大丽轮枝菌ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因及其干扰载体和应用

摘要

本发明公开了大丽轮枝菌ADP-ATP载体蛋白(AACP)病程关键靶基因及其干扰载体和应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术筛选获得AACP基因中能明显降低植物病情指数的3段病程关键靶基因，并进一步将所述3段靶标区段构建Gateway干扰载体，获得对病原菌抗性明显提高的稳定遗传的转基因烟草。通过病情指数、真菌生物量分析以及靶标基因的转录水平检测，最终筛选获得AACP基因的最佳干扰区段。本发明大丽轮枝菌ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因及RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因，还涉及 含有所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载体，本发明 还涉及所述大丽轮枝菌ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因或干扰载体在 提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的 克隆及应用领域。

背景技术

棉花黄萎病于1914年首次在美国发现，目前已成为一种世界性的病 害，其病原菌为大丽轮枝菌。大丽轮枝菌Verticilliumdahliae，属于半知 菌亚门(Deuteromycotina)、淡色孢科(Moniliaceae)、轮枝菌属 (Verticillium)，它不仅严重危害棉花的纤维质量和皮棉产量，还可危害 40科660种植物，其中农作物184种，杂草153种(RoweR.C.,DavisJ.R., PowelsonM.L.,etal.Potatoearlydying:causalagentsandmanagement strategies.PlantDisease1987,71:482-489)。

ATP-ADP载体蛋白(ADP,ATPcarrierprotein，AACP， VDAG_07535.1)作为真核生物体线粒体膜上一种跨膜蛋白(KimY.H., HaidlG.,SchaeferM.,etal.CompartmentalizationofauniqueADP/ATP carrierproteinSFEC(SpermFlagellarEnergyCarrier,AAC4)withglycolytic enzymesinthefibroussheathofthehumanspermflagellarprincipalpiece. DevelopmentalBiology2007,302:463-476.)，介导线粒体与细胞质基质之 间的ADP/ATP交换(KlingenbergM.TheADPandATPtransportin mitochondriaanditscarrier.BiochimicaetBiophysicaActa2008,1778: 1978-2021.)，在通过氧化磷酸化作用产生ATP给细胞提供能量的过程中 起着中心的作用，是保持细胞内能量平衡的关键成分(Pebay-PeyroulaE., Dahout-GonzalezC.,KahnR.,etal.StructureofmitochondrialADP/ATP carrierincomplexwithcarboxyatractyloside.Nature2003,426:39-44)。 AACP与线粒体膜上其它多种蛋白共同组成线粒体通透性转换孔，对保持 线粒体内的电化学平衡及稳定状态具有重要作用(KroemerG.,ZangamiN., andSusinS.A.Mitochondriaandapotosis.ImmumologyToday1997,18: 44-51.)。酵母的AACP2与多个蛋白复合体特有的大小和成分有密切关 系，例如线粒体载体家族(Claypool,S.M.,Oktay,Y.,Boontheung,P.,etal. CardiolipindefinestheinteractomeofthemajorADP/ATPcarrierproteinof themitochondrialinnermembrane.JournalofCellBiology2008,182: 937-950.)。在酵母的遗传转化研究中，Pep4p和AACP可以调节线粒体 的降解(PereiraC.,ChavesS.,AlvesS.,etal.Mitochondrialdegradationin aceticacid-inducedyeastapoptosis:theroleofPep4andtheADP/ATPcarrier. MolecularMicrobiology2010,76:1398-1410.)。AACP不仅作为负责能量 分子传导的转运蛋白，在细胞凋亡调控网络中也具有重要的作用 (TsujimotoY.,andShimizuS.Roleofthemitochondrialmembrane permeabilitytransitionincelldeath.Apoptosis2007,12:835-840.)。因此， AACP是生物体内能量产生与能量消耗的桥梁，与细胞的发育、繁殖和凋 亡密切相关。

AACP在条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici)孢子萌发时的 表达量较少，在孢子形成时有大量表达。在病原菌与寄主植物相互作用的 过程中，此基因的表达量呈上升趋势，这说明它在病原菌与植物互作的过 程中可能发挥着重要功能(董艳玲.小麦成株抗条锈病差异表达基因的 cDNA-AFLP分析及小麦与条锈菌互作相关基因的克隆与特征研究[博士 学位论文].杨凌:西北农林科技大学,2010)。

