替拉那韦在抗癌症药物中的应用及抗癌症药物

摘要

本发明公开了替拉那韦（Tipranavir）在抗癌症药物中的应用及抗癌症药物，将替拉那韦用于在抗癌症药物及制备抗癌症药物中的应用；并提供一种包含替拉那韦的抗癌症药物，其中替拉那韦作为抗癌症的主要活性成分；本发明运用计算机虚拟筛选的方法，选出与SIRT1活性口袋匹配度最高的分子替拉那韦Tipranavir，并进一步通过细胞实验，研究得到替拉那韦具有抗癌症的功效，经过替拉那韦72小时处理后，对乳腺癌细胞的增殖抑制率达到82.10%，经过替拉那韦48小时处理后，对肝癌细胞的增殖抑制率达到88.83%，取得了优异的技术效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及替拉那韦(Tipranavir)的应用，具体涉及替拉那 韦在抗癌症药物中的应用及抗癌症药物。

背景技术

癌症，即恶性肿瘤，是严重危害人类生命的重大疾病。癌症的治疗受到社会的广泛 关注。与其他大多数国家一样，乳腺癌为中国女性最常见的癌症。每年中国乳腺癌新发数量 和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％。从90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度 是全球的两倍多，城市地区尤为显著。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症。化学治 疗是乳腺治疗的三大基本手段之一，尽管目前乳腺癌的化学治疗已取得诸多进展，然而，目 前这些抗癌药物毒副作用大，选择性差及耐药，使乳腺癌治疗不能达到预期疗效。因而探寻 新的毒副作用小，治疗剂量低的药物具有重要意义。

乙酰化和去乙酰化是机体调控多种病例生理过程中重要的途径和方法，组蛋白去 乙酰化酶(HDAC)通过催化组蛋白去乙酰化，调控染色质重塑、转录活化及抑制、细胞周期、 细胞分化及细胞凋亡等一系列生物效应。细胞在转化的状态下，组蛋白去乙酰化酶的活性 显著增强，导致细胞增殖与调控细胞周期的分子表达失衡，从而导致细胞恶变。组蛋白去乙 酰化酶抑制剂(HDACI)是近年来发展的一类新型抗肿瘤的分子靶向药物。研究证实，HDACI 具有广泛的抗肿瘤作用及良好的市场前景，如已被FDA批准上市的用于皮肤T细胞淋巴瘤治 疗的伏立诺他(Zolinza)、罗米地辛(Istodax)以及用于外周T细胞淋巴瘤治疗贝利司他 (Beleodaq)均属于此类药物。这些药物所需的治疗剂量低，耐受好，不良反应少，从而备受 关注。

SIRT1(Silentinformationregulator1沉默信息调节因子1)是一个依赖NAD+的 去乙酰化酶，是正常的胚胎发育、分化及维持自身平衡必不可少的酶。SIRT1在成熟组织中 广泛表达，在胚胎早期和生殖细胞中含量丰富。人类SIRT1基因位于染色体10q21.3,cDNA序 列含2.4kb的ORF，有9个外显子，基因组序列约为33kb，编码747个氨基酸，SIRT1蛋白质相对 分子量约120kDa。SIRT1有一个保守性较高的大的结构域，主要由Rossmann折叠，一个小的 结构域，包含一个锌带结构和一个螺旋构件，其保守性较低，在大小结构域之间形成一个裂 隙，底物就结合在此处并发生催化反应，其中SIRT1的等363位的组氨酸是去乙酰化活性的 必需氨基酸。SIRT1的大多数功能是通过对基因表达过程中起关键作用的调节蛋白针对性 的去乙酰化而实现的。SIRT1的作用靶点包括转录因子以及代谢调节中的辅酶因子。在研究 中发现，SIRT1作为一类组蛋白去乙酰化酶，它不仅使组蛋白去乙酰化而修饰组蛋白，而且 与多种非组蛋白质相互作用，参与细胞多种生理、病理过程，如基因沉默、细胞衰老、抗氧化 应激、能量代谢调节、DNA损伤修复、肿瘤发生等。以SIRT1为靶标，将导致与细胞分化、细胞 周期阻滞、肿瘤免疫、受损细胞凋亡等有关的蛋白的表达受到抑制。近年来，越来越多的研 究证明SIRT1参与了乳腺癌的发生与发展。乳腺癌中过度表达的c-Myc通过多种方式增强了 SIRT1的功能。首先，c-Myc激活Nampt酶(它是NAD+合成的限速酶)，促进NAD+的合成，继而激 活SIRT1；其次c-Myc阻滞了SIRT1的抑制因子DBC1的功能；反过来，SIRT1在c-Myc转录后调 节其表达；最后SIRT1通过加强自身效应减少c-Myc降解速度，最终结果是在乳腺癌细胞中 c-Myc和SIRT1不断积聚，形成一个正反馈回路，促进乳腺癌的发生、发展。SIRT1与c-Myc在 乳腺癌中呈现出高表达，二者可能相互作用共同促进了乳腺癌的发生、发展和转移，SIRT1 也可作为乳腺癌患者预后的独立指标，这对乳腺癌患者的治疗和预后判断具有重要指导意 义。

