一种血清外泌体中RNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种血清外泌体中RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取血清中的外泌体；2)在超声的作用下使用RNA提取试剂裂解步骤1)中提取的外泌体；3)使用氯仿分离步骤2)中裂解后的外泌体的RNA至水相；4)使用异丙醇沉淀步骤3)得到的水相中的RNA；5)使用乙醇洗涤步骤4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌体中的RNA。本发明的血清外泌体中RNA的提取方法具有提取时间短、效率高、效果好、试验成本低的优点。

说明书

技术领域

本发明属于RNA提取领域，尤其涉及一种血清外泌体中RNA的提取方法。

背景技术

外泌体(exosome)是一种30-100nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细 胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内 都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公 布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。

据研究报道，外泌体中含有的内容物如微RNA(mRNA、miRNA)、蛋白质和信号复合物 在受体细胞基因和蛋白表达调控中有重要作用。如血清外泌体中的miRNA(exosomal- miRNA)具有独特的介导细胞间通讯的功能，能特异性抑制靶细胞中的靶基因表达，因此与 游离miRNA相比，血清exosomal-miRNA水平的变化更加能代表恶性肿瘤的生物学功能的变 化。另外，肿瘤细胞衍生外泌体通过传递的miRNA还能调节肿瘤细胞转移前微环境的形成。 目前，在肿瘤、生殖、血液和免疫等生物医学领域，正开展一场与外泌体内容物(如蛋白、 RNA)功能机制分析有关的前所未有的研究热潮。

由此可见，外泌体的成功分离及其内容物的提取显得尤其重要。传统的外泌体分 离提取方法是使用超高速差速离心法，该方法操作简单但不适合大量样品的制备，因为效 率较为低下、易被污染。另外一种方法是超滤蔗糖密度梯度离心法，该方法分离到的外泌体 纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。还有一种就是免疫磁珠分选，该方法可以保证 外泌体形态的完整，特异性高、操作简单，但非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物 活性，不便进行下一步实验。目前，分离外泌体采用最多的方法是免疫共沉淀原理进行的， 该方法操作简便，能够获得高纯度的外泌体样本。典型代表有lifetechnology公司的 TotalExosomeIsolationReagent、SBI公司的ExoQuick和ExoQuick-TC。

然而，现有的用于提取外泌体方法大多只是将外泌体这种完整的囊泡结构提取出 来，但是囊泡内的微RNA以及肿瘤相关抗原等激活免疫细胞的重要成分很难提取。原因是外 泌体本身性状粘稠，极难打散，这导致在提取外泌体RNA的过程中，裂解液不易渗透进去，致 使裂解很难充分，裂解时间长。

目前，市场上用于提取外泌体RNA的试剂较少，life公司有专门提取的试剂盒，但 价格昂贵，且该试剂盒用的是柱式法提取外泌体RNA，该方法得到的RNA纯度高，但存在一个 柱式法的普遍致命问题，就是柱式法损失量大，致使RNA提取量大大减少，该方法对于本身 含量极低的血清来源外泌体中RNA来说，无疑还不是一种最佳的选择方法。除了柱式法，还 有另外一种经典方法，就是常规的RNA沉淀法。该方法在外泌体RNA提取过程中，由于外泌体 极粘稠的性状，使常规的RNA沉淀法同样存在外泌体裂解时间长，极难充分裂解等问题。

总而言之，不管采用哪种方法，血清中外泌体分离一直存在提取困难、提取量少、 提取费用昂贵等难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种血清外泌体中RNA 的提取方法，本发明的RNA的提取方法具有提取时间短、效率高、效果好、试验成本低的优 点。

