三维中的亚衍射极限图像分辨率

摘要

本发明涉及亚衍射极限图像分辨率和其它成像技术，包括三维中的成像。在一个方面，本发明针对的是对来自以小于入射光的衍射极限的距离分开的两个或更多实体的光进行确定和/或成像。例如，实体可以以小于大约1000nm的距离分开，或者以小于用于可见光的大约300nm的距离分开。在一些情况下，可以在全部三个空间维度中(亦即在x、y和z方向上)确定实体的位置，并且在某些情况下，可以将全部三维中的位置确定到小于大约1000nm的精确度。在一组实施例中，实体可以选择性地激活，亦即可以在不激活其它实体的情况下激活一个实体以产生光。第一实体可以被激活并确定(例如通过确定由该实体发射的光)，然后第二实体可以被激活并确定。

说明书

本发明申请是申请日期为2008年12月19日、申请号为 “200880121492.2”、发明名称为“三维中的亚衍射极限图像分辨率”的 发明专利申请的分案申请。

政府资助

导致本发明各个方面的研究至少部分地由国家卫生院赞助。美国政府 拥有本发明中的某些权利。

相关申请

本申请要求Zhuang等人在2007年12月21日申请的名称为 “Sub-DiffractionLimitImageResolutioninThreeDimensions”的序列号 为61/008,661的美国临时专利申请的权益，该专利申请通过引用结合于 此。

技术领域

本发明一般涉及亚衍射极限图像分辨率和其它成像技术，包括三维中 的成像。

背景技术

在用于非侵入性的时间分辨的成像的分子和细胞生物学以及其它应 用中广泛使用了荧光显微术。不管这些优点，由于光的衍射所设置的分辨 率极限，标准的荧光显微术不可用于超微结构成像。已使用了几种方法以 试图越过这种衍射极限，包括近场扫描光学显微术(NSOM)、受激发射 损耗(STED)、可逆可饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFT)以及饱和的 结构化照明显微术(SSIM)，但是每种方法都有某些不令人满意的限制。 电子显微术常常用于生物样品的高分辨率成像，但是电子显微术使用电子 而不是光，并且由于其制备需要而难以与生物样品一起使用。因此，需要 包括非侵入性技术在内的新技术以利用荧光显微术的益处，以便例如对生 物样品和其它样品进行超分辨率成像，以允许与活体生物样品的分子特异 性和/或兼容性。

发明内容

本发明一般涉及亚衍射极限图像分辨率和其它成像技术，包括三维中 的成像。本发明的主题在一些情况下涉及互相关联的产品、对具体问题的 替换解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。

在一个方面，本发明针对的是一种方法。在一组实施例中，该方法包 括以下行动：提供以小于大约1000nm的距离分开的第一实体和第二实 体；确定由所述第一实体发射的光；确定由所述第二实体发射的光；以及 使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所述第 一实体和所述第二实体的x、y和z位置。该方法在另一组实施例中包括 以下行动：提供以分开的距离分开的第一实体和第二实体；确定由所述第 一实体发射的光；确定由所述第二实体发射的光；以及使用由所述第一实 体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所述第一实体和所述第二 实体的x、y和z位置。

根据还有另一组实施例，该方法包括以下行动：提供以小于大约 1000nm的距离分开的第一实体和第二实体；激活所述第一实体但不激活 所述第二实体；确定由所述第一实体发射的光；激活所述第二实体；确定 由所述第二实体发射的光；以及使用由所述第一实体发射的光和由所述第 二实体发射的光来确定所述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。 在还有另一组实施例中，该方法包括以下行动：提供以分开的距离分开的 第一实体和第二实体；激活所述第一实体但不激活所述第二实体；确定由 所述第一实体发射的光；激活所述第二实体；确定由所述第二实体发射的 光；以及使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定 所述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。

在一组实施例中，该方法包括以下行动：提供能够发射光的多个实体 (其中的至少一些以小于大约1000nm的距离分开)；激活所述多个实体 中的一部分以发射光；确定发射的所述光；使所述多个实体中的激活部分 去激活；以及重复激活与去激活所述多个实体的行动，以确定所述多个实 体的x、y和z位置。该方法在还有另一组实施例中包括以下行动：提供 能够发射光的多个实体；激活所述多个实体中的一部分以发射光；确定发 射的所述光；使所述多个实体中的激活部分去激活；以及重复激活与去激 活所述多个实体的行动，以确定所述多个实体的x、y和z位置。

在另一个方面，本发明针对的是一种实现在此描述的实施例中的一个 或多个的方法。在另一个方面，本发明针对的是一种使用在此描述的实施 例中的一个或多个的方法。

从结合附图考虑时的本发明的各种非限制性实施例的以下详细描述 中，本发明的其它优点和新颖特征将会变得明显。在本说明书和通过引用 所结合的文件包括相冲突的和/或不一致的记载的情况下，以本说明书为 准。如果通过引用所结合的两个或更多文件包括彼此相冲突的和/或不一 致的记载，则以具有较新有效日期的文件为准。

附图说明

参考附图作为例子来描述本发明的非限制性实施例，所述附图是示意 性的并且没有打算按比例绘制。在附图中，图示的每个等同或近似等同的 部件通常用单个数字来表示。为了清楚起见，不是在每个附图中都标记了 每个部件，而且在不必要进行图示以允许本领域技术人员理解本发明的地 方，没有示出本发明的每个实施例的每个部件。在附图中：

图1A-1G图示了可用于确定实体在三维中的位置的本发明的一个实 施例；

图2A-2F图示了可用于对细胞进行成像的本发明的另一个实施例；

图3A-3H图示了根据本发明的另一个实施例的细胞的三维成像；

图4A-4D图示了根据本发明的一个实施例的各种珠子的三维成像；

图5A-5C图示了根据本发明的一个实施例的对细胞进行成像的精确 度；以及

图6A-6E图示了可在本发明的某些实施例中使用的各种荧光复合物。

具体实施方式

本发明一般涉及亚衍射极限图像分辨率和其它成像技术，包括三维中 的成像。在一个方面，本发明针对的是对来自以小于入射光的衍射极限的 距离分开的两个或更多实体的光进行确定和/或成像。例如，实体可以以 小于大约1000nm的距离分开，或者以小于用于可见光的大约300nm的 距离分开。在一些情况下，可以在全部三个空间维度中(亦即在x、y和 z方向上)确定实体的位置，并且在某些情况下，可以将全部三维中的位 置确定到小于大约1000nm的精确度。在一组实施例中，实体可以选择性 地激活，亦即可以在不激活其它实体的情况下激活一个实体以产生光。第 一实体可以被激活并确定(例如通过确定由该实体发射的光)，然后第二 实体可以被激活并确定。例如通过确定这些实体的图像的位置，并且在一 些情况下以亚衍射极限分辨率的方式，可以使用发射的光来确定第一和第 二实体的x和y位置。在一些情况下，可以使用多种技术中的一种来确定 z位置，所述技术使用强度信息或聚焦信息(例如缺乏聚焦)来确定z位 置。这样的技术的非限制性例子包括像散成像、失焦成像或多焦平面成像。 本发明的其它方面涉及用于亚衍射极限图像分辨率的系统、用于亚衍射极 限图像分辨率的计算机程序和技术以及用于促进亚衍射极限图像分辨率 的方法等。

本发明的一个方面一般针对的是用于分辨甚至在下述分开距离的两 个或更多实体，所述分开距离小于由实体发射的光的波长或者在发射的光 的衍射极限之下。如在此描述的那样，实体的分辨率例如可以在1微米 (1000nm)或更小的级别上。例如，如果发射的光是可见光，则分辨率 可以小于大约700nm。在一些情况下，两个(或更多)实体即使以小于 大约500nm、小于大约300nm、小于大约200nm、小于大约100nm、小 于大约80nm、小于大约60nm、小于大约50nm或小于大约40nm的距离 分开也可以被分辨。在一些情况下，使用本发明的实施例，可以分辨以小 于大约20nm或小于10nm的距离分开的两个或更多实体。

实体可以是能够发射光的任何实体。例如，实体可以是单个分子。发 射的实体的非限制性例子包括荧光实体(荧光团)或磷光实体，例如花青 染料(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7等)金属毫微粒子、半导体毫 微粒子或“量子点”或者荧光蛋白质如绿荧光蛋白质(GFP)。其它发光 实体易于为本领域技术人员所知。如在此使用的那样，术语“光”一般指 的是具有任何适当波长(或者等价地为频率)的电磁辐射。例如，在一些 实施例中，光可以包括光学或可视范围内的波长(例如具有在大约400nm 和大约1000nm之间的波长，亦即“可见光”)、红外波长(例如具有在大 约300微米和700nm之间的波长)或紫外波长(例如具有在大约400nm 和大约10nm之间的波长)等。在某些情况下，如下面详细讨论的那样， 可以使用多于一个的实体，亦即(例如在结构方面)在化学上不同或各别 的实体。然而，在其它情况下，实体可以在化学上等同或者至少基本上在 化学上等同。

在一些情况下，实体中的一个或多个是“可切换的”，亦即，实体可 以在两个或更多状态之间切换，其中的至少一个发射具有期望波长的光。 在其它(一个或多个)状态下，实体可以不发射光，或者以不同的波长发 射光。例如，实体可以被“激活”到能够产生具有期望波长的光的第一状 态，并且被“去激活”到第二状态。在一些情况下，这些实体中的至少一 个是光可激活的或光可切换的。实体如果可以由适当波长的入射光激活则 是“光可激活的”。实体如果可以通过不同波长的入射光而在不同的光发 射或非发射状态之间切换则是“光可切换的”。典型地，“可切换的”实体 可以由本领域技术人员通过以下来识别：确定第一状态下的实体当暴露于 激发波长时可以发射光的状况；例如当暴露于切换波长的光时将实体从第 一状态切换到第二状态；然后表明该实体在第二状态下时当暴露于激发波 长时不再能够发射光(或者以减少的强度发射光)或者以不同的波长发射 光。可切换实体的例子在下面详细讨论，并且还在2008年7月31日作为 国际专利申请公布第WO2008/091296号公布的名称为“Sub-Diffraction LimitImageResolutionandOtherImagingTechniques”的2007年8月7 日申请的国际专利申请第PCT/US2007/017618号中进行了讨论，该国际 专利申请通过引用结合于此。

