一种具有抗癌功效的生脉散醇提物及其制备方法

摘要

本发明属中药领域，涉及一种生脉散醇提物及其在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用。研究表明约90%胰腺、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras原癌基因过表达造成的，Ras蛋白已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。动物实验表明生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生脉散醇提物及其在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用，属于中药领域。

背景技术

生脉散是中医千古名方，首载于金代医家张元素所著《医学启源·卷下》“麦门冬”条内；内外伤辨惑论及医方考中也有记载。由人参、麦冬、五味子组成，意在取“人参之甘补气，麦门（即麦冬）苦寒泻热补水之源，五味子之酸清肃燥金”。

生脉散最早用于治疗暑热汗多，气阴两伤之证，表现为汗多、身疲、体倦、气短、咽干、脉虚等症状。古代医家也用于金叶耗伤，脉微欲绝等症状，又用作气阴两虚病人的补益剂。此方经过几百年的长期使用，安全有效，经久不衰。随着现代医学的发展，生脉散的临床应用不断扩大，其剂型除散剂外，还有生脉饮、生脉注射液；该方剂经加减变化后还发展了参麦饮和生脉散党参方等。现在主要用于治疗心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血等症状、糖尿病、慢性支气管炎，各类心源性休克、冠心病、心律失常等。

汤铭新等发现生脉散可显著抑制肺癌的自发转移，但是实验证明这种抗肿瘤作用并非生脉散直接作用于癌细胞，而是通过提高机体免疫功能间接实现抗肿瘤。中国专利201010148044.0公开了一种具有抗肿瘤作用的组合物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用，该专利将生脉散与其他中药复方添加到以含主药蟾酥的抗肿瘤药物组合物中，生脉散减少了蟾酥所带来的心脏毒性问题；中国专利200510053562.9公开了生脉注射液在制备治疗肿瘤减毒药物中的用途，在对荷瘤小鼠化疗过程中，同时应用生脉散可保护肝肾功能。中国专利03142266.7公开了生脉注射液在制备治疗肿瘤增效药物中的用途。该专利中应用生脉散注射液处理结肠癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌细胞株，证明生脉注射液单独应用时的抗肿瘤作用效果时有时无，生脉散仅具较稳定的协同增效作用。上述发明专利中涉及生脉散的抗肿瘤应用，均局限于将生脉散作为肿瘤治疗过程中的辅助用药应用。

约30%的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后激活导致Ras蛋白表达水平增高造成的。若Ras蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。因此，Ras已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。

研究表明组成生脉散的单味药人参、五味子和麦冬均具有抗肿瘤作用，但将它们组方成为生脉散后，人们对其在抗肿瘤应用方面却只发现了它具较稳定的协同增效作用，因此只能将该方剂作为治疗肿瘤的辅助用药。而通过本发明的实验证明，生脉散对ras原癌基因突变后所致的过表达具有显著的抑制作用，而不作用于野生型ras原癌基因。

但是，传统的生脉散水煎剂具有一定毒性，安全性差，因此，本发明在对生脉散进行醇提的基础上，通过大孔树脂对其进行进一步分离纯化，分离纯化后的成分不仅保留了生脉散水煎剂抑制ras原癌基因过表达的作用，并且大大降低了生脉散水煎剂的毒性，因此效果更好，可在制备抑制ras原癌基因过表达的抗相关恶性肿瘤的药物中应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种生脉散醇提物,该生脉散醇提物可以有效降低传统生脉散水煎剂的毒性，效果更好。

本发明的另一个目的是提供一种生脉散醇提物在制药中的新用途，涉及生脉散醇提物在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体涉及在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用，以期提供一种抗肿瘤活性高，毒性小，廉价的抗肿瘤药物。

本发明中生脉散醇提物的制备方法如下：

先将人参、麦冬和五味子，加入乙醇溶液浸泡，加热回流后过滤，减压浓缩得到浸膏，其特征在于：之后将上述浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱吸附，之后用乙醇溶液冲洗收集后制得的。

其中，所述人参、麦冬和五味子的比例为9:9:6，所述乙醇溶液为无水乙醇。

所述大孔树脂柱的型号为D101型。

本发明所述的生脉散醇提物可以在抑制ras原癌基因过表达中应用。

本发明所述的生脉散醇提物亦可在制备抗肿瘤药物中应用，其中所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达导致的。