目前对于AACP的研究主要集中于其与能量代谢之间的关系，在真菌 中的研究较少，尤其是其与致病性之间的关系。因此，以大丽轮枝菌的 AACP作为靶标基因，研究其与病原菌致病力之间的关系，对于提高植物 对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae) 的ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供含有所述ADP-ATP载体蛋 白病程关键靶基因的RNA干扰载体和宿主细胞；

本发明所要解决的第三个技术问题是将所述ADP-ATP载体蛋白病程 关键靶基因或RNA干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的ADP-ATP载 体蛋白(ADP,ATPcarrierprotein，AACP)病程关键靶基因，其核苷酸序 列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQ IDNo.5所示；优选的，所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因的核苷 酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.3或SEQIDNo.5所示。

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术(Host-inducedgenesilencing)， 以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌AACP cDNA序列信息(其核苷酸序列为SEQIDNo.6所示)，设计引物克隆获 得针对靶标基因的5个不同区段，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1-5所 示。本发明进一步将克隆获得的大丽轮枝菌基因的5个靶标片段分别构建 到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体并转化农杆菌，用于本氏烟 草的注射，从注射VIGS系列载体后的第8天进行大丽轮枝菌接种。病情 指数分析结果表明，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病 情指数均有所下降；其中分别注射VIGS系列载体VIGS-1(靶标片段的 核苷酸序列为SEQIDNo.1所示)、VIGS-3(靶标片段的核苷酸序列为 SEQIDNo.3所示)、VIGS-5(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.5所 示)的烟草，病情指数一直保持在较低水平，初步说明它们与病原菌的致 病性存在一定关系。

本发明所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因能够应用于提高植物 对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：(1)构建含有所述ADP-ATP 载体蛋白病程关键靶基因的RNA干扰表达载体；(2)将所构建的RNA 干扰表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗 病性提高的转基因植物。

本发明进一步公开了含有所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因的 RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。

构建含有所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因的RNA干扰载体 的方法为本领域技术人员所熟知，优选为Gateway技术，只需BP反应和 LR反应就可以完成RNA干扰表达载体的构建。

本发明所述RNA干扰载体也能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗 病性，包括以下步骤：(1)将所述RNA干扰表达载体转化到植物或植物 细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明还公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法， 包括以下步骤：(1)构建含有所述ADP-ATP载体蛋白病程关键靶基因 的RNA干扰表达载体；(2)将所构建的RNA干扰表达载体转化到植物 或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新 品种。

本发明所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于 转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适 方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。

本发明所述植物包括：大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括： 棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多 种。

本发明根据瞬时转化的烟草病情指数的变化，选择核苷酸序列分别为 SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5所示的AACP三个DNA区段， 用于Gateway干扰载体的构建。通过BP反应和LR反应，将上述3个靶 标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶 标基因的植物转化载体，转化至农杆菌，用于本氏烟草转化，最终获得转 基因烟草。本发明进一步对含有AACP不同区段dsRNA的阳性转基因烟 草进行大丽轮枝菌接种和病情指数分析。结果表明，转基因烟草对病原菌 的抗性明显提高，病情指数下降约55-80％。通过提取转基因烟草根部DNA 进行真菌生物量分析，结果表明转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低， 仅为野生型的30-65％。靶标基因的表达量分析结果表明，转基因烟草靶 标基因的表达量均明显降低，其中RNAi-3组内AACP基因表达量的下降 量可达75％左右。通过病情指数统计、真菌生物量分析以及靶标基因的表 达量分析结果，可以明显观察到RNAi-3组(靶标片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示)转基因烟草对病原菌具有更强的抗性，说明AACP基因的 区段3(核苷酸序列为SEQIDNo.3所示)作为靶标片段设计dsRNA，可 以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术(Host-inducedgenesilencing)， 以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌AACP序 列信息，设计引物克隆获得针对靶标基因的5个不同区段，从中筛选获得 了能够明显降低植物病情指数的3个靶标区段，进一步构建载体，获得稳 定遗传的转基因植物。通过病情指数分析以及检测真菌生物量和靶标基因 的转录水平，筛选到效果最佳的干扰区段，其核苷酸序列为SEQIDNo.3 所示。本发明所述大丽轮枝菌AACP基因的3段靶基因片段以及RNA干 扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，培育抗大丽轮枝菌的 转基因植物新品种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明 所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷 酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制， 否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有 类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代 谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括 PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰 胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰 的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定 的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码 子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子 取代(Batzer等人,NucleicAcid.Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol. Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol. Cell.Probes.8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞， 而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细 胞或真核细胞。

