一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因及其应用

摘要

本发明提供一组用于HNSCC分子分型的基因，包括TP53基因、CDKN2A基因、FAT1基因、CASP8基因、AJUBA基因、PIK3CA基因、NOTCH1基因、KMT2D基因、NSD1基因、HLA-A基因、HRAS基因、FBXW7基因、RB1基因、PIK3R1基因、TRAF3基因、NFE2L2基因、CUL3基因和PTEN基因。本发明还提供上述基因在制备用于HNSCC分子分型的试剂盒和基因芯片中的应用以及利用上述基因制备的用于HNSCC分子分型的试剂盒和基因芯片。本发明可以加强HNSCC分型的合理性和准确性，从而为实现HNSCC早期诊断、有效阻断、个体化治疗提供关键技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因及其在制备用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的试剂盒中的应用。

背景技术

头颈部鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma，HNSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，主要包括唇癌、牙龈癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症等，广义的口腔癌包括眼眶以下、颈部以上范围内所发生的癌症，绝大部分属于鳞状细胞癌，统称为头颈部鳞状细胞癌，中国等发展中国家是HNSCC的高发地区。全球HNSCC致死率在癌症致死率中排名第六，诊断后5年生存率不及50％，属预后较差、毁容性疾病(Petersen，P.E.(2009).Oralcancerpreventionandcontrol--theapproachoftheWorldHealthOrganization.OralOncol45，454-460)。尽管过去三十年间，手术、放疗及化疗等肿瘤治疗手段得到长足的发展，但HNSCC患者生存率的提高却十分有限，这种持续高的死亡率主要归咎于HNSCC的转移和复发(Leemans，C.R.，Braakhuis，B.J.，andBrakenhoff，R.H.(2011).Themolecularbiologyofheadandneckcancer.NatRevCancer11，9-22)。HNSCC是体细胞基因突变、烟草、酒精、HPV感染等内外部多种因素共同作用的结果，且具有高度异质性，造成临床上治疗效果和预后差异很大。

目前，临床上对HNSCC的分型仍采用由Broders描述、并被WHO采用的组织学分级方法。该方法根据肿瘤细胞角化程度、细胞及核的多形性、核分裂的主观评价肿瘤组织学分为3级：1级(高分化)、2级(中分化)、3级(低分化)，当肿瘤表现出不同分级时，最高分级决定最终分类(BarnsL，etal.(2005).PathologyandgeneticsofheadandnecktumorsLyon：IARCPress，168-175)。但是目前多数权威机构和学者认为，在个体患者中，Broders/WHO组织学分级系统与预后、治疗反应的相关性较差(WoolgarJA.(2006).Histopathologicalprognosticatorsinoralandoropharyngealsquamouscellcarcinoma.OralOncol42：229-239)，这主要是由于该组织分型方法存在如下明显缺陷：对肿瘤的区分不够细致，存在组织学异型而取材标本较为局限；分级依赖于肿瘤细胞的结构特征而不是功能；评价肿瘤细胞时未将其与其支持的间质和宿主组织相联系等。因此，建立新的、更为准确的HNSCC分型是头颈部肿瘤临床治疗中急迫建立的方法，也是开展个体化治疗的基础和前提。

近年来，高通量基因测序技术的飞速发展为HNSCC分子分型及精准治疗提供了可能。2013年，国际癌症基因组联盟(InternationalCancerGenomeConsortium)利用外显子测序技术对口腔癌中的牙龈-颊鳞状细胞癌进行测序，发现牙龈-颊鳞状细胞癌除了具有头颈部恶性肿瘤常见突变基因TP53和HRAS等外，还具有其它特异的变异基因，进一步证实了不同头颈部恶性肿瘤之间基因变异的差异性，为HNSCC进行基因分型并指导其临床治疗提供广阔前景。同时，基于分子分型的靶向药物治疗也为HNSCC的个体化治疗提供可能。