在一些方面，光可以被处理以确定两个或更多实体的空间位置。在一 些情况下，分布在图像之内的一个或多个实体的位置每个可以单独确定， 并且在一些情况下，实体的位置可以以3维的方式确定(亦即以x、y和 z维的方式，其中，z维是成像系统的光轴的方向，并且x和y维垂直于 z方向且相互垂直)。在一组实施例中，可以使用高斯拟合或其它适当技 术来处理发射的光，以定位发射实体中的每一个的位置。一种适当的高斯 拟合技术的细节在下面的例子中描述；本领域技术人员将会能够识别具有 本公开所带来的益处的其它适当的图像处理技术。

根据本发明的另一个实施例，随后是图像处理技术的另一个例子。以 一系列的样品图像(例如电影)开始，识别每个光发射峰值(例如通过荧 光、磷光等)，并且确定峰值所在的时间。例如，峰值可以相对于时间以 近似相同的强度存在于一系列图像中。峰值在一些情况下可以拟合到高斯 和/或椭圆高斯函数以确定它们的重心位置、强度、宽度和/或椭圆率。基 于这些参数，在某些情况下可以从进一步的分析中排除太暗、太宽、太斜 等而不能得到令人满意的定位精确度的峰值。还可以丢弃零星、移动、不 连续存在等的峰值。例如将最小二乘拟合用于峰值强度的2维高斯函数， 通过确定峰值的中心位置，可以确定峰值的源(例如在此讨论的能够发射 光的任何一个或多个实体)的位置。当对于样品之内的峰值中的任何一个 或全部而言必要时，可以重复这个过程。

在一组实施例中，可以以小于入射光的衍射极限的分辨率来确定实体 的z位置。例如，对于可见光而言，可以以小于大约800nm、小于大约 500nm、小于大约200nm、小于大约100nm、小于大约50nm、小于大约 20nm或小于大约10nm的分辨率来确定实体的z位置。可以使用能够确 定实体z位置的任何显微技术，例如可以使用像散成像、失焦成像、多焦 平面成像、共焦显微术或双光子显微术等。在一些情况下，实体可以被定 位且成像以使得实体不表现为单个光点，而是表现为具有某个面积的图 像，例如表现为轻微未分辨的或未聚焦的图像。作为例子，实体可以由透 镜或检测器系统成像，所述透镜或检测器系统限定了不包含该实体的一个 或多个聚焦区(例如一个或多个焦平面)，使得实体在检测器处的图像表 现为未聚焦。实体表现为未聚焦的程度可以用来确定实体与聚焦区中之一 之间的距离，这然后可以用来确定实体的z位置。

在一个实施例中，可以使用像散成像来确定z位置。可以使用相对于 实体所发射的光穿过透镜的方向非圆对称的透镜。例如，透镜可以是圆柱 形(如图1A所示)或椭圆形等。在一些情况下，透镜可以在不同的平面 中具有不同的曲率半径。由实体发射的光在穿过包括这种非圆对称透镜的 成像光学系统之后可以在检测器处表现为圆形或椭圆形。

图像的尺寸和椭圆率在一些情况下可以用来确定实体与透镜或检测 器的聚焦区之间的距离，这然后可以用来确定z位置。作为非限制性的例 子，如图1B所示，在焦点上(z＝0nm)的图像表现为圆形，而在焦点外 的图像则日益表现为椭圆形(z＝±200nm或±400nm)，其中椭圆率的方 向指示了实体是在聚焦区之上还是之下。

在另一个实施例中，可以使用失焦成像来确定z位置。未处在由用于 对实体进行成像的透镜或检测器系统所限定的聚焦区之一中的实体可以 表现为未聚焦，并且图像表现为未聚焦的程度可以用来确定实体与透镜的 聚焦区之间的距离，这然后可以用来确定z位置。在一些情况下，未聚焦 实体的图像可以表现为一般圆形(其中面积指示实体与透镜的聚焦区之间 的距离)，并且在一些实例中，未聚焦实体的图像可以表现为一系列环状 结构，其中更多的环指示更大的距离。

在一些实施例中，例如使用多焦平面成像，由实体发射的光可以由多 个检测器收集。在一些情况下，在检测器中的一个或多个处，光可以表现 为未聚焦。图像表现为未聚焦的程度可以用来确定z位置。

在本发明的适当的图像处理技术的另一个非限制性例子中，一系列的 样品图像(例如电影)可以包括激活帧(例如其中激活光接通)和成像帧 (例如其中成像光接通)的重复序列。对于成像帧中的一个或多个而言， 每个帧上的荧光峰值可以被确定，以确定它们的位置、强度、宽度、椭圆 率等。基于这些参数，可以从进一步的分析中排除太暗、太宽、太斜等而 不能得到令人满意的定位精确度的峰值。在一些情况下还可以丢弃零星、 移动、不连续存在等的峰值。通过确定峰值的中心位置、形状和/或尺寸， 可以确定峰值的源(例如在此讨论的能够发射光的任何一个或多个实体) 的位置。在一些情况下，可以以3维的方式确定位置。当对于样品之内的 峰值中的任何一个或全部而言必要时，还可以重复这个过程。

其它图像处理技术也可以用来便利于实体的确定，例如可以使用漂移 校正或噪声滤波器。一般地，在漂移校正中，例如固定点被识别(例如， 作为置信标志器，例如荧光粒子可以固定到基片)，并且固定点的移动(亦 即由于机械漂移)被用来校正可切换实体的确定位置。在用于漂移校正的 另一个例子中，在不同的成像帧或激活帧中获取的图像之间的相关函数可 以被计算并用于漂移校正。在一些实施例中，漂移可以小于大约 1000nm/min、小于大约500nm/min、小于大约300nm/min、小于大约 100nm/min、小于大约50nm/min、小于大约30nm/min、小于大约 20nm/min、小于大约10nm/min或小于大约5nm/min。这样的漂移例如 可以在具有平移台的显微镜中实现，所述平移台被安装用于对样品载玻片 相对于显微镜物镜进行x-y定位。使用适当的约束机构例如弹簧加载夹， 可以使载玻片相对于平移台固定。另外，可以在台子和显微镜载玻片之间 安装缓冲层。例如通过防止载玻片以某种方式滑动，缓冲层可以进一步约 束载玻片相对于平移台漂移。在一个实施例中，缓冲层是橡胶或聚合物膜 例如硅橡胶膜。因此，本发明的一个实施例针对的是一种装置，该装置包 括：平移台；约束机构(例如弹簧加载夹)，其附接到所述平移台，能够 使载玻片固定；以及可选地缓冲层(例如硅橡胶膜)，其定位成使得通过 所述约束机构约束的载玻片接触所述缓冲层。为了使显微镜聚焦在数据获 取期间稳定，在一些情况下可以使用“聚焦锁定”装置。作为非限制性的 例子，为了实现聚焦锁定，可以从保持样品的基片反射激光束，并且可以 将反射的光引导到位置感测检测器例如象限光电二极管上。在一些情况 下，反射的激光的位置(其可以对基片和物镜之间的距离敏感)可以被反 馈到z定位级例如压电级，以便对聚焦漂移进行校正。

在一组实施例中，可以使用可切换的实体。可切换的实体的非限制性 例子在2008年7月31日作为国际专利申请公布第WO2008/091296号公 布的名称为“Sub-DiffractionLimitImageResolutionandOtherImaging Techniques”的2007年8月7日申请的国际专利申请第 PCT/US2007/017618号中进行了讨论，该国际专利申请通过引用结合于 此。作为可切换的实体的非限制性例子，Cy5可以通过不同波长的光以受 控和可逆的方式在荧光和黑暗状态之间切换，例如633nm或657nm的红 光可以将Cy5切换或去激活至稳定的黑暗状态，而532nm的绿光则可以 将Cy5切换或激活返回到荧光状态。可切换的实体的其它非限制性例子 包括光可激活的或光可切换的荧光蛋白质或者光可激活的或光可切换的 无机粒子，如在此讨论的那样。在一些情况下，例如当暴露于适当的刺激 源时，实体可以可逆地在两个或更多状态之间切换。例如，第一刺激源(例 如第一波长的光)可以用来激活可切换的实体，而第二刺激源(例如第二 波长的光)可以用来将可切换的实体例如去激活至非发射的状态。任何适 当的方法都可以用来激活实体。例如，在一个实施例中，适当波长的入射 光可以用来激活实体以发射光，亦即实体是光可切换的。这样一来，光可 切换的实体就可以例如通过不同波长的入射光而在不同的光发射或非发 射状态之间切换。光可以是单色的(例如使用激光产生)或多色的。在另 一个实施例中，实体可以在受到电场和/或磁场刺激时被激活。在其它实 施例中，实体可以在暴露于适当的化学环境时被激活，例如通过调整pH 或者引发涉及实体的可逆化学反应等来激活。类似地，任何适当的方法都 可以用来去激活实体，并且激活和去激活实体的方法不需要相同。例如， 实体可以在暴露于适当波长的入射光时被去激活，或者实体可以通过等待 足够时间来去激活。

