一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用，所述嗜麦芽寡养单胞菌于2016年03月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.12186；所述产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：1)准备液体无机盐培养基；2)取嗜麦芽寡养单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基中，所述嗜麦芽寡养单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的接种量为a，0.5％≤a≤5％，在转速为150～220rpm，温度为27～47℃的条件下发酵，使含角蛋白的物质降解；该嗜麦芽寡养单胞菌在以羽毛为唯一碳氮源的液体培养基中可以高效降解角蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌株及应用领域，具体涉及一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用。

背景技术

羽毛是重要的蛋白质资源，其蛋白含量高达85-90％。但由于其主要成分角蛋白是一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法：高温高压、酸碱处理等不仅消耗大量能源还引发严重的环境污染问题。目前我国养殖业中每年产生的羽毛废弃物达到百万余吨，随着我国养殖业的不断发展，这数量还在持续增长，实现废弃资源的高值转化和循环利用已是必然选择。研究角蛋白资源的转化及应用，对含有羽毛、毛发等角蛋白成分的养殖业废弃物的无害转化以及对和角蛋白有相似结构的物质的转化均具有重要理论价值和创新意义。其中，角蛋白酶(keratinase)是一种主要由真菌、放线菌、细菌等微生物产生，可特异降解角蛋白的蛋白酶。利用自然界中微生物分泌的角蛋白酶特异性地消化羽毛等角蛋白，将角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养，从而变废为宝，既能保护环境又利用资源，这也将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌，该嗜麦芽寡养单胞菌在以羽毛为唯一碳氮源的液体培养基中可以高效降解角蛋白。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：所述嗜麦芽寡养单胞菌，分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia，为于2016年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12186，所述嗜麦芽寡养单胞菌的菌体细胞为短杆状，成对或短链，有鞭毛，无芽孢，无荚膜，革兰氏染色为阴性；菌体在琼脂平板培养基呈黄色、边缘光滑的单菌落。

本发明的另一个目的在于提供产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌的应用，将该菌接种于改进的液体无机盐培养基中发酵并产生角蛋白酶，提高了菌株降解含角蛋白的物质的效率。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：利用所述产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质。

作为本发明的一种优选的方案：所述产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：

1)准备液体无机盐培养基；

2)取嗜麦芽寡养单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基中，所述嗜麦芽寡养单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的体积分数接种量为a，0.5％≤a≤5％，所述含角蛋白的物质在液体无机盐培养基中的浓度为b，10g/L≤b≤100g/L，在转速为150～220rpm，温度为27～47℃的条件下发酵12～120h，使含角蛋白的物质降解。

作为本发明的一种优选的方案：步骤1)中，所述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分：

其中，所述液体无机盐培养基的pH为4～11。

作为本发明的一种优选的方案：所述液体无机盐培养基的pH＝9。

作为本发明的一种优选的方案：所述嗜麦芽寡养单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的接种量为a，a＝1％。

作为本发明的一种优选的方案：所述含角蛋白的物质在液体无机盐培养基中的浓度为b，b＝10g/L。

作为本发明的一种优选的方案：步骤2)中，所述发酵的温度为37℃。

本发明的有益效果在于：

1、本发明利用嗜麦芽寡养单胞菌降解多种含角蛋白的废弃物，提供了更灵活更环保的生物降解角蛋白废弃物的方式；

2、本发明的嗜麦芽寡养单胞菌在液体无机盐培养基中发酵后，对角蛋白的降解率高，可直接应用于降解整根羽毛，无需对羽毛进行预处理；

3、本发明的嗜麦芽寡养单胞菌对于含角蛋白的物质的降解条件简单，可以以羽毛为唯一碳、氮源进行发酵，无需添加葡萄糖和酵母粉等有机营养物质，所产角蛋白酶活性高，稳定性好。

附图说明

图1为实施例1菌株的电镜图；

图2为实施例1菌株16SrDNA序列系统发育树；

图3为实施例2不同pH对羽毛的降解率的曲线图；

图4为实施例2不同温度对羽毛的降解率的曲线图；

图5为实施例3不同含角蛋白的物质的浓度对羽毛的降解率的曲线图；

图6为实施例4不同接种量对羽毛的降解率的曲线图；

图7为实施例5不同发酵时间对羽毛的降解率及发酵上清液中可溶性蛋白浓度的曲线图

图8为实施例6中对照(CK)的羽毛电镜图；

图9为经实施例6处理的羽毛电镜图；

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

所述产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：

1)准备液体无机盐培养基；

所述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分：

其中，所述液体无机盐培养基的pH为4～11。

2)取嗜麦芽寡养单胞菌菌种和含角蛋白的物质，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基中，所述嗜麦芽寡养单胞菌菌种在液体无机盐培养基中的接种量为a，0.5％≤a≤5％，所述含角蛋白的物质在液体无机盐培养基中的浓度为b，10g/L≤b≤100g/L，在转速为150～220rpm，温度为27～47℃的条件下发酵12～120h，使含角蛋白的物质降解；