本发明所述的生脉散醇提物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，可以将生脉散醇提物添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。

本发明提供一种生脉散醇提物及其在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物的新用途。本发明公开的生脉散醇提物及其应用具有以下的优势：

（1）本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。

（2）生脉散醇提物可以显著抑制ras原癌基因过表达，可在制备治疗由ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中应用。

（3）生脉散醇提物中人参、麦冬和五味子之间的组方配比可以根据中药组方原则合理改动，其仍然可以显著下调ras原癌基因过度激活，具有抗肿瘤活性。

（4）生脉散醇提物仅仅作用于过表达的突变体Ras蛋白，而对野生型Ras蛋白无影响。提示生脉散醇提物在应用上安全，它仅作用于癌细胞，而不会作用于正常细胞。今后，我们有望将生脉散醇提物应用在抗相关恶性肿瘤药物的制备中，其中，所述肿瘤是由ras原癌基因的过表达导致的，从而为此类肿瘤患者提供更好的治疗，为一些疑难癌症的治疗提供新的途径。

（5）生脉散醇提物显著下调ras原癌基因过表达，并不是致突变引起的，不致畸。

（6）由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras原癌基因突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。因此，本实验采用了秀丽隐杆线虫突变株作为评估抑制ras原癌基因通路过度激活药物的模型，并得出了本生脉散醇提物对ras原癌基因过表达有明显下调作用、具有抑制ras原癌基因通路过度激活，并且与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好的结论。

以下提供具体实施例以实现本发明所述的生脉散醇提物及其在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中应用，但不限于这些实施例。

具体实施方式

实施例一生脉散水煎剂的制备方法

材料：人参，麦冬，五味子均购自兰州黄河市场

制备方法：先将人参、麦冬、五味子用蒸馏水浸泡，煮沸，煎煮，定容后离心，弃去沉淀，将上清无菌过滤，置4℃冰箱待用。其中，所述原料人参、麦冬、五味子的比例为9:9:6。

实施例二生脉散醇提物的制备方法

材料：人参，麦冬，五味子均购自兰州黄河市场

（1）生脉散浸膏的制备方法：

将配比为9:9:6的人参、麦冬和五味子，加入无水乙醇浸泡，加热回流后过滤，减压浓缩得到生脉散浸膏。

（2）生脉散醇提物的制备方法：将生脉散浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱吸附，之后用不同浓度的乙醇溶液冲洗收集后制得,乙醇浓度分别为30%、50%、70%、100%。同时用水冲洗收集后获得水洗脱物，作为对照。

其中，所用大孔树脂柱的型号为D101型。

实施例三生脉散醇提物改善生脉散水煎剂毒性的效果

培养基、药品：

NGM培养基：NaCl1.5g，K₂HPO₄1.3g，KH₂PO₄8.5g，蛋白胨1.4g，琼脂粉8.5g，补充蒸馏水至500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇（5mg/mL，无水乙醇配制），高压蒸汽灭菌的500μL1mol/LMgSO₄，500μL1mol/LCaCl₂。

LB液体培养基：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，补充蒸馏水至100mL。溶解后用1MNaOH调节pH值为7.0，高温灭菌。

M9缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O15.12g，KH₂PO₄3g，NaCl5g，MgSO₄·7H₂O0.25g，高温灭菌。

S基础液(1L)：NaCl58.5g，K₂HPO₄10g，KH₂PO₄6g；补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。

1M柠檬酸钾(1L)：柠檬酸·H₂O20g，柠檬酸钾·H₂O293.5g，补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。

Trace(1L)：Sodium.EDTA1.86g，FeSO₄·7H₂O0.69g，MnCl₂·4H₂O0.2gCuSO₄·5H₂O0.29g，ZnSO₄·7H₂O0.025g，补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。

S液(1L)：，1M柠檬酸钾10mL，Trace10mL，1MCaCl₂3mL，1MMgSO₄3mL，5mg/mL胆固醇1mL，补充S基础液至1L，临用前配制。

仪器

实验动物：

秀丽隐杆线虫株：秀丽隐杆线虫突变体MT2124，基因型为：let-60(n1046sd,gf)IV，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。