在一些实施例中，可切换的实体包括第一光发射部分(例如荧光团) 和对第一部分进行激活或“切换”的第二部分。例如，当暴露于光时，可 切换的实体的第二部分可以激活第一部分，使第一部分发射光。激活器部 分的例子包括但不限于AlexaFluor405(Invitrogen)、Alexa488 (Invitrogen)、Cy2(GEHealthcare)、Cy3(GEHealthcare)、Cy3.5(GE Healthcare)或Cy5(GEHealthcare)或其它适当的染料。光发射部分的例 子包括但不限于Cy5、Cy5.5(GEHealthcare)或Cy7(GEHealthcare)、 AlexaFluor647(Invitrogen)或其它适当的染料。这些可以例如直接地或 者通过链接器例如共价地链接在一起，例如形成复合物，诸如但不限于 Cy5-AlexaFluor405、Cy5-AlexaFluor488、Cy5-Cy2、Cy5-Cy3、 Cy5-Cy3.5、Cy5.5-AlexaFluor405、Cy5.5-AlexaFluor488、Cy5.5-Cy2、 Cy5.5-Cy3、Cy5.5-Cy3.5、Cy7-AlexaFluor405、Cy7-AlexaFluor488、 Cy7-Cy2、Cy7-Cy3、Cy7-Cy3.5或Cy7-Cy5。Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7 的结构示出在图6中，其中Cy3-Cy5的链接版本的非限制性例子示出在 图6E中；本领域技术人员将会明白这些以及其它复合物的结构，其中的 许多种都是商业上可得的。

任何适当的方法都可以用来链接第一光发射部分和第二激活部分。在 一些情况下，链接器可以被选择成使得第一和第二部分之间的距离足够 近，以允许例如无论何时光发射部分已以某种方式被去激活，激活器部分 都可以如期望的那样激活光发射部分。典型地，这些部分将会以500nm 或以下的数量级的距离被分开，例如小于大约300nm、小于大约100nm、 小于大约50nm、小于大约20nm、小于大约10nm、小于大约5nm、小于 大约2nm、小于大约1nm等。链接器的例子包括但不限于碳链(例如链 烷或链烯)或聚合物单元等。

在某些情况下，光发射部分和激活器部分在彼此隔离时每个都可以是 荧光团，亦即当暴露于刺激源例如激发波长时可以发射某种发射波长的光 的实体。然而，当可切换的实体被形成为包括第一荧光团和第二荧光团时， 第一荧光团形成第一光发射部分，并且第二荧光团形成激活器部分，该激 活器部分响应于刺激源而对第一部分进行激活或“切换”。例如，可切换 的实体可以包括直接键合到第二荧光团的第一荧光团，或者第一和第二实 体可以经由链接器或公共实体连接。可以通过对于本领域技术人员而言众 所周知的方法来测试一对光发射部分和激活器部分是否产生了适当的可 切换的实体。例如，各种波长的光可以用来刺激这一对，并且可以测量来 自光发射部分的发射光以确定这一对是否进行了适当的切换。

因此，在本发明的一个实施例中，提供了一种光发射可切换的实体， 该实体包括第一光发射部分和第二激活部分。该实体具有由第一光发射部 分确定的最大发射波长和由第二激活部分确定的最大激活波长。值得注意 地，这两个波长不是由同一分子实体控制，并且被有效地去耦。在一些情 况下，同一波长的光既可以用于将发射部分激活到荧光状态，又可以用于 从发射部分激发发射并去激活发射部分。进一步，可以独立地确定样品之 内的多种类型的可切换的实体。例如，具有相同激活器部分但是不同光发 射部分的两种可切换的实体可以由施加到样品的同一波长的光激活，但是 由于不同的光发射部分而以不同的波长发射，并且即使处在小于亚衍射极 限分辨率的分开距离也可以容易地区别。这可以有效地在图像中得到两种 颜色。类似地，具有相同光发射部分但是不同激活器部分的两种可切换的 实体由于不同的激活器部分而可以由施加到样品的不同波长的光激活，并 且光发射部分可以以相同的波长发射，而且这样一来即使处在小于亚衍射 极限分辨率的分开距离也可以进行区分。这也可以有效地在图像中得到两 种颜色。当这些方法进行结合时，可以容易地产生四种(或更多)颜色的 图像。使用这个原理，取决于可切换的和/或激活器实体，多种颜色成像 可以攀升至6种颜色、9种颜色等。这个多种颜色成像的原理还可以与在 此描述的成像方法一起使用以得到亚衍射极限分辨率(在一些情况下是在 全部三维中)，并且/或者用来使用不限于亚衍射极限分辨率的其它成像方 法来获得多种颜色的图像。

在一些实施例中，如上所述的第一光发射部分和第二激活部分可以不 直接共价键合或经由链接器链接，而是相对于公共实体每个固定不动。在 其它实施例中，在本发明的一些方面，可切换的实体(其中的一些在某些 情况下可以包括直接链接在一起或者通过链接器链接在一起的第一光发 射部分和第二激活部分)中的两个或更多可以相对于公共实体固定不动。 这些实施例中的任何一个中的公共实体可以是任何的非生物实体或生物 实体例如细胞、组织、基片、表面、聚合物、生物分子如核酸(DNA、 RNA、PNA或LNA等)、脂质分子、蛋白质或多肽或类似物、生物分子 配合物或生物结构例如细胞器、微管、内涵蛋白涂敷的凹陷等。

在一组实施例中，可切换的实体可以相对于绑定伙伴(亦即可以经历 与特定分析物绑定的分子)例如共价地固定不动。绑定伙伴包括如本领域 技术人员所知的专用、半专用或非专用的绑定伙伴。术语“特定绑定”当 指称绑定伙伴(例如蛋白质、核酸、抗体等)时指的是下述反应，该反应 确定了异质分子(例如蛋白质和其它生物制品)混合物中的绑定对中的一 个或另一个成员存在与否和/或其身份。这样一来，例如，在受体/配体绑 定对的情况下，配体会特定地和/或优选地从分子的复杂混合物中选择它 的受体，反之亦然。其它例子包括但不限于：酶会特定地绑定到它的基片； 核酸会特定地绑定到它的补体；以及抗体会特定地绑定到它的抗原。绑定 可以通过多种机制中的一种或多种而包括但不限于离子相互作用和/或共 价相互作用和/或疏水性相互作用和/或范德瓦尔斯相互作用等。通过使可 切换的实体相对于目标分子或结构(例如细胞之内的蛋白质或DNA)的 绑定伙伴固定不动，可切换的实体可以用于各种确定或成像目的。例如， 具有胺反应基的可切换的实体可以与包括胺例如抗体、蛋白质或酶的绑定 伙伴起反应。

在一些实施例中，可以使用多于一种的可切换的实体，并且实体可以 相同或不同。在一些情况下，由第一实体发射的光和由第二实体发射的光 具有相同波长。实体可以在不同的时间激活，并且可以分开确定来自每个 实体的光。这允许两个实体的位置被分开确定，并且在一些情况下，如下 面详细讨论的那样，甚至可以以小于由实体发射的光的波长的分开距离或 者在发射的光的衍射极限之下的分开距离(亦即“亚衍射极限”分辨率) 来对两个实体进行空间分辨。在某些实例中，由第一实体发射的光和由第 二实体发射的光具有不同的波长(例如，如果第一实体和第二实体在化学 上不同，并且/或者位于不同的环境下)。即使处在小于由实体发射的光的 波长的分开距离或者在发射的光的衍射极限之下的分开距离，也可以对实 体进行空间分辨。在某些实例中，由第一实体发射的光和由第二实体发射 的光具有基本上相同的波长，但这两个实体可以由不同波长的光激活，并 且可以分开确定来自每个实体的光。即使处在小于由实体发射的光的波长 的分开距离或者在发射的光的衍射极限之下的分开距离，也可以对实体进 行空间分辨。

在一些情况下，实体可以独立地可切换，亦即，可以在不激活第二实 体的情况下激活第一实体以发射光。例如，如果实体不同，则对第一和第 二实体中的每一个进行激活的方法可以不同(例如，实体每个可以使用不 同波长的入射光来进行激活)。作为另一个非限制性的例子，如果实体基 本上相同，则可以将足够弱的强度施加到实体，以使得只有入射光之内的 实体的子集或一部分被激活(亦即在随机的基础上)。本领域技术人员仅 使用常规技巧就可以确定用于激活的特定强度。通过适当选择入射光的强 度，可以在不激活第二实体的情况下激活第一实体。作为另一个非限制性 的例子，将要成像的样品可以包括多个实体，其中的一些基本上等同而其 中的一些基本上不同。在这种情况下，可以将上述方法中的一种或多种应 用于对实体进行独立切换。

由实体中的每一个发射的光例如可以被确定为图像或矩阵。例如，第 一实体可以被激活且由第一实体发射的光被确定，并且第二实体可以被激 活(在去激活或者不去激活第一实体的情况下)且由第二实体发射的光可 以被确定。由多个实体中的每一个发射的光可以处在相同或不同的波长。 任何适当的方法都可以用来确定发射的光。例如，光的检测器例如可以是 摄影机如CCD摄影机、光电二极管、光电二极管阵列、光电倍增器、光 电倍增器阵列或分光计等；本领域技术人员会知道其它适当的技术。在一 些情况下，可以使用多于一个的检测器，并且检测器每个可以独立地相同 或不同。在一些情况下，例如可以使用多个图像(或其它确定)以提高分 辨率和/或减少噪声。例如，取决于应用，可以确定至少两个、至少5个、 至少10个、至少20个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100 个等图像。

