一种利用印度梨形孢和中生菌素联合防治烟草青枯病的方法

摘要

本发明公开了一种利用印度梨形孢和中生菌素联合防治烟草青枯病的方法，包括以下步骤：(1)将烟草种子播种于混有印度梨形孢(Piriformospora india)菌丝的育苗基质中，成苗后移栽至大田；(2)移栽前，用中生菌素药液浇灌烟草苗移栽用洞穴；移栽后10～15天，再用中生菌素药液对每株烟草植株进行灌根处理。本发明使用的印度梨形孢不受中生菌素的抑制，可与杀菌剂中生菌素联合使用，应用于烟草青枯病的防治；与单独使用印度梨形孢或中生菌素的防治效果相比，本发明印度梨形孢和中生菌素联合使用能够起到增效作用，显著提高对烟草青枯病的防控。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害防治领域，具体涉及一种利用印度梨形孢和中生菌素联合防治烟草青枯病的方法。

背景技术

烟草青枯病是烟草上一种重要土传细菌病害，目前防治的方法大多数集中在化学防治方面，然而大量的使用农药，不仅容易造成农药残留，污染水资源，污染环境，而且长时间的使用还容易使细菌产生抗药性，为病害的持续防治带来困难。

近年来，植物病害的生物防治越来越受到人们的重视，生物防治是利用有益微生物对病原菌产生各种不利作用(抗菌，溶菌、竞争、重寄生)从而减少病原物的数量来消弱其致病性；同时，用于生物防治的有益微生物还能诱导或增强植物抗病性，通过改变植物与病原菌的相互关系，延缓或者抑制病害的发生。生物防治可以减少农药对环境的污染，具有良好的生态效益和社会效益。

在烟草青枯病生物防治方面，枯草芽孢杆菌Y1336、荧光假单胞杆菌、多粘类假单胞杆菌都能够很好的抑制青枯病原菌，但是仅用这些有益细菌，不能达到生产上所要求的防治效果。这些细菌不能与防治青枯病菌的农药共同使用，因为对烟草青枯病菌有控制作用的农药，往往也对具有生防作用的有益细菌具有抑制作用。

公告号为CN103270915B的专利文献公开了一种防治烟草青枯病的方法，包括：(1)在烟苗移栽时，将立枯净和水按照重量比1∶800～1200的比例稀释配制成立枯净药液对烟苗进行灌根，每株烟苗灌根40～60ml药液；(2)在烟株发病初期，将百抗和水按照重量比1∶500～1000的比例配制成百抗药液淋施发病烟株的根茎部，每株烟株淋施75～150ml药液。其中立枯净的有效成分为：4％稻瘟净、32％福美双、14％甲霜灵；百抗的有效成分为：枯草芽孢杆菌B908。该发明采用移栽时用立枯净灌根(化学防治)、发病初期用百抗淋施根茎部(生物防治)联合处理的方式，有效控制烟草青枯病的发生和蔓延。但是该方法依然无法克服上述的生防菌与农药不能共同使用的缺陷。

印度梨形孢菌是一种重要的有益内生真菌，能够定殖在多种植物根的表皮和皮层细胞内和细胞间隙，提高植物对生物和非生物逆境的抗性。印度梨形孢帮助植物抗逆的机制涉及提高植物抗氧化能力，诱导抗逆基因表达，诱导植物产生系统抗病性。印度梨形孢不同于丛枝菌根真菌，它可在培养基上生长，这就为该菌在农业和园艺业的大面积应用提供可能。

中国发明专利申请(申请号为201410092267、201410092269、201410093085)公开了通过用过滤后的印度梨形孢菌丝悬浮液浇灌4叶期的烟苗，待印度梨形孢定殖后移栽烟苗，从而降低烟叶中铬、镉、铅含量的方法。上述专利申请为印度梨形孢应用到烟草培育中提供了技术依据。

发明内容

本发明提供了一种利用印度梨形孢和中生菌素联合防治烟草青枯病的方法，结合印度梨形孢生物防治和杀菌剂中生菌素的化学防治，克服了现有技术中生防菌与农药不能共同使用的缺陷。