HIV蛋白酶抑制剂属于抗艾滋病药物中非常有效的药物，可显著延长患者的寿命。 有证据表明，随着高效抗逆转录病毒疗法(鸡尾酒疗法，HAART疗法)的使用，与艾滋病相关 的癌症的发病率显著降低。因而激发人们对HIV蛋白酶抑制剂对抗肿瘤活性的研究，研究表 明如HIV蛋白酶抑制剂利托那韦、沙奎那韦、萘非那韦等均能抑制肿瘤的生长。然而，替拉那 韦常年来仅作为治疗艾滋病的药物而被使用，未有相关研究证明其具有抗癌抗肿瘤活性， 特别是未有相关研究证明替拉那韦具有以SIRT1为靶标的抗乳腺癌和抗肝癌等抗癌功效， 使得目前并未出现以SIRT1为靶标的抗癌药物。因而，针对此靶标，进行药物筛选意义重大。

肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率居 恶性肿瘤第五位，死亡率居第三位，严重威胁人类健康和生命,肝切除和射频消融对肝癌早 期的小肿瘤是目前最好的选择，但患者术后或射频消融后容易复发，并且对放疗、化疗易产 生耐药性，预后很差。中晚期患者可采用肝动脉化疗栓塞、放化疗或分子靶向治疗的手段。 临床上使用的传统化疗药物缺乏组织选择性，在体内广泛分布，发挥疗效的同时往往产生 较严重的全身性毒副作用，严重影响化疗效果。分子靶向抗肿瘤药物在减少传统化疗药物 的全身性毒副作用和提高疗效方面具有一定的优越性，此类药物具有特定的组织分布特 征，可最大程度的减少药物在全身平均分布，减少用药剂量和给药次数，从而提高药物的治 疗指数，降低其全身性严重毒副作用。分子靶向药物治疗在控制HCC的肿瘤增殖、预防和延 缓复发转移以及提高患者的生活质量等方面具有独特的优势。近年来,应用分子靶向药物 治疗HCC已成为新的研究热点,新靶点的寻找及针对新靶点特征而筛选设计并合成特异性 治疗药物在肝癌治疗中具有重要意义。

近年来，越来越多的研究表明SIRT1参与了肿瘤的发生、发展。但其在肿瘤中的作 用还存在争议，研究发现它既可以促进肿瘤的发生，但在某些情况下又可抑制肿瘤的生长。 SIRT1在肿瘤发生发展中的两面性，可能与相应的时间段、特定的上下游调控因子及肿瘤抑 制因子与促进因子之间的平衡有关。

随着对SIRTl在肿瘤形成过程中扮演的重要角色的不断研究，以及对其抑制剂作 用机制的深入研究，以STRTl为靶点的小分子抑制剂是创新抗肿瘤药物开发的方向之一。研 究者们通过随机筛选的方法，或采用合理设计，发现和合成了上千种SIRT1小分子抑制剂。 依据其来源和结构的不同，可分为：拟肽类、β-萘酚类、吲哚类、2-苯甲酰胺类、Suramins、 Tenovins、天然产物类等。EX-527已经由ElixirPharmaceuticals公司申请，作为糖尿病药 物，FDA批准进入I期临床研究阶段，是目前进展最快，最有希望的SIRTl抑制剂类候选药物。