在一些情况下，可以将具有足够弱的强度的入射光施加到多个实体， 以使得例如在随机的基础上只有入射光之内的实体的子集或一部分被激 活。激活的量可以是任何适当的一部分，例如取决于应用，大约0.1％、 大约0.3％、大约0.5％、大约1％、大约3％、大约5％、大约10％、大 约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大 约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大 约75％、大约80％、大约85％、大约90％或大约95％的实体可以被激 活。例如，通过适当选择入射光的强度，实体的稀疏子集可以被激活，以 使得它们中的至少一些彼此在光学上可分辨，并且它们的位置可以被确 定。在一些实施例中，通过施加持续时间短的入射光，可以使实体子集激 活同步化。重复激活循环可以允许实体中的全部的位置或者实体的基本部 分的位置被确定。在一些情况下，可以使用这个信息来构造具有亚衍射极 限分辨率的图像。

样品上的多个位置每个都可以被分析以确定那些位置之内的实体。例 如，样品可能包含多个不同实体，其中的一些处在小于由实体发射的光的 波长的分开距离或者在发射的光的衍射极限之下的分开距离。样品之内的 不同位置可以被确定(例如作为图像之内的不同像素)，并且那些位置中 的每一个被独立地分析以确定那些位置之内存在的一个或多个实体。在一 些情况下，如前面讨论的那样，每个位置之内的实体可以被确定至小于由 实体发射的光的波长或者在发射的光的衍射极限之下的分辨率。

在本发明的一些实施例中，还可以作为时间的函数来对实体进行分 辨。例如，可以在各个时间点观察两个或更多实体以确定时变过程例如化 学反应、细胞行为、蛋白质或酶的绑定等。这样一来，在一个实施例中， 就可以在第一时间点(例如在此描述的那样)以及在任何数目的随后时间 点确定两个或更多实体的位置。作为特定的例子，如果两个或更多实体相 对于公共实体被固定不动，那么公共实体就可以被确定作为时间的函数， 例如时变过程如公共实体的移动、公共实体的结构和/或配置变化或者涉 及公共实体的反应等。由于可切换的实体可以针对多个循环被切换，每个 循环给出实体位置的一个数据点，所以在一些情况下时间分辨的成像可能 是便利的。

本发明的另一个方面针对的是计算机实施的方法。例如，可以提供计 算机和/或自动化系统，其能够自动地和/或重复地执行在此描述的方法中 的任何一种。如在此使用的那样，“自动化”装置指的是能够在无人指引 的情况下进行操作的装置，亦即，例如通过将指令输入到计算机中，在任 何人已完成采取任何行动以对功能进行促进之后的时间段期间，自动化装 置可以执行该功能。典型地，自动化设备在这个时间点之后可以执行重复 的功能。在一些情况下处理步骤也可以记录到机器可读的介质上。

本发明的还有另一个方面一般针对的是能够执行在此描述的实施例 中的一个或多个的系统。例如，该系统可以包括：显微镜；用于对实体进 行激活和/或切换以产生具有期望波长的光(例如激光或其它光源)的装 置；用于确定由实体发射的光的装置(例如摄影机，其可以包括颜色过滤 装置如滤光器)；以及计算机，用于确定两个或更多实体的空间位置。在 一些情况下，反射镜(诸如二向色镜或多向色镜)、棱镜、透镜或衍射光 栅等可以被定位以引导来自光源的光。在一些情况下，光源可以是时间调 制的(例如通过快门或声光调制器等)。这样一来，光源就可以是以编程 或周期的方式可激活和可去激活的光源。在一个实施例中，例如可以使用 多于一个的光源，其可以用来以不同的波长或颜色照射样品。例如，光源 可以以不同的频率发出光，并且/或者颜色过滤装置如滤光器等可以用来 修改来自光源的光，使得不同的波长或颜色照射样品。

在一些实施例中，显微镜可以配置成收集由可切换的实体发射的光， 同时使来自其它荧光源的光(例如“背景噪声”)最小化。在某些情况下， 成像几何形状诸如但不限于全内反射几何形状、旋转盘共焦几何形状、扫 描共焦几何形状、落射荧光几何形状等可以用于样品激发。在一些实施例 中，将样品的薄层或平面暴露于激发光，这可以减少样品平面之外的荧光 的激发。高数值孔径的透镜可以用来收集由样品发射的光。例如可以使用 过滤器来对光进行处理以去除激发光，得到对来自样品的发射光的收集。 在一些情况下，例如当图像的每个像素的边缘长度对应于图像中的衍射极 限斑点的标准偏差的长度时，可以优化收集图像的放大倍数。

在一些情况下，计算机可以用来控制可切换的实体的激发以及可切换 的实体的图像获取。在一组实施例中，可以使用具有各种波长和/或强度 的光来激发样品，并且可以使用计算机将用于激发样品的光的波长的序列 与包含可切换的实体的样品的获取图像相关联。例如，计算机可以将具有 各种波长和/或强度的光施加到样品，以得到所关心的每个区域中的不同 平均数的被激活的可切换要素(例如每个位置一个被激活的实体、每个位 置两个被激活的实体等)。在一些情况下，如上面提到的那样，这个信息 可以用于在一些情况下以亚衍射极限分辨率来构造可切换的实体的图像。

在本发明的其它方面，在此描述的系统和方法还可以与本领域技术人 员所知的其它成像技术相结合，比如高分辨率荧光原位混合(FISH)或 免疫荧光成像、活体细胞成像、共焦成像、落射荧光成像、全内反射荧光 成像等。

以下文件通过引用结合于此：在2008年7月31日作为美国专利申请 公布第2008/0182336号公布的名称为“Sub-DiffractionImageResolution andOtherImagingTechniques”的2008年2月1日申请的美国专利申请 序列第12/012,524号；在2008年7月31日作为国际专利申请公布第 WO2008/091296号公布的名称为“Sub-DiffractionLimitImage ResolutionandOtherImagingTechniques”的2007年8月7日申请的国 际专利申请第PCT/US2007/017618号；在2008年2月7日作为美国专利 申请公布第2008/0032414号公布的名称为“Sub-DiffractionImage ResolutionandOtherImagingTechniques”的2006年11月29日申请的 美国专利申请序列第11/605,842号；名称为“Sub-DiffractionImage Resolution”的2006年8月7日申请的美国临时专利申请序列第60/836,167 号；名称为“Sub-DiffractionImageResolution”的2006年8月8日申请 的美国临时专利申请序列第60/836,170号；以及名称为“Sub-Diffraction LimitImageResolutioninThreeDimensions”的2007年12月21日申请 的美国临时专利申请序列第61/008,661号。

以下例子旨在示意本发明的某些实施例，而不是示范本发明的全部范 围。

例子1

这个例子展示了在不发动样品或光束扫描的情况下具有在全部三维 中都比衍射极限好大约10倍的空间分辨率的3维成像。在通过引用结合 于此的2008年7月31日作为国际专利申请公布第WO2008/091296号公 布的名称为“Sub-DiffractionLimitImageResolutionandOtherImaging Techniques”的2007年8月7日申请的国际专利申请第PCT/US2007/ 017618号中，某些荧光团的光可切换性质被用来分开众多分子的空间重 叠的图像，并且在针对单独荧光染料的横向维度中实现了高程度的定位。

然而，这个例子以及随后的例子示意了通过以下进行的全部三维中的 成像：对光可切换探测剂的光学可分辨子集进行随机激活；以高精确度确 定每个探测剂的坐标；以及通过多重激活循环来构造三维高分辨率图像。 在一些情况下，当粒子(或其它适当对象)的横向位置可以根据其图像的 重心来确定时，图像的形状也可以包含关于粒子的轴向或z位置的信息。

这个例子使用像散成像来实现三维成像，然而在其它情况下可以使用 包括但不限于失焦成像和多焦平面成像等的其它技术。为此目的，弱圆柱 形透镜被引入到成像路径中，以产生用于x和y方向的两个略微不同的焦 平面(图1A)。这个附图示出了单独荧光团的三维定位。简化的光学示图 图示了通过将圆柱形透镜引入到成像路径中根据其图像的椭圆率来确定 荧光对象的z坐标的原理。右边的面板示出了处在各种z位置的荧光团的 图像。

结果，荧光团的图像的椭圆率和取向随着它在z方面的位置变化而改 变：当荧光团处在平均焦平面(近似在x和y焦平面之间的半途，其中点 扩散函数(PSF)在x和y方向上具有基本上相等的宽度)中时，图像表 现为圆形；当荧光团处在平均焦平面之上时，它的图像与在x方向上相比 更加聚焦在y方向上，并从而表现为其长轴沿着x的椭圆形；相反地，当 荧光团处在焦平面之下时，图像表现为其长轴沿着y的椭圆形。通过将图 像与二维椭圆高斯函数拟合，可以获得峰值位置的x和y坐标以及峰值宽 度w_x和w_y，它们又允许荧光团的z坐标被确定。

为了在实验上生成作为z的函数的w_x和w_y的校准曲线，Alexa647 标记的抗生蛋白链菌素分子被固定在玻璃表面上，并且单独的分子被成像 以确定当样品在z上扫描时的w_x和w_y的值(图1C)。图1C是在这个例 子中从单个Alexa647分子获得的作为z的函数的图像宽度w_x和w_y的校 准曲线。每个数据点代表从6个分子获得的平均值。如下所述，数据被拟 合到散焦函数(红色曲线)。

在这个图像分析中，每个光激活的荧光团的z坐标通过将测量的其图 像的wx和wy值与校准曲线相比较来确定。另外，对于浸入玻璃基片上的 水溶液中的样品，所有的x定位都以0.79的因数重新定标，以计入玻璃 和水之间的折射率失配(另外的细节可参见下文)。

