一种盐节木扩繁方法

摘要

本发明公开了一种盐节木扩繁方法。本发明提供了一种盐节木扩繁方法，包括如下步骤：1)将盐节木外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导培养后的腋芽丛生苗；2)截取所述诱导培养后腋芽丛生苗的同化枝在所述诱导培养基中继代增殖培养，得到继代增殖培养后腋芽丛生苗；3)截取所述继代增殖培养后腋芽丛生苗的同化枝在生根培养基中生根培养，得到生根培养后苗；4)将所述生根培养后苗依次炼苗、移栽，实现盐节木扩繁；本发明的实验证明，本发明的方法为优良种质保存、快速繁殖和进一步的遗传转化及分子生物学等研究奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种盐节木扩繁方法。

背景技术

盐节木属于藜科盐节木属的一种盐生植物,分布在从非洲北部到欧洲地中海到 亚洲西部地区的盐碱地上(Qu等2008)。我国主要分布在新疆准噶尔盆地、塔里木盆地 和河西走廊等地,是盐生荒漠地中生长的多年生半灌木优势植物种,对盐生环境具有 极其广泛的适应性(高瑞如等2007,2009),盐节木种子中含有一定量的油,具有食用 价值；植株体内还含碱,是用于制作碱的原料；此外,粗蛋白含量也较高,可作为荒漠 地区动物的秋季饲料(孔令绍等,1995)。其茎叶肉质化缩短成枝,因含叶绿素能进行 光合作用,也叫同化枝,细胞液泡中水分含量较高,野生盐节木因根深入地下很深,很 难移栽成活,而且种子萌发率低,生长周期长。

目前,有关盐节木的研究前人已在种子的萌发与幼苗生长,群落的结构特征,生 物学特性,类黄酮、咖啡酸酯以及香豆素等化学成分的提取和资源的开发等方面有过 一些报道(高瑞如等,2007；2009；Qu等2008；房娟娟等,2015),关于组织培养快速 繁殖方面的研究,尚未见报道。盐节木因种子小,存在萌发所需时间长、萌发具有 不同步性以及播种繁殖幼苗管理困难等缺点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种盐节木扩繁方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将盐节木同化枝外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导培养后腋芽丛生 苗；

2)将源于所述诱导培养后腋芽丛生苗的同化枝在所述诱导培养基中继代增殖培 养，得到继代增殖培养后腋芽丛生苗；

3)将源于所述继代增殖培养后腋芽丛生苗的同化枝在生根培养基中生根培养， 得到生根培养后苗；

4)将所述生根培养后苗依次炼苗、移栽，实现盐节木扩繁。

上述方法中，所述诱导培养基为将含有6-BA的添加物添加到MS液体培养基得到 的培养基，其中，所述6-BA的浓度为0.05-1mg·L^-1；

或所述诱导培养基为将含有NAA和6-BA的添加物添加到MS培养基得到的培养基， 其中，所述NAA的浓度为0.1-1mg·L^-1所述6-BA的浓度为0.05-1mg·L^-1。

所述生根培养基为将含有IBA的添加物添加到MS液体培养基得到的培养基，其中， 所述IBA的浓度为0.05-0.2mg·L^-1。

上述方法中，

所述含有6-BA的添加物由蔗糖、6-BA和凝固剂组成；

所述含有NAA和6-BA的添加物由蔗糖、NAA、6-BA和凝固剂组成；

所述含有IBA的添加物由IBA和凝固剂组成；

所述诱导培养基为如下A)或B)：

A)所示的诱导培养基为将蔗糖、6-BA、凝固剂和MS液体培养基混匀，得到的培 养基，其中，所述蔗糖和所述6-BA的浓度分别为30g·L^-1和1mg·L^-1；

B)所示的诱导培养基为将蔗糖、NAA、6-BA、凝固剂和MS液体培养基混匀，得到 的培养基，其中，所述蔗糖、所述NAA和所述6-BA的浓度分别为30g·L^-1、1mg·L^-1和 0.05mg·L^-1；