本发明采用的技术方案为：一种血清外泌体中RNA的提取方法，包括以下步骤：

1)提取血清中的外泌体；

2)在超声的作用下使用RNA提取试剂裂解步骤1)中提取的外泌体；

3)使用氯仿将步骤2)得到的裂解后的外泌体中的RNA分离至水相；

4)使用异丙醇沉淀步骤3)得到的水相中的RNA；

5)使用乙醇洗涤步骤4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌体中 的RNA。

优选地，所述步骤1)中，使用TotalExosomeIsolation试剂提取血清中的外泌 体。

优选地，所述步骤2)中，所述RNA提取试剂为Trigene。

优选地，所述步骤2)中，超声的频率为28-35KHz，超声处理时间为2-3min。

优选地，所述步骤1)通过以下步骤实施：

11)将血清放置冰上溶解，加入TotalExosomeIsolation试剂，充分混匀后，静置 冰上30min；

12)4℃离心，1500×g，10min；

13)移除所有上清，沉淀部分即为所述外泌体。

优选地，所述步骤3)通过以下步骤实施：

31)向步骤2)中裂解后的外泌体中加入氯仿，充分震荡混匀，室温静置约2min；

32)4℃离心，10000×g，10min；可见分为三层，RNA在上层水相，转移水相。

优选地，所述步骤4)通过以下步骤实施：

41)向步骤3)得到的水相中加入异丙醇，轻柔充分混匀，-20℃静置过夜，沉淀RNA；

42)4℃离心，12000×g，15min；弃上清，即得沉淀的RNA。

优选地，所述步骤5)通过以下步骤实施：

51)用75％乙醇洗涤步骤4)中沉淀的RNA；4℃离心，12000×g，5min；弃上清；

52)加入DEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌体中的RNA。

优选地，所述的血清外泌体中RNA的提取方法，包括以下步骤：

A.将250μL血清放置冰上溶解，再加入50μLTotalExosomeIsolation试剂，用枪 轻轻吹打充分混匀后，静置冰上30min；

B.4℃离心，1500×g，10min；

C.用枪头尽量移除所有上清，沉淀部分即为外泌体；

D.将提取到的外泌体加入1mLTrigene，在频率为28-35KHz的超声波中超声处理 2-3min，即可使粘稠的外泌体充分裂解；

E.加入200μL氯仿，充分震荡混匀约30s，使水相和有机相充分接触，室温静置约 2min；

F.4℃离心，10000×g，10min；可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一新的 RNase-freeEP管；

G.加入等体积的异丙醇，轻柔充分混匀，-20℃静置过夜，沉淀RNA；

H.4℃离心，12000×g，15min；弃上清，可再稍加离心，吸去多余上清；

I.用75％乙醇洗涤两次，须轻晃起沉淀物；4℃离心，12000×g，5min；弃上清；

J.加入20-50μLDEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌体的RNA。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本方法加速了实验流程：通过超声波震荡技术使粘稠的外泌体分离物的裂解时 间从30min缩短到5min左右，大大缩短了裂解时间，效果明显；

2)本方法节约了实验成本：由于超声波震荡技术的应用，使exosome-RNA的提取对 试剂的可选度加大，低成本的国产试剂Trigene就可以完成粘稠exosomal分离物的快速裂 解，而不需要用到进口试剂；

3)本方法在提取工艺中使用超声波震荡技术，不用添加任何化学物质，又克服了 引入不必要的外源性无机离子，工艺简单，具有较好的实际应用价值。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。

以下实施例中RNA的含量的测定采用qPCR方法进行，具体方法如下：

首先按常规方法逆转录获取cDNA，然后进行荧光定量PCR反应，具体操作如下：

(1)RNA的逆转录反应：将上述exosome中提取的RNA作为模板，在去RNase的PCR管 中加入RNA模板(≤10μg)和RNAfreeH₂O至总体积为8μL；

(2)将上述溶液混匀，70℃孵育5min，随后立即置于冰上急冷，以防止RNA复性再次 恢复二级结构；

(3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液(单位：μL)：

(4)将3)中的溶液加入到1)的溶液中，混匀后42℃孵育60min。

(5)70℃孵育5min灭活逆转录酶，即可获得cDNA。

(6)按以下反应体系对逆转录出的miRNA分别进行qPCR检测(单位：μL)：

(7)qPCR反应条件为：

95℃，5min

95℃，15s→50℃，30s共40个循环(在50℃收集荧光信号)

95℃，15s→60℃，30s→95℃，15s(熔解曲线：在第二个95℃收集信号)

实施例1

Exosome-RNA提取试剂的筛选

目前市场上用于提取exosome的试剂主要来自SystemBiosciences和life technology这两家公司，因此我们对比了两家公司的3种产品在用于本项目血清样本的 exosome提取方面的效果，包括SBI公司的ExoQuick(适用于血液)和ExoQuick-TC(适用于组 织和尿液)，lifetechnology公司的TotalExosomeIsolationReagent(适用于血清)。

ExoQuick、ExoQuick-TC与TotalExosomeIsolationReagent提取exosome的过 程相同，区别只在于试剂的用量与血清样本的比例不同。ExoQuick、ExoQuick-TC与血清样 本的比例为60:250，而TotalExosomeIsolationReagent的比例为50:250。