在一些情况下，这个例子中的技术的三维分辨率由下述精确度限制， 使用所述精确度，可以在切换循环期间在全部三维中定位单独的光可切换 的荧光团。通过引用结合于此的2008年7月31日作为国际专利申请公布 第WO2008/091296号公布的名称为“Sub-DiffractionLimitImage ResolutionandOtherImagingTechniques”的2007年8月7日申请的国 际专利申请第PCT/US2007/017618号公开了一族光可切换的花青染料 (Cy5、Cy5.5、Cy7和AlexaFluor647)，它们可以通过不同波长的光在 荧光和黑暗状态之间可逆地循环。这些光可切换的“指示器”的再激活效 率关键取决于“激活器”染料的接近程度，所述“激活器”染料可以是多 种染料分子(例如Cy3、Cy2、AlexaFluor405)中的任何一种。在这个 具体的例子中，Cy3和Alexa647用作激活器和指示器对以执行成像。红 色激光(657nm)被用来对Alexa647分子进行成像并将它们去激活至黑 暗状态，而绿色激光(532nm)则被用来再激活荧光团。在持久光致退色 发生之前，每个激活器-指示器对可以循环接通和断开成百次，并且使用 物镜类型的全内反射荧光(TIRF)或落射荧光成像几何形状在每个切换 循环检测平均6000个光子。这个可逆的切换行为提供了内部控制以测量 定位精确度。

在一些实验中，成双地标记有Cy3和Alexa647的抗生蛋白链菌素分 子被固定在玻璃表面上。然后将分子切换接通和断开多个循环，并且针对 每个切换循环确定它们的x、y和z坐标。这个过程导致针对每个分子的 一簇定位(图1D)。在这个附图中，每个分子由于同一分子的重复激活而 给出了一簇定位。来自145簇的定位与它们的质心对准，以生成定位分布 的总体3D表达(左边的面板)。x、y和z中的分布的直方图(右边的面 板)被拟合到高斯函数，得到x中9nm、y中11nm和z中22nm的标准 偏差。定位分布的标准偏差(SD：x中9nm、y中11nm和z中22nm) 或半高宽(FWHM：x中21nm、y中26nm和z中52nm)提供了3维中 的定位精确度的定量测量(图1E-1G)。两个横向维度中的定位精确度类 似于以前在没有圆柱形透镜的情况下获得的分辨率。z中的定位精确度在 这些实验中近似两倍于x和y中的定位精确度。因为图像宽度随着荧光团 从焦平面移开而增加，所以定位精确度随着z值增加而下降，尤其是在横 向维度上。这样一来，在一些实验中，就选择了焦平面附近大约600nm 的z成像深度，在这个z成像深度之内，与在平均焦平面处获得的值相比， 横向和轴向定位精确度变化分别小于1.6倍和1.3倍。然而，例如通过在 将来的实验中使用z扫描，可以增加成像深度。

作为初始测试，对模型珠子样品进行成像。模型珠子样品通过以下来 制备：将200nm的生物素化聚苯乙烯珠子固定在玻璃表面上，然后用Cy3- Alexa647标记的抗生蛋白链菌素对样品进行培育，以便用光可切换的探 测剂涂敷珠子。通过对光学可分辨的Alexa647分子的稀疏子集进行重复 的随机激活来获得珠子的三维图像，以便允许单独分子的x、y和z坐标 被确定。在多个激活循环期间，众多荧光团的位置被确定并被用来构造全 三维图像。当沿着全部三个方向观看时，珠子图像的投影表现为近似球形， 其中分别在x、y和z中具有210±16、225±25和228±25nm的平均直 径(图4)，这指示了全部三维中的精确定位。因为每个荧光团的图像同 时对其x、y和z坐标进行编码，所以与三维成像相比，不需要额外的时 间在三维中定位每个分子。

图4示出了用Cy3-Alexa647标记的抗生蛋白链菌素涂敷的200nm直 径的珠子的三维图像。图4A示出了玻璃表面上的1.7微米(x)×10微 米(y)的面积之内的两个珠子的x-z投影。表面由珠子下面的定位线限 定，该定位线源自于非特定地吸附于玻璃表面的抗生蛋白链菌素分子。尽 管非特定吸附的抗生蛋白链菌素只是稀疏地分布在表面上，但是大面积的 投影导致几乎连续的定位线。图4A中的插图示出了包围右边珠子的小体 积(400nm×400nm×400nm)的x-z投影，其中存在几个非特定吸附 的抗生蛋白链菌素分子。图4B和4C示出了两个珠子的x-y投影。从圆 形形状的轻微偏差可能部分是由于不完全的抗生蛋白链菌素涂敷和/或固 有不理想的珠子形状。

图4D图示了珠子直径在x、y和z方向上的分布。为了以非主观的 方式确定直径，抗生蛋白链菌素分子假定均匀地涂敷在珠子表面上。这样 的球形表面上的3D均匀分布当投影到x、y和z轴中的任何一个上时都 应当遵循1D均匀分布。x、y或z方向上的1D分布的宽度提供了珠子分 别沿着x、y或z轴的直径的测量。另外，在一些情况下可以使用宽度(d) 和均匀分布的标准偏差(SD_uniform)之间的数学关系，亦即 以及考虑有限定位精确度(SD_localization)的测量的标准偏差SD_measure和真正 均匀分布的SD_uniform之间的关系，亦即从如图1E- 1F所示的独立测量的定位精确度以及3D珠子图像在x、y和z方向上的 投影分布的SD_measure中，沿着x、y和z轴推导出珠子的直径(d)。这里 示出了53个测量的珠子的直径分布，并且平均直径在x、y和z方向上分 别为210±16nm、226±25nm和228±25nm。测量的直径在数量上类似 于制造商对珠子的建议直径(200nm)。略微的增加可能部分是由于抗生 蛋白链菌素涂敷的有限厚度。

作为另一个例子来描述细胞成像。在这个例子中，对青猴肾上皮 (BS-C-1)细胞中的微管网络执行间接免疫荧光成像。细胞用原发抗体进 行免疫染色，然后用Cy3和Alexa647成双地标记的次级抗体进行免疫染 色。获得的三维图像不仅示出了与传统广视野荧光图像相比在分辨率方面 的显著提高(图2A-2B)，而且还提供了在传统图像(图2A)中不可得的 z维度信息(图2B)。图2A是BS-C-1细胞的大区域中的微管的传统间接 免疫荧光图像；图2B是使用在此描述的技术进行成像并根据z位置信息 进行阴影化的同一区域。多层微管细丝在细胞的x-y、x-z或y-z横截面中 清晰可见(图2C-2E)。这个区域是由图2B中的白框列举的区域，示出 了5个微管细丝。

为了更加定量地表征细胞成像分辨率，在细胞中识别点状对象，其表 现为远离任何可辨别微管细丝的小簇定位。这些簇可能表示非特定地附接 到细胞的单独抗体。在整个测量的细胞的z范围之上随机选择的这些簇的 FWHM为x中22nm、y中28nm和z中55nm(图5)，数量上类似于针 对固定到玻璃表面上的单独分子确定的那些(将图5与图1E-3G相比较)。 在z中以102nm分开的两个微管细丝在三维图像中表现为很好地分开(图 2F)，这表明了在x-y投影中交叉的两个微管的z轮廓。这个直方图示出 了定位的z坐标的分布，其拟合到具有相等宽度的双高斯(曲线)。微管 细丝在z维度中的视在宽度为66nm，略微大于z中的固有成像分辨率， 并且在数量上符合成像分辨率与独立测量的抗体涂敷的微管的宽度的卷 积(图2F)。因为通过固有成像分辨率和标记(诸如抗体)尺寸的组合来 确定有效分辨率，所以分辨率方面的提高可以通过以下来实现：使用直接 而不是间接免疫荧光来去除一层抗体标记，如下一个例子中示出的那样， 或者使用Fab片段或遗传编码肽标签来替换抗体。

在图5中，根据细胞中的点状对象来确定定位精确度，所述点状对象 表现为远离任何可辨别微管细丝的小簇定位。这里示出的是x、y和z维 度中的这些点状簇之内的定位的空间分布。通过用它们的质心对准202 个簇来生成定位的直方图，其中每个簇包含不小于8个定位。用高斯函数 拟合直方图给出分别在x、y和z方向上的9nm、12nm和23nm的标准偏 差。相应的FWHM值为22nm、28nm和55nm。

最后，为了展示细胞中的纳米级结构的三维形态可以被分辨，在BS-C -1细胞中对内涵蛋白涂敷的凹陷(CCP)进行成像。CCP是从细胞膜的 细胞质侧的内涵蛋白、衔接蛋白和其它辅助因子装配的用于便利于胞吞作 用的150nm至200nm的球形笼状结构。为了对CCP进行成像，使用了 直接免疫荧光方案，其使用Cy3和Alexa647成双地标记的次级抗体用于 内涵蛋白。当通过传统荧光显微术进行成像时，所有的CCP都表现为没 有可辨别结构的近似衍射极限的斑点(图3A，其为BS-C-1细胞的区域的 传统直接免疫荧光图像)。在其中z维信息被丢弃的使用在此描述的技术 的二维图像中，CCP的圆形形状可观察(图3B和3D)。根据2D投影图 像测量的CCP的尺寸分布180±40nm在数量上符合使用电子显微术确定 的尺寸分布。包括z维信息允许凹陷的3D结构的可视化(图3C和3E-3H)。 图3C和3E示出了从细胞表面处的凹陷的开口附近区域获取的图像的x-y 横截面。图3C是与如图3A-3B所示相同区域的50nm厚的x-y横截面， 示出了原生质膜处的CCP的开口的环状结构，而图3E则是两个附近CCP 的100nm厚的x-y横截面的放大图。

凹陷外围的圆形环状结构被毫无疑义地分辨。凹陷的连续x-y和x-z 横截面(图3F-3H)揭示了在二维图像中不可观察的这些纳米级结构的三 维半球形笼状形态。这些附图示出了CCP的x-y横截面(每个在z中为 50nm厚)(图3F)和系列x-z横截面(每个在y中为50nm厚)(图3G)， 并且在3D透视图(图3H)中表示的x-y和x-z横截面示出了凹陷的半球 形笼状结构。