一种利用印度梨形孢和中生菌素联合防治烟草青枯病的方法，包括以下步骤：

(1)将烟草种子播种于混有印度梨形孢(Piriformosporaindia)菌丝的育苗基质中，成苗后移栽至大田；

(2)移栽前，用中生菌素药液浇灌烟草苗移栽用洞穴；移栽后10～15天，再用中生菌素药液对每株烟草植株进行灌根处理。

本发明将印度梨形孢定殖在烟草根部，建立烟草青枯病-印度梨形孢-中生菌素的烟草防治体系，研究证明该体系能够有效提高烟草对青枯病的防控。

本发明所述印度梨形孢(P.indica)菌株，是公众可以从生物材料样品国际保藏单位购买到的生物材料，在美国Americantypeculturecollection保藏库，保藏编号是204458TM。

印度梨形孢和中生菌素的联合处理，具有增效作用，显著降低了烟草青枯病的田间株发病率与病情指数，防治效果达到76.49％，病情指数下降了42.3，其防治效果显著优于单独使用印度梨形孢或中生菌素。

本发明将烟草种子接种于混有印度梨形孢(Piriformosporaindia)菌丝的育苗基质中，进行育苗。育苗条件为：每天光照培养16小时，光照强度为80μMm^-2sec^-1，培养温度为25℃；暗培养8小时，培养温度为22℃。一般在种子发芽的2～3周之后，印度梨形孢即可定殖在烟草幼苗的根部。

本发明烟草育苗基质的配方和配制方法是公知技术，可以自行配制基质，也可以购买厂家生产的基质。作为优选，所述育苗基质包括营养土、蛭石和珍珠岩，三者按照4:2:1的体积比混合。

育苗基质中印度梨形孢菌丝量太少不利于诱导提高烟草的抗病性，菌丝量太多容易导致印度梨形孢与烟草争夺养分。作为优选，所述育苗基质中印度梨形孢菌丝所占重量百分比为0.5～1％。更为优选的，所述育苗基质中印度梨形孢菌丝所占重量百分比为1％。

作为优选，步骤(1)中，烟草种子经消毒后再进行播种。种子消毒后再播种有利于提高烟草的成活率。

作为优选，步骤(1)中，烟草苗长至8～9片真叶后移栽至大田。

本发明选择移栽前施药和移栽后10-15天再次施药，主要原因有两点：(1)移栽前用中生菌素药液，对土壤消毒，降低病原菌基数，目的在于病害预防；(2)中生菌素的药效期为10-15天，因此在烟草苗移栽10-15天后，再施药，进一步杀死根际周围病原菌，有益于巩固病害的预防，显著减轻青枯病的发生。

在施药过程中，中生菌素药液施用浓度过高易造成残留，产生药害，增加成本；施药浓度过低，降低杀菌效果。当中生菌素药液有效浓度在20～30ppm时，既能有效杀菌又不造成药害。

作为优选，所述中生菌素药液为3％中生菌素用水按照1:1000～1:1500比例进行稀释得到，每个洞穴或每株烟草植株的施药量为200～500mL。

更为优选，所述中生菌素药液为3％中生菌素用水按照1:1000比例进行稀释得到，每个洞穴或每株烟草植株的施药量为300mL。

本发明具备的有益效果：(1)本发明使用的印度梨形孢不受中生菌素的抑制，可与杀菌剂中生菌素联合使用，应用于烟草青枯病的防治；(2)与单独使用印度梨形孢或中生菌素的防治效果相比，本发明印度梨形孢和中生菌素联合使用能够起到增效作用，显著提高对烟草青枯病的防控。

附图说明

图1为中生菌素对茄科劳尔氏菌RS-TB3的抑菌圈试验初筛结果。

图2为不同浓度的中生菌素对茄科劳尔氏菌株RS-TB3抑菌效果(NA，48h)。

图3为盆栽烟苗接种茄科劳尔氏菌RS-TB3第8d天发病程度的差异，

其中，A代表中生菌素：根部未定殖印度梨形孢烟草苗浇灌50mL农药中生菌素；

B代表PI+中生菌素：根部定殖印度梨形孢烟草苗浇灌50mL农药中生菌素；

C代表CK：根部未定殖印度梨形孢烟草苗浇灌50mL无菌水；

D代表PI：根部定殖印度梨形孢烟草苗浇灌50mL无菌水，箭头所示烟草青枯病典型症状。

图4为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中PPO酶活性的变化。

图5为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中POD酶活性的变化。

图6为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中PAL酶活性的变化。

图7为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后12h后各处理烟叶叶片总RNA电泳图。

图8为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中P450-1相对表达量的变化。

图9为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中PR-1a相对表达量的变化。

图10为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中PR-1b相对表达量的变化。

图11为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时间烟草叶片中GST相对表达量的变化。

图12为接种茄科劳尔氏菌RS-TB3后不同时期烟草叶片中hrs203J相对表达量的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明中应用的材料：印度梨形孢(P.india)由印度爱德大学AjitVerma教授惠赠；茄科劳尔菌(RalstoniasolanacearumTB3，RS-TB3)由中国农业科学院植物保护研究所冯洁研究员惠赠；中烟100种子由郑州烟草研究院提供；