细菌株：尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌OP50，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。

具体实验步骤：

线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后将放在20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫，并且板子上有卵和小线虫的时候进行线虫的同步化。

线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清，然后在加入M9缓冲液，离心，重复几次，目的是将大肠杆菌洗干净；加入裂解液（终浓度：3.2%NaClO和1MNaOH）；在涡旋仪上震荡7min，使线虫的虫体破裂，得到卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。

药物作用：将生脉散醇提物稀释到一定的浓度，同步化好的线虫稀释到80条/20ul左右，在96孔板中，每个孔中加S液120ul，虫液20ul，20ul的10mg/ml的大肠杆菌OP50，5mg/ml的胆固醇20ul，合适稀释的药液20ul，每个药物浓度(药物终浓度分别为1.25mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL)设置五个平行。空白对照组不加药液，将药液换成S液。20℃恒温培养至线虫成熟，在显微镜下检测线虫的野生型比例(即只有一个真阴门的线虫比例)。与空白对照组相比，野生型的比例越高，说明药物的作用更强。结果如下表所示：

表1生脉散醇提物抑制ras通路过度激活生物活性测定及对秀丽隐杆线虫

突变体MT2124生长的影响数据

表1的实验结果表明，生脉散水煎剂与生脉散醇提物均能显著抑制ras通路过度激活，提高线虫的野生型比例，但是，生脉散水煎剂与经无水乙醇洗脱获得的生脉散醇提物相比，毒性大，会引起线虫大量死亡。

本发明的生脉散醇提物在保留生脉散水煎剂抑制ras通路过度激活效果的同时，毒性大大下降，尤其是经无水乙醇洗脱获得的醇提物，在保证较高药效的同时，降低了线虫死亡率，在药物终浓度为5.0mg/ml的条件下，线虫的野生型比例达到了76%，而线虫死亡率仅为2%。因此，相比前者，本发明的生脉散醇提物毒性更小，效果更好。

实施例四生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫MT8189（lin-15突变失活）的作用

实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189，多阴门表型，基因型:lin-15(n765)X，购自CGC（CaenorhabditisGeneticsCenter）；大肠杆菌OP50（尿嘧啶渗漏突变株）作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC（CaenorhabditisGeneticsCenter）。

具体实验步骤：同实施例二。

秀丽隐杆线虫中，在lin-15(n765)X位于ras的上游，正常情况下抑制ras原癌基因的表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。

实验结果显示，生脉散醇提物处理后的线虫的突变率仍然为100%，因此，生脉散醇提物不能抑制lin-15(n765)X的多阴门表型，根据遗传上位的原则，生脉散醇提物既然可逆转其下游的let60/ras原癌基因过度激活导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即生脉散醇提物不能抑制let60/ras上游基因lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由于lin-15(n765)X线虫中包含的是野生型let60/ras拷贝，生脉散醇提物仅仅对过表达的let60/ras起作用，对野生型let60/ras不敏感，即生脉散醇提物仅仅作用于过度激活的Ras蛋白，对野生型Ras蛋白不敏感，这说明生脉散醇提物仅仅作用于ras原癌基因过度激活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。

实施例五生脉散醇提物对秀丽隐杆线虫CB1275（lin-1突变失活）的作用

实验材料：秀丽隐杆线虫CB1275基因型：lin-1(e1275)IV购自CGC（CaenorhabditisGeneticsCenter）；大肠杆菌OP50（尿嘧啶渗漏突变株）作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。

具体实验步骤：同实施例二。

lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1突变失活后，线虫为多阴门表型。由于lin-1为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多阴门而呈非特异的细胞毒作用。

本实施例的结果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到生脉散醇提物的影响（突变率仍然为100%），这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门，不能抑制lin-1突变失活形成的假阴门表型，说明生脉散醇提物作用于ras原癌基因而不作用于lin-1，证明药物下调了ras原癌基因的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖起作用的，即生脉散醇提物起作用是ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。

以上实施例的动物实验表明，本发明的生脉散醇提物可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因。同时，本发明的生脉散醇提物与传统的生脉散水煎剂相比致死率低且无致畸作用，因此毒性更小，效果更好，可应用在制备由ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。