CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用

摘要

本发明公开了CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用。本发明发现MTB感染DC后导致CD1c表达下调；菌阴肺结核患者PBMC来源的DC中，CD1c的表达水平与健康志愿者相比显著下调；对119例菌阴肺结核患者PBMC的检测结果也显示，其CD1c的表达水平显著低于健康志愿者；受试者工作特征曲线分析结果表明，CD1c有望成为菌阴肺结核诊断新靶点。通过检测CD1c？mRNA的表达水平，能够有效区分未感染人群与菌阴肺结核患者。

说明书

技术领域

本发明涉及CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用。

背景技术

结核至今仍是全球范围内感染率最高的传染病，防控形势十分严峻。快速、敏感诊断是提高治疗效果、有效控制结核病传播的关键。在全国肺结核患者中，菌阴肺结核患者占活动性肺结核患者的60%～70%，且多种其他肺部疾病的临床症状和影像学特征难以与结核病相区别。对菌阴肺结核有效诊断的方法缺乏，往往造成患者诊断延误或误诊。我国虽已制定诊断的若干标准，但在临床应用中仍存在许多困惑，并未解决有效诊断菌阴肺结核这一难题。因此，寻找菌阴肺结核诊断新标识、开创新诊断方法已成为当务之急！

现有肺结核诊断方法可根据检测对象来源于结核菌或机体而分为直接检测与间接检测。其中，直接检测法依赖于样品中菌含量，对菌阴患者难以确诊；故，针对菌阴肺结核的诊断应以机体分子为标识，但目前已有的间接检测有多方面局限，无法在临床大规模使用。

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）属于胞内寄生菌，体液免疫难以对其发挥作用，抗结核感染的免疫机制是以T细胞为主的细胞免疫。本发明前期发现MTB下调机体免疫识别分子CD1c的表达水平，从而抑制T细胞免疫应答，逃避免疫系统的监视。T细胞识别的抗原包括I/II类MHC分子递呈的抗原肽和CD1分子递呈的脂类抗原，MTB是脂类抗原含量最高的微生物，故CD1在抗结核免疫中的作用尤其重要。CD1是I类MHC样非多态性第三类抗原递呈分子，根据基因同源性分为I、II、III类，其中I类CD1递呈的菌类抗原均来源于以MTB为代表的分枝杆菌，提示其在宿主与病原性分枝杆菌的相互作用中占有重要地位。CD1可激活包括iNKT、γδT和αβT在内的多种T细胞，同时介导早期固有免疫和适应性免疫应答。I类CD1分子包括CD1a、CD1b和CD1c，其中CD1c因其广泛的分布和所递呈抗原的独特性，在抗结核免疫中独树一帜。CD1c在脾脏边缘区B细胞、活化B细胞、以及绝大部分树突状细胞（dendriticcell,DC）DC亚群表面组成性高表达，被认为是介导抗原递呈细胞（antigenpresentingcell,APC）与T细胞相互作用的重要分子。CD1c特异性递呈的MTB抗原为聚酮类脂质抗原mycoketide，仅在致病性分枝杆菌中生成，而在非致病性分枝杆菌中缺失，表明其与细菌毒力密切相关。综上所述，CD1c在抗结核免疫反应中发挥重要作用。然而目前，尚未见以外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）中CD1c表达水平为指标对包括肺结核在内的肺部相关疾病进行诊断的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种菌阴肺结核诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对CD1c的表达量进行定量的试剂。

能够对CD1c的表达量进行定量检测的试剂在制备肺结核诊断试剂盒中的应用。

进一步的，所述肺结核为菌阴肺结核。

进一步的，所述CD1c的表达量为CD1cmRNA的表达量。

本发明的有益效果是：

本发明通过前期的批量筛选，从中筛选获得的CD1c作为菌阴肺结核的诊断标志物，通过检测CD1cmRNA的表达水平，能够有效区分未感染人群与菌阴肺结核患者。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测MTB感染的DC中CD1c的表达水平；