西妥昔单抗(Cetuximab)是首个获得FDA批准的针对头颈部鳞状细胞癌的分子靶点药物，主要作用于EGFR的细胞外区域。一项令人瞩目的多中心临床试验(N＝424)结果表明，与单纯放疗相比，西妥昔单抗联合放疗能有效地降低头颈肿瘤局部复发率，延长患者生存期，明显提高患者五年生存率(Bonner，J.A.，Harari，P.M.，Giralt，J.，Azarnia，N.，Shin，D.M.，Cohen，R.B.，Jones，C.U.，Sur，R.，Raben，D.，Jassem，J.，etal.(2006).Radiotherapypluscetuximabforsquamous-cellcarcinomaoftheheadandneck.TheNewEnglandjournalofmedicine354，567-578)。另一个多中心III期临床试验(N＝117)中，与顺铂单药化疗相比，西妥昔单抗联合顺铂治疗能显著提高化疗敏感性(Burtness，B.，Goldwasser，M.A.，Flood，W.，Mattar，B.，Forastiere，A.A.，andEasternCooperativeOncology，G(2005).PhaseIIIrandomizedtrialofcisplatinplusplacebocomparedwithcisplatinpluscetuximabinmetastatic/recurrentheadandneckcancer：anEasternCooperativeOncologyGroupstudy.Journalofclinicaloncology：officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology23，8646-8654)。国内学者近期发现：重组腺病毒p53基因治疗结合常规化疗可显著提高口腔鳞状细胞癌三期患者的生存率，但对口腔癌四期患者生存率无明显促进效果，提示建立针对HNSCC分子分型及其个体化治疗势在必行。

因此，从基因层面建立基于分子标志物指导性的分子分型以及有效的个性化临床治疗方案，对HNSCC患者进行临床的个体化治疗及其头颈部精准医疗具有重要意义。

发明内容

本发明针对目前HNSCC分型方法较为局限，特别是针对中国人群的HNSCC分子分型基因群的研究非常有限，现有的评估方法准确性不高，无法指导临床上对HNSCC的个性化治疗等问题，提供了一组用于HNSCC分子分型的基因及其检测试剂盒。

本发明一方面提供了一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因，具体包括如下18个基因：TP53基因、CDKN2A基因、FAT1基因、CASP8基因、AJUBA基因、PIK3CA基因、NOTCH1基因、KMT2D基因、NSD1基因、HLA-A基因、HRAS基因、FBXW7基因、RB1基因、PIK3R1基因、TRAF3基因、NFE2L2基因、CUL3基因和PTEN基因。

本发明的另一个方面还提供了上述一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因在制备用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的试剂盒中的应用。为此，本发明提供了一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的PCR引物以及一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的探针。所述PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1至SEQIDNo.36所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.37至SEQIDNo.54所示。本发明还提供了上述用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的PCR引物以及探针在制备用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的试剂盒和基因芯片中的应用。

本发明的另一个方面还提供了一种用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的试剂盒，其包括能够扩增权利要求1所述的一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因的PCR引物和/或能够与权利要求1所述的一组用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因序列互补的探针。上述PCR引物的核苷酸序列可以如SEQIDNo.1至SEQIDNo.36所示。上述探针的核苷酸序列可以如SEQIDNo.37至SEQIDNo.54所示。

此外，本发明还提供了一种用于头颈部鳞状细胞癌分子分型的基因芯片，其包括固相载体和探针，所述探针的核苷酸序列可以如SEQIDNo.37至SEQIDNo.54所示。

本发明首次将基于基因的分子分型引入HNSCC的分子分型中，进一步加强了HNSCC分型的合理性和准确性，提升指导HNSCC的临床治疗的能力。同时，在中国HNSCC人群中进行方法的验证和优化，创立适合中国HNSCC患者人群的分子分型方案，从而为实现HNSCC早期诊断、有效阻断、个体化治疗提供了关键技术支撑，在HNSCC的精准治疗中具有重要的临床意义。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明通过基因检测、分子标志物组合及数据挖掘算法的联合应用来建立基因分子标志物组合模型，利用多基因评估HNSCC分子分型，主要包括以下步骤：

(1)收集HNSCC的临床诊断数据和基因表达谱数据，构建包含人类已知2万多个基因、789例样品的HNSCC基因表达谱数据库；

(2)对基因表达模式进行统计分析，筛选出18个与HNSCC分型密切相关的基因，分别为：TP53基因、CDKN2A基因、FAT1基因、CASP8基因、AJUBA基因、PIK3CA基因、NOTCH1基因、KMT2D基因、NSD1基因、HLA-A基因、HRAS基因、FBXW7基因、RB1基因、PIK3R1基因、TRAF3基因、NFE2L2基因、CUL3基因和PTEN基因。

(3)通过PCR、基因表达芯片和高通量测序等方法检测HNSCC临床样本中上述18个基因表达模式，对HNSCC临床样本进行分型评估。

本发明提供的用于评估HNSCC分子分型的检测方法主要包括以下步骤：

(1)提取临床样本中的RNA。所述临床样本是取自所述对象的肿瘤组织，可以是新鲜样本或者福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本，或是所述对象的外周血或唾液；

(2)通过基因表达检测方法检测所述对象的临床样本中上述18个基因的表达模式和表达水平，并通过统计学方法评估HNSCC的分子分型。所述基因表达检测方法包括数字PCR、定量RT-PCR、基因芯片和高通量测序技术等，优选数字PCR和基因芯片。

