一种靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法

摘要

一种靖西细筒苣苔叶片组培两步成苗方法：取靖西细筒苣苔幼嫩叶片作为外植体进行灭菌处理，然后将其切分成含主脉0.5？cm×1？cm大小后接种到诱导及分化培养基上，1？~1.5个月后选择幼嫩叶片上分化出的具有2片以上叶子、高1~2.5cm的无菌芽苗转接到壮苗生根培养基上；当无菌苗每株生根4条以上、根长达2.5~4cm时，炼苗3~4天，将组培苗从培养瓶中取出，将其移栽至灭菌的栽培基质中。采用本发明方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量靖西细筒苣苔的优质种苗，并减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本降低，有效解决了靖西细筒苣苔规模化育苗及种质资源保存问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法。

背景技术

靖西细筒苣苔为苦苣苔科细筒苣苔属植物，是2011年发现的新种，靖西细筒苣苔为多年生草本，根状茎圆柱形，叶片肾形或圆形，花序梗、花序和花期外被线状短柔毛和紫色腺体，花期5-6月，果期6月。中国特有珍稀植物，特产广西靖西，生于石灰岩山地岩石上，海拔约为200-250m。

靖西细筒苣苔分布区域极其狭窄，目前仅在广西靖西地区石灰岩山陡崖上发现少量植株，由于生长环境恶劣缺少水肥，加之其种子细小，萌发需要的温度范围、湿度范围和土壤酸碱度范围比较小，自然界难以进行有性繁殖，急需建立有效的繁育和保护体系，本发明旨在通过组织培养技术叶片两步成苗方法对靖西细筒苣苔种质资源进行有效的繁育和保护，是目前对靖西细筒苣苔育苗最便捷、稳定的手段，可以节约大量的人力、物力和场地，便于种质交换和转移，避免有害病虫的人为传播。

发明内容

本发明目的在于提供一种靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法，能够短时间内提供大量优质适合栽培的靖西细筒苣苔种苗。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法，其特征在于：

（1）叶片诱导分化不定芽培养：取靖西细筒苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s，无菌水2~3次，投入0.1%Hcl₂5min,无菌水2~3次，0.1%Hcl₂3min，无菌水2~3次冲洗干后切分为0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为22~26°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天的条件下，10~15天叶片分化出不定芽；

（2）不定芽壮苗生根培养：选择靖西细筒苣苔叶片分化1~1.5个月高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为22~26°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高4~6cm的无菌苗。

当无菌苗每株生根4条以上、根长达2.5~4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3~4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中。

采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量靖西细筒苣苔的优质种苗，并减少了配制培养基和转瓶的步骤，节约了大量人力物力，因此简单易行、生产成本降低，有效解决了靖西细筒苣苔规模化育苗及种质资源保存问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

靖西细筒苣苔组培叶片两步成苗方法法，包括以下步骤：

（1）叶片诱导分化不定芽培养：取靖西细筒苣苔幼嫩叶片，在75%乙醇中表面消毒30~45s，无菌水2~3次，投入0.1%Hcl₂5min,无菌水2~3次，0.1%Hcl₂3min，无菌水2~3次冲洗干后切分为0.5cm×1cm大小接种在诱导及分化培养基上，在温度为22~26°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天的条件下，10~15天叶片分化出不定芽，观察发现，6-BA和NAA浓度对不定芽数诱导有显著影响，在6-BA浓度为1.5mg/L,NAA浓度为1.0mg/L,KT浓度为0.2mg/L时不定芽数最高，达到11.6个。

上述诱导及分化培养基为：以MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤1~2.0mg、α-萘乙酸0.3~１mg、激动素0.2~0.5mg、琼脂3.8~4.5g和蔗糖20~25g，ｐＨ值5.8~6.0，培养温度为24±2°C，光照强度1800~2600lux，光照时间为8~10小时/天。

（2）不定芽壮苗生根培养：选择靖西细筒苣苔叶片分化1~1.5个月高2~3cm不定芽接种到壮苗生根培养基，在温度为22~26°C，光照强度2000~2800lux，光照时间为8~10小时/天的条件下进行培养，1~2个月不定芽长至高4~6cm的无菌苗。观察发现，在添加0.5g/L活性炭的MS培养基中6-BA和IAA协同作用对靖西细筒苣苔生根效果好，当6-BA浓度升高为0.6mg/L，NAA浓度为1.0mg/L时靖西细筒苣苔组培苗生根效果最好，植株粗壮，植株高度5.3cm，生根率达到100%，平均根数达到6根。

当无菌苗每株生根4条以上、根长达2.5~4cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3~4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至灭菌的栽培基质中。

备注：6-BA（6-苄氨基嘌呤）,NAA（萘乙酸）,KT（激动素）,IAA(吲哚乙酸),AC(活性炭)。