总而言之，这些例子图示了具有100nm或以下数量级的分辨率的三 维高分辨率成像。细胞结构的纳米级特征以下述分辨率被分辨，所述分辨 率以前只有用电子显微术才能观看，而现在用光学就能看到环境条件下的 分子特异性。这种改进可以显著增强使细胞中的分子组织和相互作用网络 可视化的能力。

例子2

这个例子描述了相对于例子1可用的某些技术。为了表征例子1的光 可切换探测剂的3D定位精确度，通过遵循来自制造商的建议协议用胺基 反应性染料培育蛋白质，用光可切换的Alexa647荧光团(Invitrogen)和激 活器染料Cy3(GEHealthcare)来标记抗生蛋白链菌素分子(Invitrogen)。 使用Nap-5列(GEHealthcare)通过凝胶过滤去除未反应的染料分子。 标记比率通过UV-Vis分光光度计来表征，并且吸收光谱指示了每个抗生 蛋白链菌素分子～2Cy3和～0.1Alexa647的标记比率。标记的抗生蛋白链 菌素然后被固定到从载玻片和#1.5盖玻片装配的玻璃流动室的表面上。载 玻片和盖玻片通过以下清洗：在1M氢氧化钾中超声处理15分钟，继之 以用超纯(MilliQ)水大规模清洗并用压缩的氮气干燥。标记的抗生蛋白链 菌素样品被注入到流动室中，以允许抗生蛋白链菌素非特定地直接吸附在 表面上，或者通过生物素化牛血清清蛋白(BSA)涂敷的表面上的生物素- 抗生蛋白链接来吸附在表面上。为了生成用于z定位测量的校准曲线，还 使用了Alexa647标记的抗生蛋白链菌素或量子点(蛋白质A涂敷的Qdot 655，Invitrogen)。单一标记的抗生蛋白链菌素以与Cy3和Alexa647成 双地标记的抗生蛋白链菌素类似的方式固定到室表面，并且量子点通过非 特定的绑定直接固定到表面。

为了使200nm的聚苯乙烯珠子用光可切换的荧光团涂敷，盖玻片表 面首先如上所述通过使0.25mg/mL的未标记的抗生蛋白链菌素溶液流入 到流动室中而涂敷以抗生蛋白链菌素，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗。 下一步，200nm直径的生物素化聚苯乙烯珠子(Invitrogen)被添加到室以 允许在表面上固定不动。最后使3微克/mL的Cy3和Alexa647成双地标 记的抗生蛋白链菌素流入以涂敷生物素化的珠子的表面。在这个过程期 间，某种荧光抗生蛋白链菌素也非特定地吸附到盖玻片表面上。流动室然 后用PBS漂洗以去除溶液中的自由抗生蛋白链菌素分子。

BS-C-1细胞以每阱40k个细胞的密度覆盖在8阱隔室的盖玻片 (LabTek-II,NalgeneNunc)中。在16至24个小时之后，细胞使用PBS 中的3％的多聚甲醛和0.1％的戊二醛固定10分钟，然后用0.1％的氢硼 化钠处理7分钟以减少未反应的醛基和在固定期间形成的荧光产物。紧接 着在使用之前来制备氢硼化钠溶液以避免水解。固定的样品然后用PBS 清洗三次，并且在封闭缓冲液(PBS中的3％w/v的BSA、0.5％v/v的 TritonX-100)中渗透化处理15分钟。

微管用老鼠单细胞系β微管蛋白抗体(ATN01,Cytoskeleton)着色 30分钟，然后用山羊抗老鼠次级抗体着色30分钟。次级抗体标记有胺基 反应性Alexa647和Cy3，并且标记的化学计算法被表征至平均每抗体～4.0 Cy3和～0.4Alexa647。在每个着色步骤之后都执行使用PBS中的0.2％ w/v的BSA和0.1％v/v的TritonX-100进行的三个清洗步骤。

为了通过直接免疫荧光对内涵蛋白进行着色，同时使用了老鼠单细胞 系抗内涵蛋白重链(cloneX22,ab2731,Abcam)和抗内涵蛋白轻链(clone CON.1,C1985,Sigma-Aldrich)。两种抗体都用每抗体～1.0Cy3和～1.0 Alexa647来标记。样品着色30分钟，用PBS清洗三次，并立即使用以 便进行成像。

应当注意的是，免疫荧光成像可以在宽范围的染料标记比率下很好地 工作。通常每抗体不小于1个激活器(在这种情况下为Cy3)的标记比率 被选择以确保大多数的抗体都具有激活器。另一方面，当多于一个的光可 切换指示器(在这种情况下为Alexa647)附接到同一抗体上的附近范围 之内的氨基酸残基时，指示器-指示器相互作用在一些情况下可以导致显 著降低的切换断开速率。以前的特性已指出，两个分开2nm的指示器的 断开速率～5倍慢于单个指示器的断开速率，而两个分开7nm的指示器则 具有可与孤立指示器的断开速率相比较的断开速率。因此，对于指示器选 择不大于1的染料/蛋白质比率，以使这种效应最小化。

样品中的缓冲溶液紧接着在数据获取之前用成像缓冲液替换。成像缓 冲液包含50mM的Tris、pH为7.5、10mM的NaCl、0.5mg/mL的葡萄 糖氧化酶(G2133，Sigma-Aldrich)、40微克/mL的过氧化氢酶(106810, RocheAppliedScience)、10％(w/v)的葡萄糖和1％(v/v)的β-巯基乙醇。 已发现β-巯基乙醇(或其它含硫醇的试剂如巯基丙氨酸)对于花青染料 的光切换而言是重要的。成像也可以在较低的β-巯基乙醇浓度(例如 0.1％v/v)下进行，这与活体细胞成像兼容。在这个工作中，上述所有成 像实验都是针对固定细胞进行的。

在例子1中描述的所有成像实验都在倒置光学显微镜(Olympus IX-71)上进行。两个固态激光器用作激发源：657nm的激光器 (RCL-200-656,Crystalaser)，用于激发光可切换的指示器荧光团(Alexa 647)并将其切换至黑暗状态；以及532nm的激光器(GCL-200-L, Crystalaser)，用于以Cy3便利化的方式再激活Alexa647。这两个激光束 被组合并耦合到光纤(P3-630A-FC-5,Thorlabs)中。光纤输出通过显微镜 的后端口被校准并聚焦到高数值孔径油浸物镜(100xUPlanSApo,NA1.4, Olympus)的后焦平面上。平移台允许两个激光器朝向物镜的边缘转移， 以便从物镜出现的光以接近但不超过玻璃-水界面的临界角的高入射角到 达样品。这个激发方案允许来自表面的几个微米之内的荧光团被激发，并 且减少了来自溶液的背景荧光。荧光发射由同一物镜收集并由多色镜 (z458/514/647rpc,Chroma)、带通滤波器(HQ710/70m,Chroma)和长通滤 波器(HQ665LP,Chroma)过滤。过滤的发射然后通过具有插在其中的弱圆 柱形透镜(1m焦距)的一对中继透镜成像到EMCCD摄影机(Ixon DV897DCS-BV,Andor)上。

为了使显微镜聚焦在数据获取期间稳定，通过显微镜的后端口处的反 射棱镜将从玻璃-水界面反射的红激发激光引导到象限光电二极管上。象 限光电二极管读取反射激光的位置，该位置对盖玻片表面与物镜之间的距 离敏感。然后通过软件将这个信息反馈到z定位压电级(NanoView-M, MadCityLabs)，以对显微镜聚焦中的z漂移进行校正。这个“聚焦锁定” 系统能够在STORM数据获取期间将聚焦位置维持在40nm之内。如下所 述，在数据分析期间对z中的剩余漂移进行校正。

在数据获取期间，相对强的成像/去激活激光(在657nm的～40mW) 和相对弱的激活激光(在532nm的小于2微瓦)被同时施加到样品。用 激活和去激活激光两者同时照射导致指示器荧光团在荧光和黑暗状态之 间的随机切换。相对强的成像/去激活激光功率被选择以确保高发射强度 和快速切换断开速率，并且相对弱的激活激光被选择以确保在任何给定时 刻的被激活荧光团的部分足够低，以便它们在光学上可分辨。EMCCD摄 影机以20Hz的帧速率连续地获取图像，以获得“电影”。

为了从单个分子图像的宽度中得出z坐标，如图1C所示生成校准曲 线。以三种方式在例子1中进行校准实验：1.Alexa647标记的抗生蛋白 链菌素以低密度吸附于盖玻片表面上，使得单独的抗生蛋白链菌素分子彼 此可分辨。成像缓冲液中的β-巯基乙醇用2mM的水溶性维生素E(Trolox) 替换，以便抑制荧光团的闪烁。在用压电级以恒定速率在z中对样品台进 行扫描的同时，记录单独的抗生蛋白链菌素分子的荧光图像。2.将量子 点吸附到盖玻片上。PBS中的1％的β-巯基乙醇溶液用作成像缓冲液以 抑制量子点的闪烁。在以恒定速率在z中对样品台进行扫描的同时，获取 单独的量子点的荧光图像。3.Cye-Alexa647标记的抗生蛋白链菌素以高 密度吸附于盖玻片表面上。除了以恒定速率在z中对样品进行缓慢扫描之 外，以与在数据获取期间相同的方式执行测量。视场之内的小面积(通常 为8微米×4微米)中的光激活事件被用来测量校准曲线。全部三个测量 产生了类似的校准曲线。