所述生根培养基将IBA、凝固剂和MS液体培养基混匀，得到的培养基，其中，所 述IBA的浓度为0.05mg·L^-1。

上述方法中，所述诱导培养的条件为:23-28℃、光照强度120-130μmol·m^-2·s^-1、 光照时间12h·d^-1下培养30-45天；

所述继代增殖培养的条件为：23-28℃、光照强度120-130μmol·m^-2·s^-1、光照时间 12h·d^-1下培养30-45天；

所述生根培养的条件为：23-28℃；光照强度120-150μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h·d^-1下培养60天。

上述方法中，在步骤1)前还包括如下制备外植体的步骤：将盐节木的种子在萌 发培养基中萌发培养得到幼苗，所述幼苗上的同化枝，即为外植体；

所述萌发培养基为将含有NaCl的添加物添加到MS液体培养基得到培养基，其中， 所述NaCl浓度为180-220mmol·L^-1。

上述方法中，所述含有NaCl的添加物由NaCl、蔗糖、凝固剂组成；

所述萌发培养基为将NaCl、蔗糖、凝固剂和MS液体培养基混匀，得到萌发培养基， 其中，所述NaCl和所述蔗糖的浓度分别为200mmol·L^-1和20g·L^-1。

上述方法中，所述萌发培养的条件为25℃、光照强度120-130μmol·m^-2·s^-1、光照 时间12h·d^-1培养4-5个月。

上述方法中，步骤1)中，所述同化枝外植体的长度为0.5-1cm；

步骤2)中，所述源于所述诱导培养后腋芽丛生苗的同化枝的长度为1cm；

步骤3)中，所述源于所述继代增殖培养后腋芽丛生苗的同化枝的长度为1cm。

上述方法中，所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在各自培养基中的浓度具体为8g·L^-1。

本发明另一个目的是提供一种盐节木扩繁的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述诱导培养基和上述生根培养基。

上述试剂盒还包括所述萌发培养基。

上述的方法或上述试剂盒在盐节木育种中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明建立了盐节木扩繁方法，筛选出盐节木种子萌发、 幼苗生长的最适NaCl浓度，并以种子萌发苗的同化枝切段作为外植体,摸索最佳 的诱导培养和继代培养条件，实现盐节木扩繁，本发明的方法为优良种质保存、快 速繁殖和进一步的遗传转化及分子生物学等研究奠定基础。

附图说明

图1为盐节木扩繁流程图；

A:同化枝在腋芽诱导培养基上培养15d,腋芽萌发和基部一个叶腋处分化的丛 芽及产生的红色愈伤组织；B:在MS+1mg·L^-1NAA+0.05mg·L^-16-BA继代增殖培养基 上连续培养45d增殖的丛芽；C、D(E.示图D的瓶底):盐节木小苗分别在MS₀、MS +0.05mg·L^-1IBA生根培养基上培养60d生根及进一步形成的丛芽；F盐节木生根小 苗移栽到基质2个月后长大的植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用SPSS17.0统计软件进行数据分析；平均值之间的比较采用单因素 方差分析方法；不同处理间的差异采用多重比较分析(Duncan法)。

下述实施例中MS液体培养基中的溶质组分如表1所示，溶剂为水：

表1为MS液体培养基中的组分

下述实施例中的盐节木[Halocnemumstrobilaceum(Pall.)Bieb.]种子于2003 年5月,采自新疆古尔班通古特沙漠南缘的盐节木自然分布群落中。种子分装在牛皮纸 袋中，室温20-27℃下保存4年后,在4℃冰箱保存4-13年，用于种子的试管萌发和组 织培养等研究。

实施例1、盐节木的扩繁

一、盐节木的种子萌发

将常规消毒(70％乙醇消毒1分钟后用0.1％的升汞处理8-10分钟)后的盐节木种子接 种在萌发培养基中萌发培养4-5个月，且每个月将萌发培养得到的小苗转移到新鲜萌发 培养基上，得到幼苗。

