一种测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法

摘要

本发明公开了一种测定蛋白激酶活性的方法，其主要步骤为：选取一组不同浓度的PKA和同一浓度的ATP进行反应，得到一组PKA反应液，再分别将PKA反应液和Na

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及一种利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法 和蛋白激酶抑制剂活性的方法。

背景技术

蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，能够调节细胞内大 多数蛋白的功能。蛋白的磷酸化修饰与众多生理过程紧密相关，如信号传导、代谢调控、DNA 损伤修复、基因转录和细胞凋亡等。蛋白激酶是一种磷酸转移酶，能够将三磷酸腺苷(ATP) 上的γ-磷酸基团转移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)残基上。蛋白 激酶是酶家族的重要成员，活性正常的蛋白激酶体系是细胞信号传导运作的核心，但当其活 性异常或者过度表达时就会引起某些蛋白磷酸化的异常。人类许多疾病就和蛋白磷酸化异常 密切相关，如癌症、糖尿病及老年痴呆等。由于蛋白激酶调控着每个组织、每个器官、甚至 每个细胞的生死，从而已成为治疗这些复杂疾病的重要药物靶点。因此，测定蛋白激酶的活 性及筛选蛋白激酶抑制剂在生物医学诊断以及酶靶药物开发等领域激起了人们的兴趣。

传统测定蛋白激酶的方法一般都是通过蛋白磷酸化的程度，采用放射性同位素标记法、 表面等离子共振法、质谱法、荧光法和免疫法等来检测的，这些检测手段和方法在一定程度 上促进了对蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素标记ATP技术， 检测方法直接、灵敏度高，但存在放射性污染，不能进行组织标记；免疫法对磷酸化识别抗 体的要求较高，专一性不强、费用高。因此，开发一种快速、简便、经济、灵敏度高且无需 标记的蛋白激酶活性检测及高通量筛选抑制剂方法是非常必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、灵敏度高、检测 范围宽、且检测用时短的利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的 方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种测定蛋白激酶(PKA)活性的方法，包括以下步骤：

(1)处理金电极：准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化 石墨烯溶液，烘干备用；

(2)测定蛋白激酶的活性：选取一组不同浓度的蛋白激酶和同一浓度的ATP(腺嘌呤核 苷三磷酸)进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的蛋白激酶反应液和 Na₂MoO₄溶液滴加在步骤(1)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方 波伏安曲线测试，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶 的浓度做标准曲线；

(3)根据所述标准曲线计算不同浓度下蛋白激酶的活性。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，ATP浓度为50～500μM，ATP浓度的选取需 进行优化，其优化过程具体为：选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水 浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na₂MoO₄溶液滴 加在步骤(1)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试， 根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓 度。更优选的，ATP浓度为250μM。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，Na₂MoO₄溶液的浓度为6～10mM，水浴反应 的温度35.5～38.5℃，水浴反应的时间为1～2小时，静置的时间为10～30min。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为：电解液为0.5M 的H₂SO₄，电压为0.1～0.5V，频率为15HZ。

上述的方法，优选的，金电极的表面清理过程具体为：将金电极在含Al₂O₃的抛光布上 进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗，用氮气吹 干。

本发明还提供一种测定蛋白激酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤：

(1)处理金电极：准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化 石墨烯溶液，烘干备用；

(2)测定蛋白激酶抑制剂的活性：选用一组不同浓度的蛋白激酶抑制剂分别和同一浓度 的蛋白激酶、同一浓度的ATP进行水浴反应，再分别将得到的反应液与Na₂MoO₄溶液滴加在 步骤(1)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行扫方波伏安曲线测试， 根据伏安曲线分别得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶抑制剂的浓度 做拟合曲线；

(3)根据所述拟合曲线计算不同浓度下蛋白激酶抑制剂对蛋白激酶活性的抑制程度。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，ATP浓度为50～500μM，ATP浓度的选取需 进行优化，其优化过程具体为：选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水 浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na₂MoO₄溶液滴 加在步骤(1)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试， 根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓 度。更优选的，ATP浓度为250μM。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，Na₂MoO₄的浓度为Na₂MoO₄的浓度为6～10mM； 水浴反应的温度35.5～38.5℃，水浴反应的时间为1～2小时，静置的时间为10～30min。

上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为：电解液为0.5M 的H₂SO₄，电压为0.1～0.5V，频率为15HZ。

上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，金电极的表面清理过程具体为：将金电极在含 Al₂O₃的抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声 清洗，用氮气吹干。

本发明的原理如图1所示，是基于蛋白激酶PKA可以催化水解三磷酸腺苷ATP生成二 磷酸腺苷(ADP)和游离的磷酸根，且磷酸根在酸性条件下与钼酸钠反应生成能产生电信号 的磷钼酸钠沉淀，电信号的大小与蛋白激酶活性成正相关，从而可以通过电化学法测定蛋白 激酶PKA的活性及抑制性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的方法避开了现有技术中繁琐的蛋白磷酸化的步骤，直接通过电化学信号大 小来测定PKA水解ATP产生的游离磷酸根的量，从而反映出蛋白激酶PKA的活性。该方法 操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短，具体的表现为本发明可以在0.0005～500 U/mL范围内测定蛋白激酶PKA的活性，跨越5个数量级，检测范围宽。本发明的灵敏度高， 本发明的检测线可以达到2U/L(以信噪比为3的方法)，远远低于之前文献报道的基于半合成 荧光法测定PKA活性(500U/L)、石墨烯量子点测定PKA活性(30U/L)和银纳米簇测定PKA 活性(500U/L)等。本发明省去了常规繁琐的蛋白磷酸化过程，只是通过“混合-检测”就可以 在1.5个小时完成整个步骤，用时短，操作方便；同时可推广到其他磷酸水解酶的活性测定。