术语“RNA干扰(RNAinterference,RNAi)”意指通过外源或内源 性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1为VIGS载体信息；

图2为VIGS不同区段扩增结果；其中，M：marker；1-5为针对AACP 基因的不同区段扩增结果；

图3为VIGS干扰载体酶切验证；其中，M为marker；1-5为针对AACP 基因构建VIGS质粒的酶切结果；

图4为病情指数统计；

图5为RNAi载体信息；其中，A：pDONR207载体信息；B： pK7GWIWG2(I),0载体信息；

图6为RNAi扩增结果；其中，M为marker；1，2，3为针对AACP 的扩增条带，N为阴性对照；

图7为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-6为转基因 烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图8为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-6为转基因 烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图9为转基因阳性烟草PCR检测；其中，M：marker，1-6为转基因 烟草，wt为野生型烟草，N为阴性对照；

图10为转基因烟草病情指数分析；

图11为植物体内真菌生物量分析；

图12为真菌体内靶标基因相对表达量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

1.1烟草

本氏烟草(Nicotianabenthamiana)品系。

培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土(芳洁营养土：蛭石＝ 1：1)中，温度23±2℃，相对湿度75±5％，光周期L：D为16h：8h。 1.2菌株和质粒

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)V991，高致病 力落叶型菌株，由中国农科院植保所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)双元载体(TRV1 与TRV2)由清华大学刘玉乐教授惠赠。

农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明 人实验室保存。

实施例1大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的ADP-ATP载体蛋白病程 关键靶基因筛选

1、实验方法

1.1VIGS干扰载体的构建

为了获得针对靶标基因最佳干扰效果的片段，根据大丽轮枝菌ADP, ATPcarrierprotein(VDAG_07535.1)cDNA序列，设计特异性引物(表1)， 引物两端带有BamHI和EcoRI酶切位点，分别对目的基因进行PCR扩 增，结果用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。然后将回收得到的片段分 别连接至TRV2载体中，通过酶切和测序进行验证，并将验证好的质粒转 化至农杆菌GV3101中。

表1AACP不同区段引物信息

注：加粗处为酶切位点。

1.2VIGS转化方法

将含有TRV1和TRV2+靶标基因片段质粒的农杆菌单克隆分别放于 LB液体培养基(25μg/mLRif和50μg/mLKan)中，28℃摇床过夜培养。 然后将菌液(比例为2％)加入LB液体培养基中再次培养，28℃摇床振 荡培养OD₆₀₀至0.5-0.6时，低温离心收集菌体。将菌体重悬于注射基质 (10mMMES、10mMMgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，调整OD₆₀₀至 0.8-1.0。把两种菌液(TRV1与TRV2+靶标基因片段)以1：1混合，在 室温中静置3-5h，不要摇动。最后利用注射器将含有注射基质的农杆菌 注射于最嫩的叶片中。

1.3真菌的培养以及植物接种方式

将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。 经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将 孢子浓度调整至10⁶个/ml后备用。

选取长势一致的本氏烟草幼苗进行大丽轮枝菌接种。用镊子从根部将 幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的 10⁶个/mL孢子悬液或蒸馏水中2min，取出。尽快将幼苗移回原来的塑料 钵中，并浇水，使土壤湿润。

1.4植物病情指数统计

根据相关文献(李海涛,张子君,杨国栋,邹庆道,吕书文.茄子黄萎 病抗病性鉴定.辽宁农业科学,2004,1:4-6；20.王忠,杨清,黄萎病菌胁 迫下野生茄子托鲁巴姆防卫反应的生理生化分析.中国生物工程杂志, 2011,31:65-71.)并做出适当调整，制定本发明中本氏烟草感染大丽轮枝 菌的病情指数(表2)。

表2病情指数统计

2、实验结果

2.1大丽轮枝菌AACP干扰载体的构建

本发明采用的为清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒(Tobaccorattle virus，TRV)载体(图1)。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合 成酶终止子(nopalinesynthaseterminator，NOSt)之间。TRV1包含了病 毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp)、 可移动蛋白(MovementProtein，MP)、16kDa富含半胱氨酸区域等其它 元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白(Coatprotein，CP)、多克隆位点(multiple cloningsite，MCS)等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的 插入。

本发明根据大丽轮枝菌AACP序列信息(其核苷酸序列为SEQID No.6所示)，设计引物，克隆获得针对靶标基因的5个不同区段(图2)， 其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQID No.4、SEQIDNo.5所示。