3)在步骤2)进行24h后取液体无机盐培养基的发酵上清液，对发酵上清液进行角蛋白酶酶活测定，以每mL发酵上清液在规定条件下反应15min后OD值增加0.01为1个酶活单位，测定包括以下步骤：

Ⅰ)配制W/V为1/160的偶氮蛋白的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液pH＝7.4；

Ⅱ)取3.2mL偶氮蛋白的磷酸缓冲液，置于37℃水浴中预热2min；

Ⅲ)取发酵上清液0.8mL，加入步骤Ⅱ)中的偶氮蛋白的磷酸缓冲液中，然后37℃水浴中反应15min，获得混合液；

Ⅳ)在步骤Ⅲ)得到的混合液中加入0.8mL10％的三氯乙酸，终止酶反应，获得反应液；

Ⅴ)将步骤Ⅳ)中获得的反应液于转速为10000rpm的条件下离心6min，并在450nm下测定吸光值；

Ⅵ)制备空白对照：在通过步骤Ⅱ)获得的磷酸缓冲液中，先加入0.8mL10％的三氯乙酸，再加入发酵上清液0.8mL，得到空白对照。

实施例1

实施例1用于说明菌种的筛选及鉴定过程：

一、产角蛋白酶的菌种筛选方法：

1)土壤样品采自广东温氏食品集团股份有限公司某鸡场；

2)将采集的样品置于无菌蒸馏水中混匀，静置后取上清液，按10^-6、10^-7、10^-8进行梯度稀释后，分别涂布于含牛奶的琼脂平板培养基上；然后置于37℃恒温箱中倒置培养24h；

3)在琼脂平板培养基上挑选能产生透明降解圈的单个菌落，接种于含羽毛的液体无机盐培养基中，在温度37℃，180rpm的条件下震荡培养72h，获得菌株培养液；最后挑选羽毛降解明显的菌株培养液，接种至新的含羽毛的液体无机盐培养基上进行复筛培养；

4)将复筛得到的菌株接种于含有一根完整羽毛和50mL无机盐发酵培养液的锥形瓶中，在温度37℃，转速200rpm的条件下震荡培养48h，观察羽毛的降解情况，筛选出羽毛降解能力较强的菌株，保种备用；

其中牛奶琼脂平板培养基包括以下组分：氯化钠10g，琼脂粉20g，脱脂奶粉5g，双蒸水1L。

二、产角蛋白酶的菌株形态及生理生化鉴定：

1)将菌种分离纯化，然后划线接种琼脂平板培养基，温度为37℃的条件下培养24h；通过光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体的形态，电镜下的菌体形态如图1所示：菌体细胞为短杆状，成对或短链，有鞭毛，无芽孢，无荚膜；革兰氏染色为阴性；

2)将菌株进行生理生化测定，其生理生化特征见表1：

表1菌株的生理生化特征

反应底物测定结果甘油+麦芽糖-硝酸盐(还原)-肌醇-乳糖-葡萄糖+牛奶+柠檬酸盐-山梨醇-卫矛醇-淀粉+VP+尿素-阿拉伯糖-木糖-七叶苷+果糖-蔗糖-明胶-

注：+：阳性；-：阴性

目的菌株能够水解牛奶，具有角蛋白酶活性；能水解淀粉和七叶苷，具有淀粉酶活性和葡萄糖苷酶活性。

三、菌株16SrDNA鉴定：

设计引物PCR扩增菌株16SrDNA序列，并送上海生工生物工程股份有限公司测序；

PCR反应的扩增引物：

反应体系：

试剂体积(μl)Template(基因组DNA20-50ng/μl)0.510×Buffer(with Mg²⁺)2.5dNTP(各2.5mM)1酶0.2F(10uM)0.5R(10uM)0.5加双蒸H₂O至25