3％中生菌素购自湖南省海洋生物工程有限公司。

1平板测定对青枯病菌的抑菌作用

1.1菌悬液制备

将无菌水保存的强致病力菌株RS-TB3在TTC平板上划线，培养48h后，挑取单菌落划落于NA平板(NA培养基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，上，培养48h后，用无菌水制成菌悬液，并将菌浓度配成1.0×10⁸cfu/mL备用。

1.2不同浓度中生菌素药剂的配置

将中生菌素用无菌水稀释，配成以下浓度(表1)。

表1.中生菌素不同浓度

1.3抑菌实验

将已熔化的200mLNA培养基冷却至45℃左右，吸取2mL青枯菌液(浓度3×10⁸cfu/mL)加入培养基中，充分混匀后，倒入直径为9cm的培养皿中，每皿15mL，使其均匀平铺，冷却。

打取6mm中性滤纸片经高压灭菌后烘干放入配制好的杀菌剂药液中吸附10秒，取出滤纸片使其靠在烧杯壁上滴落多余的药液后，置于距离培养皿中心点2cm处呈三角形排列。以无菌水作为空白对照，每皿1个处理，置于28℃培养箱中培养72h，重复三次。

初筛时，将中生菌素药剂配制成5000mg/L，以无菌水为对照，重复3次。初筛后，将中生菌素配制成上述表1中的浓度，用上述同样的方法。采用十字交叉法测定各浓度对青枯病菌菌株RS-TB3的抑菌圈直径(mm)。

1.4平板测定中生菌素对RS-TB3抑菌效果

初筛结果如图1所示，中生菌素在浓度5000mg/L时对病原菌RS-TB3具有明显的抑制作用。

不同浓度下，中生菌素均对RS-TB3具有抑制作用(表2和图2)，浓度在60ug/mL时，抑菌圈直径达到25mm。

表2.不同浓度的中生菌素可湿性粉剂对茄科劳尔氏菌株RS-TB3的抑菌效果

注：不同字母表示差异达到5％显著水平，下同。

2印度梨形孢和中生菌素联合作用对烟草青枯病的防控

2.1材料与方法

2.1.1烟草苗和印度梨形孢的准备

取直径为5mm的新鲜活化印度梨形孢菌块5块，置于PDB(PDB培养基配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，蒸馏水1000mL)液体培养基中，于25℃，150rpm，黑暗条件下培养10天后，将混和物在5500rpm条件下离心，收集菌丝体，测其鲜重。按照1:100的比例与育苗基质(营养土:蛭石:珍珠岩＝4:2:1)混匀，备用。

烟草种子用无菌水浸泡48h后，用75％的酒精灭菌1min，2％的次氯酸钠灭菌l0min，无菌水冲洗多次后置于上述育苗基质中，于25℃、16h光照80μMm^-2sec^-1，与22℃、8h黑暗交替下育苗。

6周后，待烟苗长出8～9片真叶，分别进行盆栽与大田试验。

2.1.2盆栽测定对烟草青枯病的防控效果

将无菌水保存的菌株RS-TB3在TTC平板(TTC培养基配方：牛肉浸膏3.0g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.2。121℃灭菌15min后冷却至50℃后加入氯化三苯基四氮哩盐，使其终浓度达到50mg/L)上划线，培养48h后，挑取单菌落在NA平板上涂板，在NA平板上培养48h后，用无菌水制成浓度为1.0×10⁸cfu/mL的菌悬液，备用。

