溶液。

取对照溶液、供试溶液、加样回收样品溶液分别进样，记录色谱图。

在7.07min、9.14min处有溶剂峰，氯甲烷在8.80min处出峰。

结论：在该方法条件下，采用DB-WAX石英毛细管柱氯甲烷峰和空气峰分离度达不到要求。

实施例6 试验方法筛选：空白干扰的排除

仪器与试剂：

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm,USD592144H

色谱条件：

色谱条件：柱温初始为40℃，保持12分钟，以每分钟升温50℃的速率升至250℃，保持10分钟；在以每分钟升温50℃的速率降至40℃，保持5分钟进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；流速：0.8ml/min分流：16ml/min。

顶空条件：加热炉温度：45℃；取样针温度：55℃，保温时间40min，进样量100µl。

取空瓶充了氮气的样品瓶，含有0.01mol/L氢氧化钠水溶液顶空瓶的分别进样，记录色谱图，结果见图4。

结论：

在该色谱条件下空瓶的出峰时间为7.102min，在9.133处有小峰出现。

充了氮气的样品瓶7.110min出峰的峰面积明显变小时间为，在9.433min仍然还有小峰出现。判断7.110min处色谱峰为空气中的氧气干扰。

含有0.01mol/L氢氧化钠水溶液9.4min出峰，减小判断9.4min处为二氧化碳。

实施例7 试验方法筛选：色谱柱的确立

仪器与试剂：

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-5石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm,USE381032H

色谱条件：

色谱条件：柱温初始为40℃，保持12分钟，以每分钟升温50℃的速率升至250℃，保持10分钟；在以每分钟升温50℃的速率降至40℃，保持5分钟进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N2；流速：0.8ml/min分流：16ml/min

顶空条件：加热炉温度：45℃；取样针温度：55℃，保温时间40min，进样量100µl。

取DMSO、含有0.0001Mol/L氯甲烷和0.0001Mol/L氯乙烷溶液的对照溶液分别放入顶空瓶分别进样记录色谱图，结果见图5。

结论：

空白溶剂的出峰时间为6.850min，和7.822min。

对照溶液中空气的出峰时间为6.850min，和7.818min，氯甲烷和氯乙烷的出峰时间为8.543min，和11.080min，空气对氯甲烷和氯乙烷的检测没有干扰。

实施例8 色谱柱的筛选

仪器：气相色谱仪TrermoscientificTrace1300、Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-5石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持10分钟，以每分钟升温50℃的速率升至220℃，保持25分钟；进样方式：顶空进样；载气流速：0.8ml/min；进样量：100µl；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；分流比：1：20；顶空加热炉温度：45℃；保温时间：30min。

结果见图6，在7.1min、8.5min处有空气峰，氯甲烷在8.7min处出峰。

结论：在该方法条件下，采用DB-5石英毛细管柱氯甲烷峰和空气峰能够分离。

实施例9 方法的专属性

仪器：气相色谱仪（TrermoscientificTrace1300）Trermoscientific色谱工作站

色谱柱：DB-5石英毛细管柱，30m×0.530mm×3.00µm

色谱条件：

柱温初始为40℃，保持10分钟，以每分钟升温50℃的速率升至220℃，保持25分钟；进样方式：顶空进样；载气流速：0.8ml/min；进样量：100µl；进样温度：200℃；检测器：ECD；检测器温度：250℃；载气：N₂；分流比：1：20。

取DMSO1ml放入顶空加热炉加热后进样，作为空白，记录色谱图结果表明溶剂DMSO对氯甲烷、氯乙烷测定无干扰。各组分的定性：分别取含氯甲烷1.5μg/ml、氯乙烷1.8μg/ml的DMSO溶液，各取1ml密封放入顶空加热炉加热后进样，记录色谱图。各溶剂峰保留时间见表1。

表1 各溶剂的保留时间

以系统适用性项下测试结果评价，取标准溶液的色谱图，各残留溶剂出峰顺序依次为空气、氯甲烷、氯乙烷其保留时间和相对保留时间比（RRT）数据见表2。

表2 标准溶液中各溶剂的保留时间

结论：该方法因为相邻组分间分离度均大于1.5，相邻峰均能完全分离，专属性良好。

实施例10 进样精密度检测

色谱条件同实施例9，取标准溶液1ml顶空加热炉加热后进样，记录色谱图至35min，以上各溶剂完全出峰，出峰顺序依次为氯甲烷、氯乙烷。标准溶液连续进样5次，计算每次进样各溶剂的峰面积，求得相对标准偏差（应不大于10.0％）。