以SIRT1为靶点的小分子抑制剂作为一种抗肿瘤潜在治疗药物逐渐成为肿瘤学的 研究热点，但是，针对肝癌以SIRT1基因为靶点筛选并设计合成小分子抑制剂的研究目前还 较少。文献报道，Choi等发现SIRT1在肝癌组织中表达水平明显增高，SIRT1的基因沉默可以 诱导肝癌细胞周期阻滞；Wang等发现，SIRT1是通过P13K/PTEN/AKT途径促进肝癌的发生。 Chen等通过研究多例肝癌标本发现,SIRT1表达水平与肝癌化疗耐药呈正相关，另外通过统 计学分析，还得出结论，SIRT1在肝癌中表达情况与肝癌的预后呈正相关。Liang等报道，使 用siRNA降低SIRT1水平,能够将一种肝癌顺铂耐药细胞的药物敏感程度提高20倍，通过 cDNA转染能够在普通肝癌顺铂敏感细胞中增加顺铂耐药程度达2-3倍。Herranz等研究发 现，在代谢相关肝癌小鼠模型中，可通过上调SIRT1的表达，明显降低肝癌的发生率。这些研 究都表明,SIRT1表达的高低在肝癌的发生、侵袭、耐药等过程中起到了重要的作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何弥补现有技 术中药物对癌症的抑制效果不佳这一不足，提供替拉那韦Tipranavir的新用途，即对癌症 细胞的生长抑制及诱导凋亡作用，进一步提供替拉那韦在制备癌症药物中的应用及抗癌症 药物。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：具体而言，本发明涉及替拉那 韦Tipranavir，化学名称：N-[3-[(1R)-1-[(6R)-2-羟基-4-氧代-6-苯乙基-6-丙基-5H-吡 喃-3-基]丙基]苯基]-5-(三氟甲基)吡啶-2-磺酰胺；中文名：替拉那韦，CAS：174484-41-4； C₃₁H₃₃F₃N₂O₅S；结构式：

上述替拉那韦在抗癌症药物中的应用。本发明替拉那韦与SIRT1因子匹配度高，对 SIRT1靶标有很强的亲和力，SIRT1在癌症组织表达，用替拉那韦能够调节SIRT1的表达水 平，进而达到抗癌症的作用。进一步，所述癌症可以为乳腺癌或肝癌。本发明替拉那韦抗乳 腺癌和抗肝癌效果优异，经过替拉那韦72小时处理后，对乳腺癌细胞的增殖抑制率达到 82.10％，经过替拉那韦48小时处理后，对肝癌细胞的增殖抑制率达到88.83％。

上述替拉那韦在制备抗癌症药物中的应用。进一步，所述癌症可以为乳腺癌或肝 癌。用本发明替拉那韦制备抗癌症药物或者与其他辅料一起制备药物，具有良好的抗癌症 功效。

进一步，本发明提供了一种抗癌症药物，包含替拉那韦，其中替拉那韦作为抗癌症 的主要活性成分。所述抗癌症药物以替拉那韦作为抗癌症主要活性成分，能够调节SIRT1的 表达水平，进而达到抗癌症的作用。

上述癌症可以为乳腺癌或肝癌。所述抗癌症药物抗乳腺癌和肝癌效果尤其好，对 乳腺癌细胞的增殖抑制率达到82.10％，对肝癌细胞的增殖抑制率达到88.83％。

更进一步，上述抗癌症药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射液、注射用粉 剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂、缓释片剂或控释片剂。选择这样的剂型， 可以方便患者根据身体条件或者治疗疗程选择适合的剂型。

再进一步，上述抗癌症药物的剂型为片剂，包括如下重量份数的原料：替拉那韦23 ～37份、伊沙匹隆8～15份、预糊化淀粉13～27份、羟丙基纤维素12～18份、交联聚乙烯吡咯 烷酮6～14份、十二烷基硫酸钠2～5份和硬脂酸镁1～3份。这样，通过替拉那韦的主要抗癌 症活性作用，以及其他药物或辅料的协同配伍作用，使得抗癌症效果更佳稳定，性能更好。

作为优化，上述抗癌症药物原料的重量份数为替拉那韦29份、伊沙匹隆11份、预糊 化淀粉23份、羟丙基纤维素15份、交联聚乙烯吡咯烷酮13份、十二烷基硫酸钠4份和硬脂酸 镁2份。优选这样的药物成分搭配方式，使得抗癌症效果发挥更佳。