本发明的用于HNSCC分子分型的试剂盒包含引物和/或探针，所述引物较佳地为基因专一性高的合成寡聚核苷酸片段，只要能与本发明所述评估HNSCC分子分型基因群中的基因部分序列互补，并扩增出本发明所述评估HNSCC分子分型基因群的基因即可。较佳地，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1～SEQIDNO.36所示。所述的探针较佳地为基因专一性高的合成寡聚核苷酸片段，只要能与本发明所述评估HNSCC分子分型基因群中的基因部分序列互补即可。较佳地，所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.37～SEQIDNO.54所示。

实施例1评估HNSCC分子分型基因群的筛选

通过EPIG基因表达谱分析程序分析已公开发表或储存于TCGA和COSMIC等数据库的789例HNSCC肿瘤基因全基因测序、外显子测序、RNA测序和基因表达芯片和临床变量相关数据，筛选评估HNSCC分子分型基因群。分析包括非监督性聚类分析识别表达谱及相关基因；候选基因的稳定性分析。首先通过聚类分析计算每个基因在789例样本中的彼此相关系数并以此聚类形成基因特异表达谱(r＞0.7，P＜0.001)，然后计算每个基因与特异表达谱的相关性，以此选择候选基因(r＞0.7，P＜0.001)。实验结果：筛选获得评分最高的18个评估HNSCC分子分型的基因，基因列表见下表1。

表1：18个可用于评估HNSCC分子分型的基因

序号基因名基因身份号码ID1TP53NM_001126118.12CDKN2AXM_011517679.13FAT1NM_005245.34CASP8XM_006712793.25AJUBANM_198086.26PIK3CANM_006218.27NOTCH1NM_017617.48KMT2DNM_003482.39NSD1NM_022455.410HLA-ANM_002116.711HRASNM_001130442.212FBXW7NM_033632.313RB1NM_000321.214PIK3R1NM_001242466.115TRAF3NM_145726.216NFE2L2NM_001145412.217CUL3NM_001257198.118PTENNM_000314.6

实施例2通过数字PCR方法和基因表达芯片评估HNSCC的分子分型

本实施例中，采用数字PCR和基因表达芯片方法，检测100组中国HNSCC病人石蜡包埋的肿瘤组织及其配对的癌旁组织中实施例1所筛选得到的18个基因的表达水平。数字PCR方法检测所用的引物和探针是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因序列，使用PrimerPremier5.0设计，由基因合成公司(上海生工)合成。引物的核苷酸序列如下表2(序列表中SEQIDNo.1～SEQIDNo.36)所示，探针的核苷酸序列如下表3(序列表中SEQIDNo.37～SEQIDNo.54所示。

表2：18个可用于评估HNSCC分子分型的基因PCR引物序列

表3：18个可用于评估HNSCC分子分型的基因探针序列

数字式PCR(digitalPCR，dPCR)是新近发展起来的第三代PCR技术，相对于实时定量PCR技术(quantitativereal-timePCR，qPCR)，数字PCR技术可以大幅度提高检测方法的灵敏度、精确度、准确度和重复性，并实现了真正意义上的绝对定量。目前数字PCR技术主要包括二类，大规模集成微流控芯片数字PCR(cdPCR)和微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)，这两种方法都是在PCR扩增前将待测DNA样本随机分配至芯片的微反应器或微滴中，微反应器或微滴中或不含待测的核酸靶分子，或者至少含有一个待测的核酸靶分子，且每个微反应器或微滴都是一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，检测器对每个微反应器或微滴进行检测，有荧光信号则判定为“1”，无荧光信号则判定为“0”，最终根据泊松分布原理和阳性微滴的比例，计算出待测样本中靶序列的拷贝数或浓度。

本实施例中，将经病理诊断确认为HNSCC的石蜡包埋样品采用TrizolRNA提取试剂盒提取总RNA；用DNase处理以确保完全去除基因组DNA的污染；经逆转录后获得cDNA。采用数字PCR进行18个基因表达的检测。数字PCR采用Bio-Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统上完成，PCR反应结束后，根据上述100组样品中18个基因的表达模式和表达水平，经统计分析并结合相应的临床数据进行分子分型，共分为4型(I～IV)，具体结果见下表4。

表4：数字PCR法HNSCC分子分型结果

实施例3通过基因表达芯片评估HNSCC的分子分型

本实施例中，采用基因表达芯片方法，检测同实施例2相同的100组中国HNSCC病人石蜡包埋的肿瘤组织及其配对的癌旁组织中实施例1所筛选得到的18个基因的表达水平。所用基因表达芯片所用的探针是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因序列，使用PrimerPremier5.0设计，由基因合成公司(上海生工)合成。探针的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.37～SEQIDNo.54中所示。