(2)本发的方法操作简单、灵敏度高，这为高效、快速、低投入地筛选多种有效的PKA 抑制剂提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明的原理示意图。

图2为本发明的实施例1中不同浓度的PKA电化学响应信号图。

图3为本发明的实施例1中浓度范围为5U/L～500U/mLPKA活性对应的标准曲线图。

图4为本发明实施例2中不同浓度的PKA抑制剂H-89的电化学响应信号图。

图5为本发明实施例2中不同浓度的PKA抑制剂对PKA活性抑制得曲线拟合图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致 地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。 本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范 围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以 通过公知的方法制得的产品。

实施例1：

一种本发明的测定蛋白激酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)处理金电极：将多根直径为2mm的金电极在含有0.05μm的Al₂O₃抛光布上进行 抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗5分钟，将附着 于金电极表面的抛光粉清除干净，再用氮气吹干。将清洗好的金电极、Ag/AgCl参比电极和 铂丝对电极共同放入装有5mmol·L^-1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1-0.6V电压下，进行 循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V·s^-1，电位差达到85mV，表明金电极表面被处理干 净，可以用于电极的修饰。取5μL2mg/mL的氧化石墨烯滴加在表面清理干净的金电极表面， 在60℃的烘箱中烘干，备用。

(2)ATP浓度的优化：固定Na₂MoO₄的浓度为6mM，ATP的浓度分别为0、50、100、 200、250、500μM，取两者各7.5μL滴加在步骤(1)处理后的金电极表面，反应20min， 然后在60℃的烘箱中烘干，电极修饰完成。然后以0.5M的H₂SO₄为电解液，在0.1～0.5V 范围内，15HZ的频率扫方波伏安曲线，发现电极电流信号同ATP浓度成正比，说明ATP本 身的磷酸根会与Na₂MoO₄发生反应产生背景干扰，需优化ATP的浓度，既能够使该传感器 灵敏，又能降低背景的干扰。所以，再固定PKA为0.05U/μLATP分别为0、50、100、250、 500μM，将两者先在37℃的水浴中反应1小时，使得ATP充分水解，再分别取蛋白激酶反 应液和6mM的Na₂MoO₄各7.5μL滴加在氧化石墨烯修饰好的金电极表面，反应20min， 然后在60℃的烘箱中烘干，以同样的条件扫方波伏安曲线。发现加入PKA之后电化学信号 均有增大，且取250μMADP与Na₂MoO₄在同样条件下反应测得的电化学信号与ATP的信号 强度是一致的，说明确实是酶反应产生游离的磷酸根使得信号强度增强。由于250μM的ATP 在酶反应之后与只有ATP时的电信号增加最大，因而选定250μM作为ATP的最优浓度。

(3)测定蛋白激酶的活性：取浓度分别为0、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50、500U/mLPKA 分别和250μMATP在37℃的水浴中反应1小时得到一组PKA反应液，再取体积为7.5μL 的上述不同浓度的PKA反应液分别和7.5μL、6mM的Na₂MoO₄滴加在步骤(1)处理的一 组金电极表面，反应20min，然后在60℃的烘箱中烘干，以0.5M的H₂SO₄为电解液，在0.1～0.5 V范围内，15HZ的频率扫方波伏安曲线，其电化学响应信号图如图2所示，根据伏安曲线得 到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶的浓度做标准曲线，如图3所示， 通过测定未知活性的PKA电流值，从标准曲线上找出对应的PKA活性值。经过计算，该标 准曲线的拟合优度为R²＝0.9847。

本发明可以在0.0005～500U/mL范围内测定蛋白激酶PKA的活性，跨越5个数量级，检 测范围宽。本发明灵敏度高，本发明的检测线可以达到2U/L(以信噪比为3的方法)，远远低 于之前文献报道的基于半合成荧光法测定PKA活性(500U/L)、石墨烯量子点测定PKA活性 (30U/L)和银纳米簇测定PKA活性(500U/L)等。本发明省去了常规繁琐的蛋白磷酸化过程， 只是通过“混合-检测”就可以在1.5个小时完成整个步骤，用时短，操作方便。

实施例2：

一种本发明的测定蛋白激酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤：

(1)处理金电极：方法与实施例1相同。

(2)ATP浓度的优化：与实施例1相同。

(3)测定蛋白激酶抑制剂的活性：取浓度分别为0、0.01、0.1、0.5、1、5、10、25μM 的PKA抑制剂H-89分别与50U/mL的PKA、250μMATP在37℃的水浴中反应1小时，得 到一组不同PKA抑制剂浓度的反应液，再取体积均为7.5μL的上述不同PKA抑制剂浓度的 反应液和7.5μL、6mM的Na₂MoO₄滴加在步骤(1)处理好的金电极表面，反应20min，然 后在60℃的烘箱中烘干，以0.5M的H₂SO₄为电解液，在0.1～0.5V范围内，15HZ的频率扫 方波伏安曲线，如图4所示，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应 的蛋白激酶抑制剂的浓度做拟合曲线，如图5所示，通过拟合曲线可以计算不同浓度下蛋白 激酶抑制剂对蛋白激酶活性的抑制程度。测定H-89的半数抑制浓度IC₅₀为1.05649μM。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员 应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的 原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改 进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界 定。