作为优化，所述片剂的直径为7～9mm。这样，既方便患者自行控制每次用药量，又 方便患者吞服。

本发明要求优先权中国专利CN201510151531.5《替拉那韦在抗乳腺癌药物中的应 用及抗乳腺癌药物》，申请人重庆理工大学、郭波，申请日2015年4月1日。本发明与优先权专 利是属于同一系列的研究课题，申请人首先通过研究发现替拉那韦对乳腺癌具有良好的抑 制效果，并申请优先权专利(CN201510151531.5)保护替拉那韦在抗乳腺癌药物中的应用， 但申请人在申请该专利时并没有通过研究证明替拉那韦能够对其他癌症也具有良好的抑 制效果，故抱着科学严谨的态度，优先权专利(CN201510151531.5)中并没有提出替拉那韦 在抗其他癌症药物中的应用；申请人在提交了优先权专利后，又进行了深入的研究，发现替 拉那韦也在其他癌症中有良好的抑制效果，并结合优先权专利提出的抗乳腺癌功效，最终 得出替拉那韦能够在抗癌症药物中应用的结论，提出本发明的技术方案的。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过研究发现，替拉那韦能够抑制HIV感染细胞中病毒Gag及Gag-Pok多 聚蛋白的病毒特异性过程，从而可以阻止成熟病毒体的形成；还发现替拉那韦的非肽类结 构在与耐药的HIV蛋白酶变异体结合时更具有灵活性，而且也有利于延缓HIV耐药性产生的 速度；进一步，本发明运用计算机虚拟筛选的方法，利用分子对接软件SYBYL2.0，对小分子 化合物库的化合物分子，进行分子对接打分，选出其中与SIRT1活性口袋匹配度最高的分子 替拉那韦Tipranavir，发现替拉那韦对SIRT1靶标有很强的亲和力，并且通过动力学模拟计 算替拉那韦与SIRT1受体蛋白结合自由能。

2、本发明通过细胞实验，证明了本发明所述的Tipranavir对癌症细胞具有抑制作 用，对乳腺癌细胞和肝癌细胞具有显著抑制作用，实验结果显示，经过替拉那韦72小时处理 后，对乳腺癌细胞的增殖抑制率达到82.10％，经过替拉那韦48小时处理后，对肝癌细胞的 增殖抑制率达到88.83％，显示出意想不到的增殖抑制效果。

3、本发明通过流式细胞实验，根据AnnexinV/PI双染检测的细胞凋亡，特别发现经 不同浓度的EX527与Tipranavir替拉那韦处理48h后的MB-MDA231乳腺癌细胞和HepG2肝癌 细胞，凋亡率均与药物浓度呈正相关关系；且经Tipranavir替拉那韦处理后的细胞凋亡率 均高于同浓度的EX527处理后的细胞凋亡率，证明了替拉那韦具有对癌症细胞，尤其是乳腺 癌和肝癌细胞的诱导凋亡作用。

4、本发明运用计算机虚拟筛选的方法，筛选出对SIRT1靶标有很强的亲和力小分 子化合物替拉那韦；并通过细胞实验和流式细胞实验，验证了Tipranavir替拉那韦可作为 SIRT1的抑制剂，具有对癌症细胞的生长抑制及诱导凋亡作用，可用于癌症的治疗，首次提 出了以SIRT1为靶标的抗癌药物，具有重大的意义。

附图说明

图1为替拉那韦活与活性位点一结合的氨基酸残基；

图2为替拉那韦与活性活性位点二结合的氨基酸残基；

图3为内源性抑制剂结合活性位点一；

图4为外源性抑制剂结合活性位点二；

图5为替拉那韦活性位点一和二；

图6为动力学模拟计算替拉那韦与SIRT1受体蛋白结合自由能；

图7为人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-231)、人红白血病细胞(K562)、人 肺腺癌细胞(A549)、人子宫颈癌细胞(Hela)、人宫颈癌上皮细胞(Caski)、人急性T细胞白血 病细胞(Jurkat)、人多发性骨髓瘤细胞(KM3)经替拉那韦处理48小时以后的抑制率

图8为人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-231)、人红白血病细胞(K562)、人 肺腺癌细胞(A549)、人子宫颈癌细胞(Hela)、人宫颈癌上皮细胞(Caski)、人急性T细胞白血 病细胞(Jurkat)、人多发性骨髓瘤细胞(KM3)经EX-527处理48小时以后的抑制率