上述萌发培养基的配方如下：将NaCl、蔗糖、琼脂和MS液体培养基混匀，得到萌 发培养基，其中NaCl、蔗糖、琼脂的浓度分别为200mmol·L^-1、20g·L^-1、8g·L^-1，pH值 为5.8。

上述萌发培养的条件为温度为25℃、光照强度120μmol·m^-2·s^-1,光照时间12h·d^-1。

二、同化枝腋芽诱导培养

从上述一获得的幼苗截取0.5cm长同化枝作为外植体，将外植体分别置于如下16 种诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导培养后腋芽丛生苗。

上述16种诱导培养基及其配方如下：

诱导培养基1(MS)：为将蔗糖、琼脂和MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、 琼脂的浓度为30g·L^-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基2(MS+0.1mg^L-1NAA)：为将蔗糖、NAA、琼脂和MS液体培养基混匀， 得到，其中蔗糖、NAA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基3(MS+0.5mg^L-1NAA)：为将蔗糖、NAA、琼脂和MS液体培养基混匀， 得到，其中蔗糖、NAA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.5mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基4(MS+1mg^L-1NAA)：为将蔗糖、NAA、琼脂和MS液体培养基混匀，得 到，其中蔗糖、NAA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基5(MS+0.05mg^L-16-BA)：为将蔗糖、6-BA、琼脂和MS液体培养基混 匀，得到，其中蔗糖、6-BA)和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.05mg^L-1和8g·L^-1，pH 值为5.8。

诱导培养基6(MS+0.1mg^L-1NAA+0.05mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂 和MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、 0.1mg^L-1、0.05mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基7(MS+0.5mg^L-1NAA+0.05mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂 和MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、 0.5mg^L-1、0.05mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基8(MS+1mg^L-1NAA+0.05mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂和 MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、1mg^L-1、 0.05mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基9(MS+0.1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、6-BA、琼脂和MS液体培养基混匀， 得到，其中蔗糖、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基10(MS+0.1mg^L-1NAA+0.1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂 和MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、 0.1mg^L-1、0.1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基11(MS+0.5mg^L-1NAA+0.1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂 和MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、 0.5mg^L-1、0.1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基12(MS+1mg^L-1NAA+0.1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂和 MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、1mg^L-1、 0.1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基13(MS+1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、6-BA、琼脂和MS液体培养基混匀， 得到，其中蔗糖、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基14(MS+0.1mg^L-1NAA+1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂和 MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.1mg^L-1、 1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基15(MS+0.5mg^L-1NAA+1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂和 MS液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、0.5mg^L-1、 1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

诱导培养基16(MS+1mg^L-1NAA+1mg^L-16-BA)：为将蔗糖、NAA、6-BA、琼脂和MS 液体培养基混匀，得到，其中蔗糖、NAA、6-BA和琼脂的浓度分别为30g·L^-1、1mg^L-1、 1mg^L-1和8g·L^-1，pH值为5.8。

