配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法，包括干粉A、B、C及溶液D，干粉A(20ug):10％-30％CD3单抗、10％-20％干扰素-伽马(IFN-γ)、60％-80％白细胞介素-2(IL-2)；干粉B(40ug)：5％-10％CD3单抗、20％-30％CD28单抗、60％-75％白细胞介素-2；干粉C(120ug)：100％白细胞介素-2；溶液D(6ml):20％人血白蛋白、0.72％氯化钠、79.28％注射用水。本发明利用这个CIK细胞诱导试剂盒能够配合淋巴细胞培养基在最短的时间内诱导扩增出5*10

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导CIK细胞的试剂盒及其使用方法，尤其是一种配合 淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法。

背景技术

当前免疫细胞因其高效的肿瘤细胞杀伤活性，其无任何副作用的优势已 经逐渐被医学界认可。CIK(Cytokineinducedkiller)细胞作为免疫细胞 中最具代表性的一种细胞，其诱导和扩增的方法各不相同，且诱导出的细胞 数量和质量也参差不齐。没有一套简单、高效、稳定的诱导试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一套简单、高效、稳定的配合淋巴 细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种配合淋巴细胞 培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒，包括20ug干粉A、40ug干粉B、 120ug干粉C及6ml溶液D，按质量百分比，各种组分的成分如下：

干粉A:10％-30％CD3单抗、10％-20％干扰素-伽马、60％-80％白细胞介 素-2；

干粉B：5％-10％CD3单抗、20％-30％CD28单抗、60％-75％白细胞介素-2；

干粉C：100％白细胞介素-2；

溶液D:20％人血白蛋白、0.72％氯化钠、79.28％注射用水。

优选，按质量百分比，干粉A：20％CD3单抗、20％干扰素-伽马、60％ 白细胞介素-2；干粉B：20％CD3单抗、20％CD28单抗、60％白细胞介素-2。

上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量CIK细胞的试剂盒的使用 方法，包括以下步骤：

(1)使用10毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉A，并利用 0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个T-175培养瓶中分别加入4.5毫升 过滤后的溶液，在CO₂培养箱中孵育2小时；

(2)分离获得1*10⁸的外周血单个核细胞，重悬于200毫升淋巴细胞培 养基中，将重悬的细胞平均接种至2个细胞培养瓶中；

(4)将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；

(4)培养的第三天，使用试剂盒中的溶液D充分溶解干粉C，并利用 0.22微米孔径的滤膜过滤溶液；在两个培养瓶中分别加入100微升的干粉C 溶解液，并将剩余的溶解液保存在2-8℃的环境下；

(5)培养的第5天，在两个细胞培养瓶中分别加入100ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入100微升干粉C溶解液后继续培养；

(6)培养的第7天，将全部的细胞培养液及细胞转移到1.8-2升容积 的细胞培养袋中，并补加200毫升的新鲜淋巴细胞培养基；

(7)取4.5毫升的淋巴细胞培养基溶解干粉B，并利用0.22微米孔径 的滤膜过滤溶液，在两个培养袋中分别加入2毫升过滤后的溶液；

(8)培养的第9天，在两个细胞培养袋中分别加入400ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入400微升干粉C溶解液后继续培养；

(9)培养的第11天，在两个细胞培养袋中分别加入800ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入800微升干粉C溶解液后继续培养；

(10)培养的第14天，回收两个培养袋中全部的3200毫升的细胞培养 液；离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK 细胞的比例。

所述步骤(10)中，所述CIK细胞的比例是指CD3⁺CD56⁺的比例。

本发明的有益效果是：能够稳定的获得一定数量和质量的CIK细胞，细 胞总量在5*10⁹以上的淋巴细胞，其中CIK细胞(CD3⁺CD56⁺)比例达到25％ 以上。

附图说明

图1是本发明试剂盒诱导的CIK细胞；

图2是CIK细胞流式检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒，包括 20ug干粉A、40ug干粉B、120ug干粉C及6ml溶液D，按质量百分比， 各种组分的成分如下：

干粉A:10％-30％CD3单抗、10％-20％干扰素-伽马、60％-80％白细胞介 素-2；

干粉B：5％-10％CD3单抗、20％-30％CD28单抗、60％-75％白细胞介素-2；

干粉C：100％白细胞介素-2；

溶液D:20％人血白蛋白、0.72％氯化钠、79.28％注射用水。

优选，按质量百分比，干粉A：20％CD3单抗、20％干扰素-伽马、60％ 白细胞介素-2；干粉B：20％CD3单抗、20％CD28单抗、60％白细胞介素-2。

上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量CIK细胞的试剂盒的使用 方法，包括以下步骤：

(1)使用10毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉A，并利用 0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个T-175培养瓶中分别加入4.5毫升 过滤后的溶液，在CO₂培养箱中孵育2小时；