图9为经EX527处理流式细胞图-空白对照组处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图10为经EX527处理流式细胞图-0.1umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图11为经EX527处理流式细胞图-1umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图12为经EX527处理流式细胞图-10umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图13为经EX527处理流式细胞图-25umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图14为经EX527处理流式细胞图-50umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图15为经Tipranavir处理流式细胞图-空白对照组处理48h后MB-MDA231细胞的凋 亡；

图16为经Tipranavir处理流式细胞图-0.1umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋 亡；

图17为经Tipranavir处理流式细胞图-1umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋亡；

图18为经Tipranavir处理流式细胞图-10umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋 亡；

图19为经Tipranavir处理流式细胞图-25umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋 亡；

图20为经Tipranavir处理流式细胞图-50umol/L处理48h后MB-MDA231细胞的凋 亡；

图21为经EX527处理流式细胞图-对照组处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图22为经EX527处理流式细胞图-0.25umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图23为经EX527处理流式细胞图-0.5umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图24为经EX527处理流式细胞图-1umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图25为经EX527处理流式细胞图-5umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图26为经EX527处理流式细胞图-10umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图27为经EX527处理流式细胞图-15umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图28为经EX527处理流式细胞图-20umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图29为经EX527处理流式细胞图-25umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图30为经EX527处理流式细胞图-50umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图31为经EX527处理流式细胞图-100umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图32为经EX527处理流式细胞图-200umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图33为经Tipranavir处理流式细胞图-对照组处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图34为经Tipranavir处理流式细胞图-0.25umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图35为经Tipranavir处理流式细胞图-0.5umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图36为经Tipranavir处理流式细胞图-1umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图37为经Tipranavir处理流式细胞图-5umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图38为经Tipranavir处理流式细胞图-10umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图39为经Tipranavir处理流式细胞图-15umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图40为经Tipranavir处理流式细胞图-20umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图41为经Tipranavir处理流式细胞图-25umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图42为经Tipranavir处理流式细胞图-50umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图43为经Tipranavir处理流式细胞图-100umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡；

图44为经Tipranavir处理流式细胞图-200umol/L处理48h后HepG2细胞的凋亡。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料如无 特殊说明，即为普通市售。

一、虚拟筛选

利用SYBYL2.0中的suflex-docking模块分析Tipranavir活性位点一(A1,内源性 抑制剂尼克酰胺的结合位点)(图1和图3)及活性位点二(A2,外源性抑制剂EX527的结合位 点)(图2和图4)的结合方式与氨基酸残基。

对活性位点一与二(图5)进行虚拟筛选后，得出对接打分最高的前100个分子(删 去24个相同分子不同构象)，结果如表1所示，932即为所筛选出的SIRT1抑制剂Tipranavir 替拉那韦。

表1虚拟筛选结果

通过动力学模拟计算替拉那韦与SIRT1受体蛋白结合自由能，结果见图6和表2，试 验结果表明：标准偏差为4.5865，总结合自由能较低，为-25.7343kCal/mol，说明替拉那韦 与SIRT1受体蛋白结合十分稳定。

表2结合自由能计算结果

(注：VAWAALS：范德华力贡献值；EEL：静电场贡献值；EGB：溶剂化自由能静电贡献； ESURF：非极性溶剂化能；DELTAGgas:气相自由能值；DELTAGsolv：溶剂相自由能值； DELTATOTAL：总结合自由能；Std.Dev：标准偏差)

二、药理试验

1.CCK8测增殖抑制

实验方法为CCK8增殖抑制。人乳腺癌细胞株即MB-MDA-231细胞、人肝癌细胞株 HepG2细胞、人正常肝细胞L02细胞来源于第三军医大学免疫学教研室；实验时取处于对数 生长期的状态良好的细胞用于实验。Tipranavir购买于上海佰世凯化学科技有限公司， CCK8试剂盒购买于日本同仁，EX527、Sirtnol购于上海Selleck公司，DMEM培养基、1640培养 基均购于Hyclone公司，血清为原装进口Gibco澳洲胎牛血清。

(1)MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)、HepG2细胞(人肝癌细胞株)处理：用不含 EDTA的胰酶分别消化处于对数生长期且生长状态良好的MB-MDA-231细胞和HepG2细胞(人 肝癌细胞株)，倒去胰酶，加入1毫升的DMEM培养基制成单细胞悬液进行细胞计数，将细胞密 度调至5×10⁴个/毫升，混匀。