上述诱导培养的条件为温度为25℃、光照强度120μmol·m^-2·s^-1,光照时间12h·d^-1， 培养时间为30d。

上述每种诱导培养基接种4瓶，每瓶接种5个外植体，每5d观察一次，30d后 统计腋芽诱导率、平均每个同化枝的芽萌发数和平均每个同化枝的芽增值系数；

腋芽诱导率＝能获得诱导培养后腋芽丛生苗的同化枝切段数/接种同化枝切段总 数；

1个同化枝诱导培养30d芽增殖系数＝1个源于幼苗的同化枝诱导培养后腋芽丛 生苗的腋芽数/1

结果如表2和图1A所示，

表2为不同浓度6-BA和NAA组合对盐节木同化枝腋芽诱导与继代增殖的影响

上述表中同一列中数字后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

从表2可以看出，将盐节木同化枝切段作为外植体接种在上述16种诱导培养基中, 15d后同化枝节处的腋芽启动萌发,20-30d后更为明显,有的在同化枝基部一个叶 腋处还有丛芽诱导产生(图1A)；不含6-BA的培养基中,腋芽萌发诱导率和增殖率均 很低，含6-BA的培养基中腋芽诱导率在40％-97.5％之间；当6-BA浓度为0.05mg·L^-1时,随着NAA浓度升高,腋芽诱导率从87.5％提高到97.5％；当6-BA的浓度为1mg·L^-1时,随着NAA浓度的升高,腋芽的诱导率呈现从96.9％到75％逐渐下降的趋势，其中8 号：MS+0.05mg·L^-16-BA+1mg·L^-1NAA和13号：MS+1mg·L^-16-BA两种培养基中腋芽 诱导率和芽增值率最高，为最佳腋芽诱导培养基，培养30d时,平均每个外植体可诱 导产生2.50个芽,而且，小苗生长健壮均为深绿色。

在含0.05-1mgL^-16-BA+0.5-1mg·L^-1NAA诱导培养基上,外植体切口处还会有愈伤 组织的产生,愈伤组织诱导率会随NAA浓度的升高而逐渐升高,在25％-100％之间,说明 NAA对愈伤组织的诱导起主效作用,对腋芽萌发的诱导起协同作用，6-BA则对腋芽的 萌发、丛芽的诱导起主效作用。

因此，最佳诱导培养基为诱导培养基8：MS+0.05mg·L^-16-BA+1mg·L^-1NAA和诱导 培养基13：MS+1mg·L^-16-BA。

三、继代增殖培养

从上述二获得的诱导培养后腋芽丛生苗上截取1cm长的同化枝转移到对应的新鲜 诱导培养基(诱导培养和继代培养采用的培养基相同且对应)上进行继代增殖培养， 得到继代增殖培养后腋芽丛生苗(图1B)。

上述继代增殖培养的条件为温度为25℃、光照强度130μmol·m^-2·s^-1,光照时间 12h·d^-1，培养时间为45d。

上述每种培基接种5瓶、每瓶5株。

统计继代增殖培养后腋芽丛生苗的腋芽增值系数，

1个同化枝继代增殖培养腋芽增值系数＝1个源于诱导培养后腋芽丛生苗的同化枝 继代增殖培养后腋芽丛生苗数的腋芽数/1

结果如表2所示，可以看出，继续继代增殖后仍然是8号(MS+0.05mg·L^-16-BA+1 mg·L^-1NAA)和13号(MS+1mg·L^-16-BA)两种培养基中培养得到的继代培养芽的增值 系数最高，最高可达4.92左右。

因此，诱导培养基8和诱导培养基13也是最佳继代增殖培养基。

四、生根培养

上述三中经过诱导培养基8培养获得的继代增殖培养后腋芽丛生苗继上截取1cm 长同化枝垂直插入生根培养基中,生根培养，得到生根培养后苗。每瓶接种4-5个同化 枝,实验重复3次。

上述生根培养基1为将8mg·L^-1琼脂添加到MS液体培养基中得到的培养基。

上述生根培养基2为将0.025mg·L^-1IBA和8mg·L^-1琼脂添加到MS液体培养基中得到 的培养基。

上述生根培养基3为将0.05mg·L^-1IBA和8mg·L^-1琼脂添加到MS液体培养基中得到 的培养基。

上述生根培养基4为将0.1mg·L^-1IBA和8mg·L^-1琼脂添加到MS液体培养基中得到 的培养基。

上述生根培养基5为将0.2mg·L^-1IBA和8mg·L^-1琼脂添加到MS液体培养基中得到的 培养基。

上述生根培养的条件为温度为25℃、光照强度150μmol·m^-2·s^-1,光照时间12h·d^-1， 培养时间为60d。

每周观测一次,60d后以1个同化枝生根培养后苗的芽增殖系数、苗高、生根数、 每个源于继代增殖培养后腋芽丛生苗的同化枝的生根数等为指标,观察记录,筛选适 宜的芽苗伸长与生根培养基。