校准实验的一个图像帧中的荧光峰值用以下椭圆高斯函数拟合：

$G(x,y)=h\exp (-2\frac{{(x-x_0)}^2}{{w_x}^2}-2\frac{{(y-y_0)}^2}{{w_y}^2})+b$

其中，h是峰值高度，b是背景，(x₀,y₀)是峰值的中心位置，并且w_x和w_y分别代表图像(点扩散函数，PSF)在x和y方向上的宽度。与此同时， 根据压电级的z轨迹来确定相应分子的z位置。作为z的函数的w_x和w_y值然后被拟合到修改形式的典型散焦曲线：

$w_{x,y}\left(z\right)=w_0\sqrt{1+{\left(\frac{z-c}{d}\right)}^2+A{\left(\frac{z-c}{d}\right)}^3+B{\left(\frac{z-c}{d}\right)}^4}$

其中，w₀是当分子处在焦平面时的PSF宽度，c是x或y焦平面从平均焦 平面的偏移量，d是显微镜的聚焦深度，并且A和B是用于对成像光学 的不理想性进行校正的高阶项系数。平均焦平面被定义成使得在这个平面 中定位的荧光团具有下述图像PSF，该图像PSF在x和y方向上具有相 等的宽度，这样一来就生成了球形图像。应当注意的是，这些拟合曲线被 生成以有利于在测量的w_x和w_y值与校准曲线相比较时进行的自动z定位， 以搜索相应的z位置。只要曲线用足够的精确度拟合测量的校准数据，用 于拟合曲线的确切函数并不重要。

数据以与以前描述的类似的方式进行分析(参见通过引用结合于此的 2008年7月31日作为国际专利申请公布第WO2008/091296号公布的名 称为“Sub-DiffractionLimitImageResolutionandOtherImaging Techniques”的2007年8月7日申请的国际专利申请第PCT/US2007/ 017618号)，但是现在具有了根据单独的被激活荧光团的图像形状得出的 另外的z维度信息。STORM电影的每个图像帧中的荧光峰值通过用椭圆 高斯函数来拟合局部最大值而被识别，以便推导出峰值高度h'、两个横向 维度中的中心位置x₀'和y₀'以及两个横向维度中的峰值宽度w_x'和w_y'。将 阈值应用于峰值高度(h')、宽度和椭圆率(w_x'/w_y')，被丢弃的峰值太 弱、太宽或太斜而不能得到令人满意的定位精确度。还有被丢弃的是会导 致多个荧光团的重叠图像的某些峰值。如果连续帧中的被识别峰值的中心 位置在空间上分开小于一个像素，则它们被认为是源自一个光激活事件期 间的同一分子。来自不同帧中的同一荧光团的同一光激活事件的全部图像 被平均化，并且执行向椭圆高斯函数的二次拟合，以推导出精确的中心位 置x₀和y₀以及宽度w_x和w_y。通过在初始拟合中获得的峰值宽度来确定用 于二次拟合的图像区域。

在二次拟合之后，对校准曲线进行搜索以求出最佳匹配从拟合中获得 的测量宽度w_x和w_y的z₀点。通过使w_x^1/2-w_y^1/2空间中的下述距离最小化来 自动执行这个搜索：

$D=\sqrt{{(w_x^{1/2}-w_{x,calib}^{1/2})}^2+{(w_y^{1/2}-w_{y,calib}^{1/2})}^2}$

通过仿真并且通过分析处理可以表明，与直接使用宽度相比，使用宽度的 平方根提高了搜索过程中在z中的定位的精确度。具有大于预置阈值的最 小距离D的激活事件表明图像失真，这很可能是由位于附近且在同一图 像帧中被光激活的多于一个的分子造成的。从进一步的分析中丢弃这些事 件。这个过程允许获得每个被激活荧光团的3D位置(x₀,y₀和z₀)，并且 以这种方式构造三维图像。

当使用油浸物镜对玻璃基片所支撑的水溶液中的生物样品执行3D STORM测量时，可以考虑玻璃(n＝1.515)和成像缓冲液(对于10％的葡 萄糖溶液而言n＝1.35)之间的折射率失配。这个折射率失配有效地将对 象的视在z位置从玻璃表面移开。在从表面的几个微米之内，可以表明的 是，这种折射率失配引起的z距离的放大率可以被视为常数，并且对于在 这些成像条件下使用的物镜和折射率(物镜：NA＝1.4，玻璃：n＝1.515， 并且缓冲液：n＝1.35)而言，放大倍数等于1.26。通过用1/1.26＝0.79的 因数对根据与校准曲线直接比较而获得的全部z值进行重新定标，相应地 在z定位分析中对这种小的放大效应进行校正。

由于成像光学中的像差，当荧光团散焦时PSF可能变得不对称，结 果，其图像的中心可能从荧光团的实际横向位置略微偏离。这造成了3D 图像中的视在倾斜失真。平均倾斜在这些实验中通常不大于4度，并且可 以通过倾斜轮廓的预先校准来校正。

影响定位精确度的重要因素是图像获取时间期间的样品台漂移，既包 括x-y平面中的漂移，又包括z方向上的漂移。在例子1使用的设立中， 安装了聚焦锁定以使z漂移最小化，但是存在～40nm的剩余漂移。在这些 例子中使用两种方法对漂移进行校正。一种方法涉及添加置信标志器(荧 光珠子)以跟踪样品的漂移，并且在图像分析期间减去标志器的移动。另 一种方法使用用于漂移校正的图像的相关函数。第二种方法被用来对上述 例子中的x、y和z漂移进行校正。将电影按时间分成相等时段的片段， 并且根据每个电影片段来构造图像。然后计算第一个片段和所有随后片段 中的图像之间的相关函数，并且确定相关函数的重心位置。基于这些重心 位置的插值法被用来生成用于每个成像帧的作为时间函数的重心位置的 曲线。然后从定位中减去这个漂移，并且在不同时间点的全部定位都被包 括以生成漂移被校正的图像。

虽然在此已描述并图示了本发明的几个实施例，但是本领域技术人员 会容易地设想多种其它装置和/或结构，用于执行在此描述的功能和/或获 得在此描述的结果和/或优点中的一个或多个，并且这样的改变和/或修改 中的每一个都被认为是在本发明的范围之内。一般地说，本领域技术人员 将会容易地意识到的是，在此描述的所有参数、维度、材料和配置都是示 例性的，并且实际的参数、维度、材料和/或配置将会取决于使用本发明 教导的一个或多个特定应用。本领域技术人员将会认识到或者能够仅仅使 用常规实验来查明针对在此描述的本发明的特定实施例的许多等价物。因 此可以理解的是，前述实施例仅仅是作为例子提供的，并且在所附权利要 求及其等价物的范围之内，可以与特定描述和声明不同地实施本发明。本 发明针对的是在此描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、器材和/ 或方法。另外，两个或更多这样的特征、系统、物品、材料、器材和/或 方法的任意组合(如果这样的特征、系统、物品、材料、器材和/或方法 没有相互不一致)都包括在本发明的范围之内。

如在此定义和使用的所有定义都应当理解为在词典定义、通过引用结 合于此的文件中的定义和/或被定义术语的普通含义之上加以控制。

如本说明书和权利要求中在此使用的不定冠词“一个”，除非明确地 有相反指示，否则都应当理解为指的是“至少一个”。

如本说明书和权利要求中在此使用的措辞“和/或”应当理解为如此 联合的要素中的“任何一个或两者”，亦即要素在一些情况下联合出现， 而在其它情况下则分开出现。用“和/或”列举的多个要素应当以相同的 方式来阐释，亦即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了用“和/或” 语句特定识别的要素之外，其它要素可以可选地存在，所述其它要素或者 与特定识别的那些要素相关，或者不相关。因此，作为非限制性的例子， 对“A和/或B”的引用当结合开放式语句如“包括”一起使用时可以在 一个实施例中仅指的是A(可选地包括除了B之外的要素)，在另一个实 施例中仅指的是B(可选地包括除了A之外的要素)，在还有另一个实施 例中指的是A和B两者(可选地包括其它要素)，等等。

如本说明书和权利要求在此使用的那样，“或者”应当理解为具有与 如上面定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或 者”或“和/或”应当解释为包括，亦即包括若干或列举的要素中的至少 一个，而且还包括多于一个，并且可选地包括另外未列举的项目。只有明 确地有相反指示的项目，诸如“……中的仅一个”或“……中的确切地一 个”或者当在权利要求中使用时的“由……组成”，指的是包括若干或列 举的要素中的确切地一个要素。一般而言，如在此使用的术语“或者”当 结合独占性术语如“任何一个”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或 “……中的确切地一个”一起使用时应当仅解释为指示独占性选择(亦即 “一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”当在权利要求中使 用时应当具有如在专利法律领域中使用的普通含义。

如本说明书和权利要求在此使用的那样，关于列举的一个或多个要 素，措辞“至少一个”应当理解为从列举的要素中的任何一个或多个要素 中选择的至少一个要素，但不一定包括列举的要素之内特定列举的各个和 每一个要素中的至少一个，并且不排除列举的要素中的要素的任何组合。 这个定义还允许除了措辞“至少一个”所指的列举的要素之内特定识别的 要素之外，其它要素可以可选地存在，所述其它要素或者与特定识别的那 些要素相关，或者不相关。因此，作为非限制性的例子，“A和B中的至 少一个”(或者等价地，“A或B中的至少一个”，或者等价地，“A和/或 B中的至少一个”)可以在一个实施例中指的是至少一个、可选地包括多 于一个A而没有B存在(并且可选地包括除了B之外的要素)，在另一个 实施例中指的是至少一个、可选地包括多于一个B而没有A存在(并且 可选地包括除了A之外的要素)，在还有另一个实施例中指的是至少一个、 可选地包括多于一个A和至少一个、可选地包括多于一个B(并且可选 地包括其它要素)，等等。