(2)铺板：取对数生长期的细胞按细胞量6000个/孔、上述细胞悬液90uL/孔接种于 96孔板中，将铺板后的96孔板置于二氧化碳恒温培养箱中贴壁10h(37℃、饱和湿度、5％ CO₂)。10小时后分别对MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)、HepG2细胞(人肝癌细胞株)进行 试验。MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)进行实验组、阳性对照组和空白对照组试验；实验 组分为8个浓度批次，依次向96孔板的实验孔中加入用DMEM培养基配置的不同浓度的10μ L2000、1000、500、250、100、10、1、0.5umol/L浓度的Tipranavir替拉那韦；阳性对照组考察 三种阳性对照物，EX527、Nicotinamide(尼克酰胺)和Sirtinol(特异性sirt1和sirt2抑制 剂)，每种对照物分为8个浓度批次，依次向实验孔中加入10μL2000、1000、500、250、100、10、 1、0.5umol/L浓度的阳性对照物；使实验组和阳性对照组的实验孔中，替拉那韦、EX527、 Nicotinamide(尼克酰胺)及Sirtinol的终浓度为200、100、50、25、10、1、0.1、0.05umol/L， (DMSO终浓度小于4‰)；空白对照组为无血清DMEM培养基(Control组——空白对照组)；每 组设置5个平行实验组。HepG2细胞(人肝癌细胞株)分别进行实验组和空白对照组试验；实 验组分为10个浓度批次，

依次向96孔板的实验孔中加入用DMEM培养基配置的不同浓度的10μL1280、640、 320、160、80、40、20、10、5、2.5umol/L浓度的Tipranavir替拉那韦；使实验组的实验孔中，替 拉那韦的终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25umol/L，(DMSO终浓度小于4‰)；空白 对照组为无血清DMEM培养基(Control组——空白对照组)；每组设置5个平行实验组。添加 完成后，将MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)和HepG2细胞(人肝癌细胞株)试验的96孔细 胞培养板置于二氧化碳恒温培养箱中分别继续孵育24小时、48小时、72小时后观察细胞状 态并拍照。

(3)CCK8测增殖抑制

在避光条件下，CCK8与培养基按1:10(v/v)的比例配均匀混合；吸出分别培养了24 小时，48小时及72小时的96板中的培养基，避光加入110ul/孔CCK8与培养基的混合物于96 孔板中，待加完后记录时间。然后放入二氧化碳恒温培养箱中继续孵育(MB-MDA-231细胞 (人乳腺癌细胞株)孵育2-3h，HepG2细胞(人肝癌细胞株)孵育1-1.5h)，用全波长酶标仪在 波长450nm下测定每个孔的吸光值A，并按公式抑制率＝(A对照组-A实验组)/A对照组× 100％，计算各组的生长抑制率。

表3药物处理24小时后MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)的抑制率

表4药物处理48小时后MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)的抑制率

表5药物处理72小时后MB-MDA-231细胞(人乳腺癌细胞株)的抑制率

表6Tipranavir处理人肝癌细胞(HepG2)24、48小时后的抑制率

由上述表3、4及5中可以看出，与其他三种阳性对照药物相比，不同时间段的给药 处理后，替拉那韦对乳腺癌的增殖抑制效果最佳，且浓度越高，抑制效果越显著；药物处理 时间越久，替拉那韦对乳腺癌的增殖抑制率显著提高，经过72小时处理后，替拉那韦对乳腺 癌细胞的增殖抑制率达到了82.10％，取得了意想不到的高抑制率。

由上述表6中可以看出，经过两个不同时间段的给药处理后，替拉那韦对SIRT1高 表达的肝癌细胞的增殖抑制效果极佳，且随着浓度的增高，抑制效果越显著，但浓度在32μM 以上后抑制率增高不显著；药物处理时间越久，替拉那韦对肝癌的增殖抑制率显著提高，经 过48小时处理后，替拉那韦对肝癌细胞的增殖抑制率达到了84.87％，取得了意想不到的高 抑制率。

2、Jurkat细胞的增殖抑制实验：

采用“1、CCK8测增殖抑制实验方法”中同样的试验方法，进行Jurkat细胞的增殖抑 制实验，实验结果如下表7所示：

表7不同浓度的化合物对Jurkat细胞的48h抑制率(IR％)