通过BamHI和EcoRI将克隆获得的大丽轮枝菌基因的靶标片段进行 酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过 酶切(图3)和DNA测序进行验证后，发现序列与T载体测序结果完全 一致。然后，将验证正确的质粒转化农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注 射。

2.2本氏烟草的病情指数分析

在注射后的第8天，可以发现烟草的嫩芽出现白化现象；随着时间的 延长，白化现象逐渐扩大，并且能够持续40天左右。

从注射后的第8天起，本氏烟草的白化现象就非常明显，这表明了在 本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因 此，本发明选择从注射VIGS系列载体后的第8天，进行10⁶个/mL孢子 悬液的蘸根法接种大丽轮枝菌。对接菌后的8dpi(daypost-inoculation， dpi)、10dpi和12dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果显示(图4)， 与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降； 随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，即分别注射 VIGS系列载体VIGS-1(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示)、 VIGS-3(靶标片段的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示)、VIGS-5(靶标 片段的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示)，病情指数一直保持在较低水平， 初步说明它们与病原菌的致病性存在一定关系。

实施例2Gateway干扰载体的构建及植物转化

1、实验方法

1.1稳定遗传载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，根据实施例 1瞬时转化的烟草病情指数的变化，挑选三个DNA区段(核苷酸序列分 别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5所示)，重新设计两端含 有部分BP位点的引物，然后再用attb引物进行扩增(表3)，用于Gateway 干扰载体的构建。根据BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后 通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中。最后将构建好的载体转 化至农杆菌LBA4404中。

表3Gateway干扰引物信息

1.2植物转化

将生长在MS基本培养基上的无菌烟草，除去叶片边缘和主要叶脉， 切成0.4×0.6cm大小的小段，放入OD₆₀₀为0.1-0.2的农杆菌LBA4404菌 液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片摆 放在铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+NAA0.2mg/L+6-BA2 mg/L)上进行共培养，25℃暗培养3天。将经过共培养的烟草外植体转 移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基(MS+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L +Kan100mg/L+Carb500mg/L)中进行培养，光照周期为16h光照/8h 黑暗，2-3周后即可生芽。待抗性芽生长至1-2cm高时，切下小芽转入 生根培养基(MS+Kan100mg/L+Carb500mg/L)中诱导生根，1～2周 后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测(表 4)，获得转基因阳性植株。

表4检测引物信息

1.3真菌生物量检测

选取长势一致的本氏烟草，利用蘸根法接种大丽轮枝菌。植物病情指 数统计方法同实施例1。为了比较不同基因型与阴性对照本氏烟草中病原 菌的生物量，利用qRT-PCR测定不同基因型以及不同部位大丽轮枝菌的 生物量。提取接菌12天本氏烟草中根的总DNA，以大丽轮枝菌内部转录 间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段， 进行相对定量测定(表5)。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进行结果分 析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表5荧光定量引物信息

1.4靶标基因的表达量分析

为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，测 定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA， 并进行反转录。根据靶标基因设计引物作为目的片段(表6)，同时以病 原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进行结果分 析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表6荧光定量引物信息

2、实验结果

2.1转基因植株的获得

通过HIGS筛选的方法，获得了与病原菌密切相关的基因型。为了进一 步验证ADP,ATP载体蛋白基因(AACP)的功能，以及干扰后能显著降低病 原菌致病力的区段，并且获得稳定遗传的本氏烟草，本发明设计了针对靶标 基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个AACP靶标片段分别连 接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上(图5)，形成含有真菌靶标 基因的植物转化载体。通过PCR检测，从电泳图6中可以发现明亮的目 的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一 致。

为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因AACP的dsRNA，通过 农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏 烟草，最终获得转基因烟草(图7-9)。

2.2转基因烟草的抗病性分析

对获得的含有AACP不同区段dsRNA的阳性转基因烟草，进行大丽 轮枝菌接种。然后从接种后第8天、第10天和第12天进行病情指数分析， 从图10可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降 约55-80％。

提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图 11表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的30-65％。

病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到RNAi-3组转基 因烟草对病原菌具有更强的抗性。这说明AACP基因的区段3(核苷酸序 列为SEQIDNo.3所示)作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰 效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。

2.3靶标基因的表达量分析

从图12中可以明显观察到，与对照组相比，转基因烟草靶标基因的 表达量均明显降低，其中RNAi-3组内AACP基因表达量的下降量可达75％ 左右，说明AACP基因的区段3(核苷酸序列为SEQIDNo.3所示)是效 果最佳的干扰区段。