1个同化枝生根培养后苗的芽增殖系数＝1个源于继代增殖培养后腋芽丛生苗的同 化枝生根培养后苗的腋芽数/1

生根培养后苗的高度(见表3,4.10±0.89-5.63±0.48)

生根率＝生根株数/接种源于继代增殖培养后腋芽丛生苗的同化枝的总数 ＝65％～99％(见表3)；

结果如表3所示，培养15d时可见根原基的产生,20d时根长约0.5-1cm,此后,根 继续伸长并伴随侧根的形成。培养60d后,继代增殖培养后腋芽丛生苗在MS₀培养基 上的生根率约为60％(图1C),随着IBA浓度的提高,小苗生根率呈现先升高后降低 的趋势,0.05mg·L^-1时,达到最高为99％(图1D、图1E)，平均生根数也最多。此外, 在生根过程中，小苗基部还会有丛芽的继续增殖和芽苗的伸长生长(图1C、图D)。 60d后各培养基中芽增殖系数与苗的高度见表3。在5种生根培养基上,芽增殖系数 和芽苗高度随着IBA浓度的增加而呈上升的趋势,在MS+0.20mg·L^-1IBA培养基上的小 苗芽增值率最高,芽苗增高长度最高达6cm。

表3为IBA对盐节木小苗生根的影响

同列中不同小写字母表示数据存在显著差异，(x±s,生根率n＝4-6,其他 n＝15,P<0.05)。

因此，较好的生根培养基为含有0.05-0.2mg·L^-1IBA的生根培养基，最好的为含 有0.05mg·L^-1IBA的生根培养基3。

五、炼苗与移栽

将上述四获得的生根培养后苗,开口炼苗3d,用镊子小心取出试管苗,将根上 的培养基冲洗干净,移栽到装有沙土、蛭石、营养土(体积比为1:1:1)混合基质的7 cm×7cm营养钵中,每钵移栽4株,共36钵90株，营养钵放在浅盘中,用自来水洇 水浇灌。移栽后的小苗先在温室(温度25℃；光照强度130μmol·m^-2·s^-1,)培养15d,然 后于5月末置于临汾当地全天候自然光照下,温度25～30℃，每天空气喷雾1次， 保持空气相对湿度60％左右。

结果，生根培养后苗开口炼苗3d后,将其移栽到混合基质中温室内培养,小苗 基部15d左右能长出新根,然后将小苗移到室外,置于自然光照条件下,2个月后移 栽的90株植株有82株成活，移栽成活率达91％,株高可达13cm,小苗生长健壮(图 1F)。

1个0.5cm源于幼苗的同化枝从最初的一个芽(一个同化枝有一个顶芽)经诱导 (MS+1mg·L^-1NAA+0.05mg·L^-16-BA)、继代(MS+1mg·L^-1NAA+0.05mg·L^-16-BA)、生根(MS+0.05 mg·L^-1IBA)3个环节形成2.5*4.33＝10.8棵完整的生根苗；

1个1cm源于幼苗的同化枝从最初的一个芽(一个同化枝有一个顶芽)经诱导(MS+1 mg·L^-1NAA+0.05mg·L^-16-BA)、继代(MS+1mg·L^-1NAA+0.05mg·L^-16-BA)、生根(MS+0.05 mg·L^-1IBA)3个环节形成4.33*4.33＝18.7棵完整的生根苗。

按照上述的方法，将诱导培养基13替换诱导培养基8，结果要优于培养基8:

1个0.5cm源于幼苗的同化枝从最初的一个芽(一个同化枝有一个顶芽)经诱导 (MS+1mg·L^-16-BA)、继代(MS+1mg·L^-16-BA)、生根(MS+0.05mg·L^-1IBA)3个环节形 成2.47*4.92＝12.8棵完整的生根苗；

1个0.5cm源于幼苗的同化枝从最初的一个芽(一个同化枝有一个顶芽)经诱导 (MS+1mg·L^-16-BA)、继代(MS+1mg·L^-16-BA)、生根(MS+0.05mg·L^-1IBA)3个环节形 成4.92*4.92＝24.2棵完整的生根苗。