表7表明，不同浓度的阳性对照药物及替拉那韦经过48小时的药物处理后对 Jurkat细胞并没有明显的增殖抑制效果，随浓度的增加，其抑制效果也没有随浓度的增加 而呈现一定的相关性。

3、人正常肝细胞L02细胞和人肝癌细胞HepG2细胞的增殖抑制实验

采用“1、CCK8测增殖抑制实验方法”中同样的试验方法，进行HepG2、L02细胞的增 殖抑制实验，但L02细胞的培养基为1640，阳性药物EX527与替拉那韦的终浓度为70、60、50、 40、30、20、10、1、0.5、0.25umol/L，实验结果如下表8所示：

表8药物处理人肝癌细胞(HepG2)、人肝细胞(L02)48小时后的抑制率

表8表明，经过48小时的药物处理后，不同浓度的替拉那韦比阳性药物对SIRT1高 表达的HepG2细胞具有更明显的增殖抑制效果，且随浓度的增加，阳性药物对SIRT1低表达 的L02细胞的增殖抑制作用比替拉那韦更显著，说明阳性药物对正常肝细胞的抑制作用更 大。

4、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-231)、人红白血病细胞(K562)、人肺腺 癌细胞(A549)、人子宫颈癌细胞(Hela)、人宫颈癌上皮细胞(Caski)、人急性T细胞白血病细 胞(Jurkat)、人多发性骨髓瘤细胞(KM3)的增殖抑制实验

采用“1、CCK8测增殖抑制实验方法”中同样的试验方法，进行HepG2、MDA-231、 A549、Hela和Caski细胞的增殖抑制实验，而K562、Jurkat和KM3细胞为悬浮细胞，在细胞培 养方法上略有不同，但增殖抑制实验上方法相同。实验组与阳性组分为11个浓度批次，阳性 药物EX527与替拉那韦的终浓度为200、100、50、25、20、15、10、5、0.5、0.25umol/L，实验结果 (图7、图8)表明，经过48小时的药物处理后，不同浓度的阳性对照药物及替拉那韦对HepG2、 MDA-231细胞均有增殖抑制效果，替拉那韦对A549、Hela、Caski细胞、K562、Jurkat和KM3细 胞也具有增殖抑制效果，且在小于50μM的情况下，替拉那韦对HepG2细胞的增殖抑制作用比 阳性药物EX-527更显著，并且相较于MDA-231，替拉那韦对SIRT1高表达的HepG2的增殖抑制 作用更佳。

5、流式细胞：特别用AV-PI双染法检测HepG2、MDA-231的细胞凋亡情况

(1)用去离子水将10×BindingBuffer稀释成1×BindingBuffer；

(2)细胞收集：用不含EDTA的胰酶消化收集乳腺癌细胞后，于室温2000rpm离心5～ 10分钟，收集细胞；

(3)细胞洗涤：用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细 胞；

(4)加入300μL配制的1×BindingBuffer悬浮细胞；

(5)AnnexinV-FITC标记：加入5μL的AnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15分 钟；

(6)PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色；

(7)上机前，补加200μL的1×BindingBuffer。

(8)流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞 周期拟和软件ModFit分析。

分别采用阳性对照物质EX527和本发明实验用替拉那韦进行流式细胞实验，实验 结果如图9～44所示；根据AnnexinV/PI双染检测的细胞凋亡，发现经不同浓度的EX527与 Tipranavir替拉那韦处理48h后的MB-MDA231乳腺癌细胞和HepG2肝癌细胞，凋亡率均与药 物浓度呈正相关关系；且经Tipranavir替拉那韦处理后的细胞凋亡率均高于同浓度的 EX527处理后的细胞凋亡率，进一步证明了替拉那韦具有对癌症细胞的诱导凋亡作用。

三、一种抗乳腺癌的药物，包含替拉那韦，其中替拉那韦作为抗乳腺癌的主要活性 成分；该药物的剂型可以注射液、注射用粉剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳 剂、缓释片剂或控释片剂。

具体地，上述抗乳腺癌的药物，剂型为片剂，片剂的直径为7～9mm，包括如下重量 的原料，其中所述伊沙匹隆化学式为C₂₇H₄₂N₂O₅S：

表9原料成分表

经过验证，实施例1-3配方制成的片剂，不同程度的癌症患者服用5-8周后，检查癌 症细胞均有明显的凋亡，证明其对癌症具有明显的疗效。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术 方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发 明的权利要求范围当中。