设置3个处理和一个对照：处理一用50mL中生菌素药液(3％中生菌素:水＝1:1200)浇灌根部无印度梨形孢定殖的烟草(中生菌素)；处理二用50mL无菌水浇灌根部有印度梨形孢定殖的烟草(PI)；处理三用50mL中生菌素药液(3％中生菌素:水＝1:1200)浇灌根部有印度梨形孢定殖烟草(PI+中生菌素)，对照是用50mL无菌水浇灌根部无印度梨形孢定殖的烟草(CK)，每个处理8盆烟苗，重复3次。

对照组和处理组分别浇灌无菌水和中生菌素48h后进行青枯病菌的接种。采用伤根灌菌液法接种，在距烟草茎基部1cm处的一侧用灭菌的解剖刀切长3cm深3cm的切口，浇灌浓度为1.0×10⁸cfu/mL的细菌悬浮液25mL，置于28℃/30℃、14h/10h光暗交替的温室中培养，定时观察并记录发病情况。并于青枯病菌悬浮液浇灌后的0、12、24、48、72、120h取烟草叶片，迅速放入液氮中冷冻，保存在-80℃超低温冰箱中备用。

2.1.3田间试验对烟草青枯病的防控效果

待2.1.1中的烟苗长至8～9片真叶时，将烟苗移栽至大田(地点：浙江省杭州市浙江大学紫金港校区试验田)。设置3个处理和一个对照：处理一用300mL中生菌素药液(3％中生菌素:水＝1:1200)浇灌根部无印度梨形孢定殖的烟草苗(中生菌素)；处理二用300mL清水浇灌根部有印度梨形孢定殖的烟草(PI)；处理三用300mL中生菌素药液(3％中生菌素:水＝1:1200)浇灌根部有印度梨形孢定殖烟草(PI+中生菌素)，对照是用300mL清水浇灌根部无印度梨形孢定殖的烟草(CK)，每个处理50株苗，重复3次。

具体操作是：在烟苗移栽前，分别用300mL清水和中生菌素药液(3％中生菌素:水＝1:1200)浇灌移栽洞穴，移栽后10～15天，再分别用300mL清水和上述中生菌素浇灌烟草根部一次，此后无需任何处理。

2.1.4病害调查方法

烟草青枯病病害分级方法参照国家烟草专卖局发布的烟草行业标准烟草病害分级及调查方法(YC/T)39-1996(表3)：

表3.烟草青枯病病害分级

病情指数和防治效果计算公式为：

2.2结果与分析

2.2.1盆栽试验测定印度梨形孢和中生菌素共同作用对烟苗青枯病的防治效果

盆栽试验结果表明，对照组CK接烟草青枯病菌后第2天出现第一株青枯病发病植株，中生菌素、PI+中生菌素、PI发病植株始于第4天，比对照推迟了2天；第8天，中生菌素、PI、PI+中生菌素病情指数分别比对照组CK降低了25.8、25.8和42.5，防控效果分别达到了49.14％、49.14％和80.95％，防治效果最好的是根部定殖印度梨形孢和浇灌农药中生菌素(PI+中生菌素)，发病指数仅为10.0(表4和图3)。

表4.接种茄科劳尔氏菌后不同处理烟草青枯病的病情指数

注：不同字母表示差异达到5％显著水平，表中数字是3个重复的平均值。

2.2.2田间小区试验测定印度梨形孢和中生菌素共同作用对烟苗青枯病的防治效果

大田试验结果表明，单独中生菌素处理、单独印度梨形孢定殖处理、印度梨形孢定殖+中生菌素联合处理，大田烟草青枯病病情指数比对照组CK分别降低了22.3％、24.6％和42.3％，防控效果分别达到了40.33％、44.48％和76.49％，印度梨形孢和农药中生菌素联合作用对烟草青枯病的防控效果显著优于单独中生菌素处理和单独印度梨形孢定殖处理。

3印度梨形孢与中生菌素联合作用于烟草青枯病的机理初探

3.1相关生理指标的测定

过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性的测定参照陈建勋等(2002)的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定参照王学奎等(2005)的方法。

3.2相关抗病基因表达量分析

按照RNAisoPlus试剂盒说明书(TaKaRa,大连宝生物)提取烟草叶片中的总RNA。提取的总RNA在NanoDrop-2000紫外分光光度计(Thermo,USA)测定RNA的浓度。用TaKaRa生物技术公司的反转录试剂盒除去RNA中的DNA，并合成cDNA第一条链，合成反应体系为10μL，各反应成分为：5×gDNAEraserBuffer2.0μL，gDNAEraser1.0μL，RNA800ng，加DEPC水补足至10μL，混匀，在42℃条件下保温2min后，立刻置于冰上，2min后加入5×PrimeBufferⅡ4.0μL，PrimeRTEnzymeMixⅠ1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，用DEPC水补足至20μL，混匀，反应程序为：37℃15min，85℃5s，4℃结束反应，然后在反应混合液加入80μL的去离子水，保存在-20℃备用。