表3 精密度试验

结论：试验表明本色谱系统精密度良好。数据见表3。

实施例11 线性关系考察

色谱条件同实施例9，精密量取氯甲烷、氯乙烷，用DMSO，制备成含氯甲烷浓度分别为0.1010、0.2020、0.3029、0.4039、0.5049、0.6059µg/ml；氯乙烷浓度分别为0.1290、0.2581、0.3871、0.5162、0.6452、0.7742µg/ml的对照品溶液。各精密量取1ml顶空加热炉加热后注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，结果见表4 、表5。以峰面积值（A）对浓度（C）进行线性回归，得一直线，见图7、图8。

表4 氯甲烷线性回归数据

表5 氯乙烷线性回归数据

氯甲烷的回归方程y=0.1015x+0.0031，r=0.9960

氯乙烷的回归方程y=0.1158x+0.0053，r=0.9977

结论：以上结果表明，氯甲烷在0.1010~0.6059µg/ml范围内，氯乙烷在0.1290~0.7742µg/ml范围内进样浓度与峰面积值有良好的线性关系。

实施例12 检测限与定量限

色谱条件同实施例9，将已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，以S/N≈3时相应的浓度为检测限浓度，得到氯甲烷的检测限浓度为0.0101μg/ml，氯乙烷的检测限浓度为0.0043μg/ml。

将已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，以S/N≈10时相应的浓度为定量限浓度，得到氯甲烷的定量限浓度为0.0549μg/ml，氯乙烷的定量限浓度为0.0129μg/ml。

结论：氯甲烷定量限浓度为0.0549μg/ml，氯乙烷定量限浓度为0.0129μg/ml。

实施例13 重复性试验：

按正文方法，对同一批盐酸右美托咪啶样品（批号20130105）5份进行测定，求得相对标准偏差，结果见表6。

表6 重现性试验

结论：试验结果表明该法重现性良好。

实施例14 重复性试验回收率试验：

色谱条件同实施例9，分别按氯甲烷、氯乙烷80%、100%、120%的量，加入盐酸右美托咪啶同一批样品（批号20130105）于量瓶中，按正文供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定。按下式计算回收率，结果见表7 、表8。

表7 氯甲烷回收率试验

表8 氯乙烷回收率试验

结论：试验表明该法的准确度良好。

实施例15 耐用性检测器温度变化

色谱条件同实施例9，将检测器温度变化为：检测器温度变化1：240℃、顶空检测器温度变化2：260℃、原始顶空检测器温度为：250℃，测试结果见图9，表9。

表9 检测器温度变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见检测器温度在240℃～260℃允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例16 耐用性起始柱温变化

色谱条件同实施例9，将起始柱温变化为：起始柱温变化1：35℃、起始柱温变化2：45℃、原始起始柱温：40℃，测试结果见图10、表10。

表10 起始柱温变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见色谱柱起始温度在35℃～45℃允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例17 耐用性保温温度变化

色谱条件同实施例9，将顶空加热器保温温度变化为：保温温度变化1：43℃、保温温度变化2：47℃、原始保温器温度为：45℃，测试结果见图11、表11。

表11 保温温度变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见保温温度在43℃～45℃允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例18 耐用性样量变化

色谱条件同实施例9，将进样量变化为：进样量变化1：200μl、进样量变化2：300μl、原始进样量为：100μl，测试结果见图12、表12。

表12 进样量变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见进样量在100μl～300μl允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例19 耐用性流速变化

色谱条件同实施例9，将流速变化为：流速变化1：0.7ml/min、流速变化2：0.9ml/min、原始流速为：0.8ml/min，测试结果见图13、表13。

表13 流速变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见流速在0.7ml/min～0.9ml/min允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例20 耐用性保温时间变化

色谱条件同实施例9，将保温时间变化为：保温时间变化1：10分钟、保温时间变化2：20分钟、原始保温时间：40分钟，测试结果见图14、表14。

表14 保温时间变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见保温时间时在10分钟～40分钟允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例21 耐用性分流比变化

色谱条件同实施例9，将分流比变化为：分流比变化1：1:15、分流比变化2：1:25、原始分流比为：1:20，测试结果见图15、表15。

表15 分流比变化测试结果对比表

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见分流比在250℃1:15～1:25允许范围内变化对残留溶剂分离没有影响。

实施例22 盐酸右美托咪啶中氯甲烷和氯乙烷含量测试

色谱条件同实施例9分别称取批号为20130101、20130108、20130114、20130323、20130330、20130406批号的盐酸右美托咪啶样品，进样测试结果见表16。

表16 进样测试结果

备注：试剂氯甲烷为梯希爱化成LOT：2RYZE-MO、氯乙烷为梯希爱化成LOT：MZYGG-CE、DMSO为ScharlauLOT：14398313）。