基因表达芯片是通过微电子技术和微加工技术，将大量特定序列的DNA片段或寡核昔酸片段，按矩阵高密度固定于玻璃、硅片等载体上，待测样品用荧光分子标记后，与芯片上大DNA或寡核苷酸片段杂交，通过荧光扫描及计算机分析后获得基因信息的一种检测方法。其突出特点在于能够对微量样品中的核酸序列信息进行快速、准确、高通量的检测和分析，可以同时获得成千上万个基因的表达丰度和表达模式关联图谱。

本实施例中，将经病理诊断确认为HNSCC的石蜡包埋样品采用TrizolRNA提取试剂盒提取总RNA；用DNase处理以确保完全去除基因组DNA的污染；经逆转录后获得cDNA。将cDNA与基因芯片混合、杂交反应；通过扫描荧光信号检测基因的表达丰度。基因芯片反应结束后，根据上述100组样品中18个基因的表达模式和表达水平，经统计分析并结合相应的临床数据按照实施例2进行分子分型，具体结果见表5。

表5：基因表达芯片HNSCC分子分型结果

比较实施例2和实施例3，采用数字PCR和基因表达芯片对同一组100组中国HNSCC进行18个分型相关基因表达检测，结果两种检测方法对HNSCC分子分型的结果基本一致。表明本发明通过HNSCC全基因组测序、外显子测序和RNA测序结合临床数据获得的18个HNSCC分型相关基因可以用于评估HNSCC分子分型。

实施例4通过高通量测序评估HNSCC的分子分型

为了进一步验证实施例2和实施例3中对同一组100组中国人HNSCC样本的分子分型方法，本发明进一步采用高通量测序技术对实施例2和实施例3中已分型(I～IV)的样本进行随机抽样(每个亚型为10组样本，即10个HNSCC癌组织和10个相应配对的癌旁组织)进行转录组测序验证。基于高通量测序技术的转录组测序能够分析样本中转录本的结构和表达水平，提供最全面的转录组信息。具体步骤如下：

步骤1：提取100组中国人HNSCC样本组织中总RNA(使用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒来提取组织中的RNA)。

步骤2：将所得RNA制成可供测序的文库。将所得组织的RNA制成可供二代测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：

将提取组织的RNA在专一引物的指导下用反转录酶生成已筛选的18种分子分型基因的cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μlDNA、45μl纯水、10μl具有10mMATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μl包含10mMdNTPMix、5μlT4DNA聚合酶、lμlKlenow酶、5μlT4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后采用QIAGENQIAquickPCR纯化试剂盒纯化DNA。末端悬A：将上步的产物溶解在32μl缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μl，1mMdATP10μl、KlenowEχo-3μl，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGENMinElutePCR纯化试剂盒连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μl、PEAdapterOligoMix10μl，DNA连接酶5μl，在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒)，温浴后采用QIAGENQIAquickPCR纯化试剂盒纯化DNA即得文库。

步骤3：利用引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1～SEQIDNo.36中所示的引物序列对所得DNA文库进行用MiSeq进行二代测序。用IlluminaMiSeq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成(Illumina公司)。

步骤4：结果分析。将所得测序结果进行分析，测序结果表明：同配对的癌旁组织相比，每个HNSCC亚型中分子分型基因的表达都存在显著差异。

实施例5HNSCC分子分型PCR试剂盒

PCR技术利用特异性引物和探针实现目的基因的体外扩增和定量。本发明提供的试剂盒可以采用实时定量PCR技术和数字PCR技术用于评估HNSCC分子分型，优选数字PCR技术。本发明提供HNSCC分子分型PCR试剂盒，包括特异性引物和/或探针，引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1～SEQIDNo.36所示，探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.37～SEQIDNo.54所示。

利用已知核苷酸序列的探针和引物制备检测试剂盒的技术已为本领域的技术人员所公知，因此对于本发明提供的用于HNSCC分子分型的试剂盒的具体步骤在此不作赘述。

实施例6HNSCC分子分型基因芯片

基因芯片是利用一种较高通量的基因表达分析工具，本发明提供的HNSCC分子分型基因芯片是一种基因表达谱芯片，主要是采用寡核苷酸片段作探针，固化在芯片上。将待测样品(处理组)与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测HNSCC分子分型相关基因的表达差异，从而评估HNSCC的分子分型。本发明提供HNSCC分子分型基因芯片，包括特异性探针，探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.37～SEQIDNo.54所示。

利用已知核苷酸序列的探针制备基因芯片的技术已为本领域的技术人员所公知，因此对于本发明提供的用于HNSCC分子分型的基因芯片的具体步骤在此不作赘述。

以上所述，仅为本发明的示例性具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。