还应当理解的是，除了明确地有相反指示，否则在包括多于一个的步 骤或行动的在此声明的任何方法中，该方法的步骤或行动的顺序不一定限 于对方法的步骤或行动进行陈述的顺序。

在权利要求以及上述说明书中，所有的连接词如“包括”、“携带”、 “具有”、“包含”、“涉及”和“持有”等都要理解为开放式的，亦即指的 是包括但不限于。如美国专利局专利审查过程手册2111.03部分中阐释的 那样，只有连接词“由……组成”和“基本上由……组成”才应当分别是 封闭式或半封闭式连接词。

根据本公开的实施例，还公开了以下技术方案。

1.一种方法，包括：

提供以小于大约1000nm的距离分开的第一实体和第二实体；

确定由所述第一实体发射的光；

确定由所述第二实体发射的光；以及

使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所 述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。

2.一种方法，包括：

提供以分开的距离分开的第一实体和第二实体；

确定由所述第一实体发射的光；

确定由所述第二实体发射的光；以及

使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所 述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。

3.一种方法，包括：

提供以小于大约1000nm的距离分开的第一实体和第二实体；

激活所述第一实体但不激活所述第二实体；

确定由所述第一实体发射的光；

激活所述第二实体；

确定由所述第二实体发射的光；以及

使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所 述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。

4.一种方法，包括：

提供以分开的距离分开的第一实体和第二实体；

激活所述第一实体但不激活所述第二实体；

确定由所述第一实体发射的光；

激活所述第二实体；

确定由所述第二实体发射的光；以及

使用由所述第一实体发射的光和由所述第二实体发射的光来确定所 述第一实体和所述第二实体的x、y和z位置。

5.如2或4中任何一项所述的方法，其中，由所述第一实体发射的 光具有大于所述分开的距离的波长。

6.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：使用它们 各自的x、y和z位置来构造所述第一实体和所述第二实体的图像。

7.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：根据它们 的图像在检测器处的形状来确定所述第一实体和/或所述第二实体的z位 置。

8.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：根据它们 的图像在检测器处的强度来确定所述第一实体和/或所述第二实体的z位 置。

9.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，包括：使由所述第一实 体发射的光穿过透镜，所述透镜相对于由所述第一实体发射的光穿过所述 透镜的方向非圆对称。

10.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：使由所述 第一实体发射的光穿过圆柱形透镜。

11.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：使用检测 器收集由所述第一实体发射的光，其中由所述第一实体发射的光没有聚焦 在所述检测器处。

12.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：使用检测 器收集由所述第一实体发射的光，其中所述第一实体没有处在所述检测器 的共轭平面内。

13.如11所述的方法，进一步包括：通过所述检测器收集由所述第 二实体发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的光没 有聚焦在所述检测器的检测区域中。

14.如11所述的方法，进一步包括：通过所述检测器收集由所述第 二实体发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的光没 有聚焦在所述检测器的共轭平面内。

15.如11所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过透镜， 所述透镜限定了不包含所述第二实体的聚焦区域。

16.如11所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过透镜， 所述透镜相对于由所述第二实体发射的光穿过所述透镜的方向非圆对称。

17.如11所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过圆柱 形透镜。

18.如9所述的方法，进一步包括：通过检测器收集由所述第二实体 发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的光没有聚焦 在所述检测器的检测区域中。

19.如9所述的方法，进一步包括：通过检测器收集由所述第二实体 发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的光没有聚焦 在所述检测器的共轭平面内。

20.如9所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过透镜， 所述透镜限定了不包含所述第二实体的聚焦区域。

21.如9所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过透镜， 所述透镜相对于由所述第二实体发射的光穿过所述透镜的方向非圆对称。

22.如9所述的方法，包括：使由所述第二实体发射的光穿过圆柱形 透镜。

23.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：通过多个 检测器收集由所述第一实体发射的光，其中由所述第一实体发射的光没有 聚焦在由所述多个检测器中的至少一个所限定的聚焦区域中。

24.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，进一步包括：通过多个 检测器收集由所述第一实体发射的光，其中在所述多个检测器中的一个或 多个处，由所述第一实体发射的光未被聚焦。

25.如24所述的方法，进一步包括：通过所述多个检测器收集由所 述第二实体发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的 光没有聚焦在所述多个检测器中的至少一个的检测区域中。

26.如24所述的方法，进一步包括：通过所述多个检测器收集由所 述第二实体发射的光，其中通过所述检测器收集的由所述第二实体发射的 光没有聚焦在所述多个检测器中的至少一个的共轭平面内。

27.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，由所述第一实体 发射的光和由所述第二实体发射的光具有不同的波长。

28.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，由所述第一实体 发射的光和由所述第二实体发射的光具有基本上相同的波长。

29.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体通过不同的波长激活。

30.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体通过基本上相同的波长激活。

31.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体在 化学上不同于所述第二实体。

32.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体在 化学上基本等同于所述第二实体。

33.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体是 光可激活或光可切换的探测剂，或者所述第一实体是光可激活或光可切换 的。

34.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体包 括：第一光发射部分；以及第二激活部分，其在暴露于外部刺激源时激活 所述第一部分。

35.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第二实体是 光可激活或光可切换的探测剂，或者所述第二实体是光可激活或光可切换 的。

36.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第二实体包 括：第一光发射部分；以及第二激活部分，其在暴露于外部刺激源时激活 所述第一部分。

37.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，由所述第一实体 发射的光具有在大约400nm和大约1000nm之间的波长。

38.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体相对于公共实体固定不动。

39.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到至少大约300nm的精确度。

40.如2或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和第二实 体以小于大约1000nm的距离分开。

41.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到至少大约100nm的精确度。

42.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到至少大约50nm的精确度。

43.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到至少大约20nm的精确度。

44.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到至少大约10nm的精确度。

45.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，所述第一实体和 所述第二实体的位置被确定到下述精确度，所述精确度小于由所述第一实 体和/或所述第二实体发射的光的波长。

46.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，包括：在第一时间点确 定所述第一实体和所述第二实体的位置，并且在第二时间点确定所述第一 实体和所述第二实体的位置。

47.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，包括：在多于一个的时 间点处和/或作为时间的函数来确定所述第一实体和所述第二实体的位 置。

48.如1、2、3或4中任何一项所述的方法，其中，按照陈述的顺序 来执行行动。

49.一种方法，包括：

提供能够发射光的多个实体，其中的至少一些以小于大约1000nm的 距离分开；

激活所述多个实体中的一部分以发射光；

确定发射的所述光；

使所述多个实体中的激活部分去激活；以及

重复激活与去激活所述多个实体的行动，以确定所述多个实体的x、 y和z位置。

50.一种方法，包括：

提供能够发射光的多个实体；

激活所述多个实体中的一部分以发射光；

确定发射的所述光；

使所述多个实体中的激活部分去激活；以及

重复激活与去激活所述多个实体的行动，以确定所述多个实体的x、 y和z位置。

51.如50所述的方法，其中，所述多个实体中的至少一些以小于发 射的所述光的波长的分开距离分开。

52.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：使用它们各自 的x、y和z位置来构造所述多个实体的图像。

53.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：根据它们的图 像在检测器处的形状来确定所述多个实体的z位置。

54.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：根据它们的图 像在检测器处的强度来确定所述多个实体的z位置。

55.如49或50中任何一项所述的方法，包括：使由所述多个实体中 的所述部分发射的光穿过透镜，所述透镜相对于由所述多个实体中的一些 发射的光穿过所述透镜的方向非圆对称。

56.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：使由所述多个 实体中的所述部分发射的光穿过圆柱形透镜。

57.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：使用检测器收 集由所述多个实体中的所述部分发射的光，其中由所述多个实体中的所述 部分中的一些发射的光没有聚焦在所述检测器处。

58.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：通过多个检测 器收集由所述多个实体中的所述部分发射的光，其中所述多个实体中的所 述部分中的一些没有处在所述多个检测器中的至少一个的聚焦区域中。

59.如49或50中任何一项所述的方法，包括：使由所述多个实体中 的所述部分发射的光穿过透镜，所述透镜限定了不包含所述多个实体中的 所述部分中的至少一部分的聚焦区域。

60.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：使用检测器收 集由所述多个实体中的所述部分发射的光，其中由所述多个实体中的所述 部分中的至少一部分发射的光没有处在所述检测器的共轭平面内。

61.如49或50中任何一项所述的方法，进一步包括：通过多个检测 器收集由所述多个实体中的所述部分发射的光，其中在所述多个检测器中 的一个或多个处，由所述多个实体中的所述部分中的至少一部分发射的光 未被聚焦。

62.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体中的至 少一些以不同的波长发射光。

63.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体每个以 基本上相同的波长发射光。

64.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体中的至 少一些由不同波长的光激活。

65.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体每个由 基本上相同的波长的光激活。

66.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体中的至 少一些是光可激活或光可切换的探测剂。

67.如49或50中任何一项所述的方法，其中，由所述多个实体中的 至少一些发射的光具有在大约490nm和大约1000nm之间的波长。

68.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约1000nm的精确度。

69.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约300nm的精确度。

70.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约100nm的精确度。

71.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约50nm的精确度。

72.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约20nm的精确度。

73.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到至少大约10nm的精确度。

74.如49或50中任何一项所述的方法，其中，所述多个实体的位置 被确定到下述精确度，所述精确度小于由所述多个实体发射的光的波长。

75.如49或50中任何一项所述的方法，包括：在第一时间点确定所 述多个实体的位置，并且在第二时间点确定所述多个实体的位置。

76.如49或50中任何一项所述的方法，包括：在多于一个的时间点 处和/或作为时间的函数来确定所述多个实体的位置。

77.如49或50中任何一项所述的方法，其中，按照陈述的顺序来执 行行动。