图2为实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者DC中CD1c的表达水平，图中SN-TB表示菌阴肺结核；

图3为菌阴肺结核患者PBMC中CD1c的表达检测结果；A为健康志愿者与菌阴肺结核患者（SN-TB）细胞表面表达CD1c的PBMC的百分比，B为平均荧光强度检测结果；

图4为实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者PBMC中CD1c的表达；

图5为ROC曲线分析。

具体实施方式

本发明发现：①MTB感染DC后导致CD1c表达下调；②菌阴肺结核患者PBMC来源的DC中，CD1c的表达水平与健康志愿者相比显著下调；③对119例菌阴肺结核患者PBMC的检测结果也显示，其CD1c的表达水平显著低于健康志愿者；受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,简称ROC曲线）分析结果表明，CD1c有望成为菌阴肺结核诊断新靶点。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1感染MTB的DC中CD1c的表达下调

分离健康志愿者的PBMC，免疫磁珠分选CD14⁺单核细胞，用GM-CSF和IL-4诱导诱导单核细胞向DC分化，将所得的DC感染MTB。72h后，实时荧光定量PCR检测DC中CD1c的表达水平。

检测结果如图1所示，从中可以看出，MTB感染后的DC的CD1c的表达水平明显降低，说明MTB感染抑制了CD1c的表达。

实施例2菌阴肺结核患者DC中CD1c的表达下调

分离菌阴肺结核患者与健康志愿者的PBMC，免疫磁珠分选CD14⁺单核细胞，用GM-CSF和IL-4诱导单核细胞向DC分化，72h后，实时荧光定量PCR检测CD1c的表达。

检测结果如图2所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者DC中CD1c的表达水平显著低于健康志愿者（P<0.05）。

实施例3菌阴肺结核患者PBMC中CD1c的表达下调

分离119例菌阴肺结核患者与健康志愿者的PBMC，流式细胞术检测细胞表面CD1c的表达。

检测结果如图3所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者细胞表面表达CD1c的PBMC为0.9%，明显低于健康志愿者（9.2%），如图3A所示；平均荧光强度检测结果也显示，菌阴肺结核患者PBMC中CD1c表达的荧光强度显著低于健康志愿者（P<0.001），如图3B所示；说明菌阴肺结核患者PBMC中CD1c的表达水平显著低于健康志愿者。

实施例4实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者PBMC中CD1c的表达情况

提取菌阴肺结核患者与健康志愿者PBMC的RNA，实时荧光定量PCR检测CD1cmRNA的表达。

检测结果如图4所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者PBMC中CD1c表达呈现极显著下调趋势（P<0.001）。

实施例5CD1c作为菌阴肺结核诊断的新靶点

ROC曲线分析结果表明，CD1c可作为菌阴肺结核诊断新靶点（图5，表1）。

本发明前期结果研究发现，与健康人相比，CD1c分子在结核患者PBMC中表达呈现极显著下调趋势（P<0.001）。为了了解CD1c在PBMC的表达变化是否可以用于区分健康人与结核患者，我们使用ROC曲线分析CD1c在PBMC中的表达变化是否用于结核病的诊断。根据CD1c在健康人以及结核患者PBMC中的相对表达量，采用统计分析软件，建立横坐标为1-特异性、纵坐标为灵敏度的ROC曲线。结果显示，ROC曲线下面积AUC（A）=0.9475，说明CD1c用于结核病人诊断具有较高的准确性（图5）。ROC曲线中A值意义说明：在A>0.5的情况下，A越接近于1，说明诊断效果越好。A在0.5～0.7时有较低准确性，在0.7～0.9时有一定准确性，在0.9以上时有较高准确性。

对累积频数分布表（表1）进行分析发现，当CD1c的转录水平Cut-off值（域值）取1.059时，约登指数（Youden’sindx,YI）最大，此时检测灵敏度可以达到86.7%，而特异性达到95.2%。将CD1c用于结核病的诊断是可行的，对于提高结核病的诊断率具有重要意义。

表1ROC曲线分析结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。