根据已报道的烟草抗病相关基因序列，设计特异性引物，以α-tublin作为内参基因，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表5。

在冰上制备RT-PCR反应混合液：SYBRPremixEXTap(2×)10μL，PCRForwardPrimer(10umol/l)0.5μL，PCRReversePrimer(10umol/l)0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL，低速离心后，进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应在ICyceleriQ荧光定量PCR仪(Bio-rad，USA)上进行，反应采用两步法，反应条件设置为：95℃预变性30s；进入循环，95℃变性3s，55℃退火31s，共40个循环。

表5.抗病相关基因荧光定量PCR特异性引物序列(SEQIDNO.1-12)

3.3结果与分析

3.3.1青枯病菌接种下烟草叶片中相关酶活性的变化

接种茄科劳尔氏菌前，接种和未接种印度梨形孢烟草叶片中PAL、POD、PPO活性几乎相同，无显著性差异。

在接种12～120h内，根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草叶片中PAL、POD、PPO呈现出先上升后下降的趋势，但根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片中PAL、POD、PPO活性一直高于对照。

在接种茄科劳尔氏菌后，根部接有印度梨形孢的烟草(PI、PI+中生菌素)在第24h达到最大值，PPO活性分别是对照组(CK)1.69和1.66倍倍(图4)；POD的活性也在第24h达到最大值，活性分别是是对照组(CK)的1.70和1.59倍(图5)；PAL的活性在第48h达到最大值，分别是对照(CK)的1.91和1.72倍(图6)。CK和中生菌素处理之间PAL、POD、PPO无明显差异。

说明印度梨形孢接种到烟草根部，能够在烟草受到青枯病菌侵染时，诱导烟草细胞中与抗病性相关的酶类的活性的提高，从而使烟草能够抵抗青枯病的危害，而单独应用中生菌素却没有这样的效果。当印度梨形孢与中生菌素联合使用时，相较于其它三组PAL、POD和PPO酶活性最高。

3.3.2烟草叶片总RNA的分析

琼脂糖凝胶电泳检测发现，从烟草叶片中提取的总RNA纯度较好，检测结果可清晰的看到18S、28S两条带(图7)；紫外分光光度计检测RNA的OD260/280值在1.9～2.0左右，说明RNA无蛋白质污染。

3.3.3抗病基因表达量分析

实时荧光定量PCR结果显示，接种茄科劳尔氏菌前，根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草叶片中基因PR-1b、PR-1a、GST、P450-1、hrs203J的表达量无显著性差异；接茄科劳尔氏菌后0～120h之内，根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草叶片中基因PR-1b、PR-1a、GST、P450-1、hrs203J基因表达量上升，这些基因在接种印度梨形孢的烟草中基因表达量显著高于未接种的烟草。

根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片(PI、PI+中生菌素)叶片中基因P450-1、PR-1a、PR-1b、hrs203J的表达量在第12h达到最大值，其中P450-1表达量分别是CK的13.54和14.02倍(图8)；PR-1a表达量分别是对照烟草(CK)的2.88和3.39倍(图9)；PR-1b表达量分别是对照烟草(CK)的4.08和3.2倍(图10)，基因GST的表达量在第24h达到最大值，其表达量分别是对照烟草(CK)的7.4和8.9倍(图11)；hrs203J表达量分别是3.24和3.23倍(图12)；CK和中生菌素之间的基因P450-1、PR-1a、PR-1b、GST、hrs203J表达差异不大(图8，9，10，11，12)。

说明印度梨形孢接种到烟草根部后，当烟草受到青枯病菌侵染时，能够诱导提高烟草细胞中与抗病性相关的基因的表达，从而使烟草能够抗青枯病的为害，而单独应用中生菌素却没有这样的效果。相比其它三组，印度梨形孢与中生菌素联合使用12h时，PR-1b、PR-1a、P450-1、hrs203J基因表达量达到最高，GST基因表达量在24h时最高。