(2)分离获得1*10⁸的外周血单个核细胞，重悬于200毫升淋巴细胞培 养基中，将重悬的细胞平均接种至2个细胞培养瓶中；

(5)将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；

(4)培养的第三天，使用试剂盒中的溶液D充分溶解干粉C，并利用 0.22微米孔径的滤膜过滤溶液；在两个培养瓶中分别加入100微升的干粉C 溶解液，并将剩余的溶解液保存在2-8℃的环境下；

(5)培养的第5天，在两个细胞培养瓶中分别加入100ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入100微升干粉C溶解液后继续培养；

(6)培养的第7天，将全部的细胞培养液及细胞转移到1.8-2升容积 的细胞培养袋中，并补加200毫升的新鲜淋巴细胞培养基；

(7)取4.5毫升的淋巴细胞培养基溶解干粉B，并利用0.22微米孔径 的滤膜过滤溶液，在两个培养袋中分别加入2毫升过滤后的溶液；

(8)培养的第9天，在两个细胞培养袋中分别加入400ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入400微升干粉C溶解液后继续培养；

(9)培养的第11天，在两个细胞培养袋中分别加入800ml新鲜的淋巴 细胞培养基，并加入800微升干粉C溶解液后继续培养；

(10)培养的第14天，回收两个培养袋中全部的3200毫升的细胞培养 液；离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK 细胞的比例。

所述步骤(10)中，所述CIK细胞的比例是指CD3⁺CD56⁺的比例。

实施例1

如图1、2所示，本发明的CIK细胞的试剂盒，包括20ug干粉A、40ug 干粉B、120ug干粉C及6ml溶液D，按质量百分比，各种组分的成分如下：

干粉A：20％CD3单抗、20％干扰素-伽马(Interferon-γ，IFN-γ)、 60％白细胞介素-2(Interleukin，IL-2)；干粉B：20％CD3单抗、20％CD28 单抗、60％白细胞介素-2。干粉C：100％白细胞介素-2；溶液D:20％人血 白蛋白、0.72％氯化钠、79.28％注射用水。

具体实施方案：

1)使用10毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉A，并 利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液。在两个T-175培养瓶中分别加入 4.5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时。

2)利用淋巴细胞分离液在120毫升人外周血中分离获得1.2*10⁸的外周血单个核细胞，将其中的1.0*10⁸个细胞重悬于200毫升淋巴细胞 培养基中。将重悬的细胞平均接种至2个细胞培养瓶中。

3)将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养。

4)培养的第三天，分别对两瓶细胞进行计数，结果细胞总数为 0.8*10⁸个细胞。使用试剂盒中的溶液D充分溶解干粉C，并利用0.22 微米孔径的滤膜过滤溶液。在两个培养瓶中分别加入100微升的干粉C 溶解液。并将剩余的溶解液保存在2-8℃的环境下。

5)培养的第5天，分别对两瓶细胞进行计数，结果细胞总数为 2.5*10⁸个细胞。在两个细胞培养瓶中分别加入100ml新鲜的淋巴细胞培 养基，并加入100微升干粉C溶解液后继续培养。

6)培养的第7天，分别对两瓶细胞进行计数，结果细胞总数为 9.6*10⁸个细胞。将全部的细胞培养液及细胞转移到1.8-2升容积的细胞 培养袋中，并补加200毫升的新鲜淋巴细胞培养基。

7)取4.5毫升的淋巴细胞培养基溶解干粉B，并利用0.22微米 孔径的滤膜过滤溶液。在两个培养袋中分别加入2毫升过滤后的溶液。

8)培养的第9天，分别对两袋细胞进行计数，结果细胞总数为 18.4*10⁸个细胞。在两个细胞培养袋中分别加入400ml新鲜的淋巴细胞 培养基，并加入400微升干粉C溶解液后继续培养。

9)培养的第11天，分别对两袋细胞进行计数，结果细胞总数为 38.4*10⁸个细胞。在两个细胞培养瓶中分别加入800ml新鲜的淋巴细胞 培养基，并加入800微升干粉C溶解液后继续培养。

10)培养的第14天，回收两个培养袋中全部的3200毫升的细胞培

养液。离心并回收细胞，计算细胞总数为64.4*10⁸，并通过流式细胞检

测方法确定其中CIK细胞(CD3⁺CD56⁺)的比例为26.3％。

本发明立足于一种重要的免疫细胞－－CIK细胞的体外大规模诱导方 法，由于其在临床上巨大的应用前景。本发明涉及的试剂盒必将为有需求的 人员提供一种高效、便捷的CIK细胞获得方法。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有 识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这 种实施例都包括在本发明的范围之内。