，

反应条件：

获得的菌株的16SrDNA序列如下所示：

TACCATGCAGTCGAACGGCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTG；

该序列记录在序列表SEQNo.1中。

四、构建系统发育树：

经GenBank核酸数据库与已知菌群的16SrDNA基因序列比对分析，调出与其序列同源性较高的相关菌株的16SrDNA序列，计算目的菌株的核苷酸序列及其同源序列的遗传距离，用邻接法(Neighbor-joining)推演系统发生关系，构建系统发育树如图2所示；

五、通过菌体的形态特征观察、菌株生理生化测定、16SrDNA扩增序列和构建系统发育树，鉴定菌株为嗜麦芽寡养单胞菌。

实施例2

实施例2用于说明不同pH及不同的发酵温度对嗜麦芽寡养单胞菌降解羽毛的影响：

1)按梯度配制pH为4～11的液体无机盐培养基各50mL；

2)在步骤1)中制得的每一个液体无机盐培养基中添加嗜麦芽寡养单胞菌菌种0.5mL和羽毛0.5g，在转速为220rpm，温度为37℃的条件下发酵24h后，通过失重法检测羽毛的降解率；

3)不同pH对羽毛的降解率如图3所示：结果显示，当液体无机盐培养基的pH＝9时，羽毛的降解率最高；

4)取嗜麦芽寡养单胞菌菌种，添加至pH＝9的液体无机盐培养基中，在转速为220rpm，分别在27℃、32℃、37℃、42℃和47℃的温度条件下发酵24h，然后通过失重法检测羽毛的降解率；

5)不同温度对羽毛的降解率如图4所示：结果显示，温度为37℃时，羽毛的降解率最高。

实施例3

实施例3用于说明含角蛋白的物质在液体无机盐培养基中的浓度对羽毛降解率的影响：

配制含羽毛浓度分别为10g/L(1％)、20g/L(2％)、50g/L(5％)和100g/L(10％)的液体无机盐培养基，在菌种的接种量为1％，pH＝9，温度为37℃的条件下发酵24h；羽毛的降解率如图5所示：当液体无机盐培养基中羽毛的含量为10g/L(1％)时，羽毛的降解率最高；当羽毛含量大于20g/L(2％)时，羽毛的降解率随着羽毛含量的增加而迅速下降。

实施例4

实施例4用于说明液体无机盐培养基的接种量对羽毛降解率的影响：

配制接种量分别为0.5％、1％、2％、5％的液体无机盐培养基，在羽毛浓度为10g/L，pH＝9，温度为37℃的条件下发酵24h；羽毛的降解率如图6所示：当接种量为1％时，羽毛的降解率最高；当接种量＜1％时，羽毛的降解率随接种量的增加而增加；当接种量>1％时，羽毛的降解率反而降低。

实施例5

实施例5用于说明发酵时间对羽毛降解率和发酵上清液中可溶性蛋白含量的影响：

配制接种量为1％、羽毛浓度为10g/L的液体无机盐培养基，在pH＝9，温度为37℃的条件下发酵，测定发酵时间为12h、24h、48h、72h、96h、120h时羽毛的降解率及发酵上清液中可溶性蛋白的浓度，结果如图7所示：在72h之前，羽毛的降解率随着时间的增加而呈线性增加；72h之后，羽毛的降解率增加缓慢；120h时，羽毛几乎完全降解，而发酵上清液中可溶性蛋白的浓度在24h内迅速升高，24h后开始降低，72h后又开始升高。

实施例6

实施例6用于说明利用产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质的过程：

所述产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌降解含角蛋白的物质，包括以下步骤：

1)准备液体无机盐培养基；

所述液体无机盐培养基按浓度计包括以下组分：

其中，所述液体无机盐培养基的pH＝9；

2)取嗜麦芽寡养单胞菌菌种0.5mL和羽毛0.5g，添加至步骤1)中制得的液体无机盐培养基50mL中，在转速为220rpm，温度为37℃的条件下发酵24h，使羽毛降解；

3)对照组(CK)为将羽毛0.5g置于液体无机盐培养基中，不添加菌种震荡24h；

4)通过电镜扫描观察羽梗，对照组(CK)的羽毛如图8所示：羽毛完好，无降解现象；经过实施例6处理的羽毛如图9所示：从微观结构发现，羽梗结构疏松，出现明显的崩解现象；

5)通过步骤2)发酵24h后取液体无机盐培养基的发酵上清液，对发酵上清液进行角蛋白酶酶活测定，得到角蛋白酶活力为35.45U/mL。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。