使用TotalExosomeIsolationReagent进行exosome提取的方法为：

(1)将250μl血清放置冰上溶解，再加入50μlTotalExosomeIsolation试剂，用 枪轻轻吹打充分混匀后，静置冰上30min；

(2)4℃离心，1500×g，10min；

(3)用枪头尽量移除所有上清，沉淀部分即为exosome分离物。

ExoQuick和ExoQuick-TC与血清样本的比例为60:250，TotalExosomeIsolation Reagent与血清样本的比例为50:250，相对来说life公司的产品用量较省，成本较低。在对 exosome的分离效果方面，ExoQuick-TC获得的沉淀量较大，ExoQuick和TotalExosome IsolationReagent获得的沉淀量基本一样，但提取到的miRNA的量无差异。结果如下表所 示。

实施例2

Exosome-RNA提取流程的优化

由于沉淀的exosome粘度非常大，在RNA抽提裂解步骤时处理难度很大，上述三个 厂家的产品均需要裂解30min以上，TotalExosomeIsolationReagent、ExoQuick和 ExoQuick-TC仍然无法裂解完全，分层不明显，水相少(仅100～150μL)，通过qPCR检测最终 得到的RNA的Ct值均偏高。为此，为了优化RNA抽提过程中的exosome沉淀物裂解步骤，我们 分别使用了“lifetechnology的TrizolLS30min未经超声处理”、“lifetechnology的 TrizolLS5min添加超声震荡处理”和“国产的Trigene试剂5min添加超声震荡”这三种不 同的处理方式，并对效果进行比较。

使用Trigene试剂提取exosome-RNA(即“国产的Trigene试剂5min添加超声震荡”) 的具体操作如下：

(1)向使用TotalExosomeIsolationReagent试剂提取到的exosome分离物中加 入1mlTrigene试剂，并置于小型超声波提取仪(型号：SY-150)中，超声处理2-3min(功率 150W，标频28-35kHz自动转换)，即可使粘稠的外泌体分离物充分裂解。

(2)加入200μl氯仿，充分震荡混匀约30s，使水相和有机相充分接触，室温静置约 2min。

(3)4℃离心，10000×g，10min。可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一新的 RNase-freeEP管。

(4)加入等体积的异丙醇，轻柔充分混匀，-20℃静置过夜，沉淀RNA。

(5)4℃离心，12000×g，15min。弃上清，可再稍加离心，用枪吸去多余上清(离心后 可见底部的沉淀物即为RNA)。

(6)用75％乙醇洗涤两次，须轻晃起沉淀物。4℃离心，12000×g，5min。弃上清。(可 再稍加离心，用枪吸去多余上清。超净工作台上开盖风干，约5min切勿晾过干)。

(7)加入20-50μlDEPC水溶解沉淀，即可得到来自血清外泌体的RNA。

“lifetechnology的TrizolLS30min未经超声处理”的具体操作除了步骤(1)使 用TrizolLS在未经超声处理的情况下将exosome分离物处理30min外，其余同“国产的 Trigene试剂5min添加超声震荡”的具体操作；“lifetechnology的TrizolLS5min添加超 声震荡处理”的具体操作除了使用的试剂为TrizolLS外，其余同“国产的Trigene试剂5min 添加超声震荡”的具体操作。

结果表明，在不进行超声振荡处理时，TrizolLS能够成功裂解沉淀，但需时30min 以上，而国产Trigene则无法裂解沉淀；如果使用国产试剂Trigene，通再过超声振荡处理2- 3min，粘稠的exosome沉淀物即可快速溶解，再放置5min即可裂解完全，可获得至少300～ 400μl水相。通过qPCR方法检测获得的RNA的相对含量，来对三种处理方式进行比较。结果如 下表所示，可以明显看出，最后得到的RNA总量中，用国产低成本的试剂Trigene来裂解 exosome沉淀物(经超声波震荡处理)用时仅5min，最后得到RNA沉淀物，能达到裂解用时 30min的进口试剂(未经超声波处理)的效果，但裂解时间明显缩短，实验成本也显著降低。

为了验证上述三种不同处理方法提取的同一样本的血清外泌体RNA中含有的 miRNA情况，各选取一个RNA样品，用不同的miRNA引物进行qPCR检测。结果如下表所示，三种 处理方式最后得到的各种miRNA含量并无明显差异。说明加入超声振荡处理可使裂解时间 缩短至5min之内，且提取RNA的效率更高。另外，超声震荡处理的添加，可使exosome-RNA的 提取对试剂的可选度加大，低成本的国产试剂Trigene就可以完成粘稠exosome分离物的快 速裂解。

综上表明，本发明提供的一种基于超声震荡技术的exosome-RNA提取新方法，相较 于现有技术，从实验流程和实验成本两个方面得到了很大改进，使exosome-RNA提取的时间 缩短，高效率的同时也大大降低了实验成本。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。