木棉花粉活力的检测方法

摘要

本发明涉及一种木棉花粉活力的检测方法，包括以下步骤：(1)收集花粉；(2)配制培养基：用蒸馏水配制琼脂培养基，其中含硼酸25～50mg/L、蔗糖90～110g/L、琼脂7～9g/L，将培养基装入培养皿待用；(3)花粉萌发培养：将花粉溶于培养液中，形成花粉液，再将花粉液喷到培养基的表面，均匀铺开，恒温、恒光照培养；(4)花粉活力检测：培养完毕后，将培养皿置于倒置显微镜下观察，统计每个培养皿的花粉的数量、萌发的花粉的数量，计算花粉的活力。该方法结果直观，数据可靠，可在15h内检测出新鲜木棉花粉的活力，对木棉的杂交制种、培育木棉优良新品种具有重要现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及杂交制种技术领域，特别是涉及木棉花粉活力的检测方法。

背景技术

木棉(BombaxceibaL.)，又名红棉、英雄树、攀枝花，木棉科木棉属落叶大乔木，高可达25m，树皮灰白色，树干通常有圆锥状的粗刺；分枝平展。掌状复叶，叶柄长10～20cm，小叶5～7片，长圆形至长圆状披针形，长10～16cm，宽3.5～5.5cm，顶端渐尖，基部阔或渐狭，全缘，两面均无毛，小叶柄长1.5～4cm；托叶小。花单生枝顶叶腋，通常红色，有时橙红色、橙黄色和黄色，直径约10～13cm；花萼杯状，长2～3cm，宽2～3cm；花瓣肉质，倒卵状长圆形，长8～10cm，宽3～4cm；雄蕊管短，基部粗，向上渐细，内轮部分花丝上部分2叉，外轮雄蕊多数，集成5束，每束花丝10枚以上，较长；子房5室，花柱长于雄蕊，棒状，突出，柱头5裂。蒴果长圆形，长10～15cm，宽4.5～8cm，密被灰白色长柔毛；种子多数，倒卵形，光滑。花期3～4月，果夏季成熟。

木棉产于广东、广西、海南、香港、四川、云南、贵州、中国台湾、福建等省区，南亚、东南亚和澳大利亚北部。喜光，深根性，耐干旱，喜暖热气候；生于海拔1400～1700m以下的干热河谷及稀树草原，也可生长在沟谷季雨林内。我国南方地区道路、单位绿化和风景林的骨干树种之一，常作行道树、庭荫树和风景树栽培。

木棉树高大雄伟，高耸挺拔，树冠整齐壮丽。春季3～4月，先花后叶，花期长达2个月，盛花时期，满树红色、有时橙红色、橙黄色和黄色等花朵开放，蔚为壮观，加上鸟类或蜜蜂等采蜜，更增添了情趣；单花从始花至凋谢4～5天，花瓣5片，倒卵状长圆形。夏季绿荫如盖，秋冬落叶前叶色变黄。木棉历来被人们视为英雄的象征，是广东广州市和四川攀枝花市等市的市花，我国南方地区优良的行道树、庭荫树和风景树。

木棉是我国南方地区群众喜爱的道路、单位绿化和景观林树种之一，适应范围广，是具有广泛开发应用前景的观赏花卉。但是木棉自然结实既受天气和土壤等生态学特性，又受树龄和长势等生物学特性的影响，自然结实率通常不高。木棉花期长达60天，优良的木棉单株普遍存在花期不遇，靠自然授粉较难以培育出优良新品种。开展人工杂交控制授粉，对基因资源进行重组，是培育木棉优良新品种的主要途径，因此通过花粉活力测定，了解各批次木棉花粉质量，对开展杂交控制授粉配对组合，预测杂交控制授粉的工作量和成功率，节约花粉保存和杂交控制授粉的成本，培育木棉优良新品种具有重要现实意义，可取得良好的社会效益、生态效益和经济效益。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种木棉花粉活力的检测方法。

实现上述发明目的具体技术方案如下：

一种木棉花粉活力的检测方法，包括以下步骤：

(1)花粉收集：采集花蕾，将花粉囊中的花粉于离心管中脱粒，干燥；

(2)培养基的配制：用蒸馏水配制琼脂培养基，其中含硼酸25～50mg/L、蔗糖90～110g/L、琼脂7～9g/L，将培养基装入培养皿待用；

(3)花粉萌发培养：将步骤(1)所得花粉溶于培养液中，形成花粉液，再将花粉液喷到步骤(2)制备的培养基的表面，均匀铺开，恒温、恒光照培养；所述培养液为25～50mg/L的硼酸与90～110g/mL的蔗糖溶液；

(4)花粉活力检测：将培养皿置于倒置显微镜下观察，花粉管长度大于花粉粒直径的花粉视为萌发的花粉，每个培养皿随机选取3-6个不重叠的视野，统计每个培养皿的花粉的数量、萌发的花粉的数量，计算花粉的活力。

在其中一个实施例中，所述花粉收集包括以下步骤：

(1)花蕾采集：3～4月，剪取蕾体饱满、无缺损、大蕾期的木棉花蕾，用封口袋装好，备用；

(2)花粉脱粒：将花瓣先端撕开，从花粉囊下方约0.18～0.22cm处剪断，将花粉囊置于培养皿中，放入硅胶干燥器中干燥，使花粉囊裂开，将裂开的花粉囊装入离心管，于漩涡混合器中振荡，使花粉粒脱离花粉囊而粘在离心管内壁，停止转动，倒掉空花粉囊；

(3)花粉干燥：将粘有花粉的离心管放回硅胶干燥器里干燥。

在其中一些实施例中，所述琼脂培养基含硼酸50mg/L、蔗糖100g/L、琼脂8g/L。

在其中一些实施例中，所述琼脂培养基含硼酸25mg/L、蔗糖100g/L、琼脂8g/L。

在其中一个实施例中，花粉萌发培养步骤中所述培养的时间为2～3h。

在其中一个实施例中，花粉萌发培养步骤中所述培养的温度为23～27℃。

在其中一个实施例中，花粉脱粒步骤中所述干燥的时间为9～10h。

在其中一个实施例中，花粉脱粒步骤中所述漩涡混合器的转速为2700～2900转/分钟。

在其中一个实施例中，花粉脱粒步骤中所述漩涡混合器振荡的时间为2～3分钟。

在其中一个实施例中，花粉干燥步骤中所述干燥为干燥至花粉的相对含水量为20～25％。

在做花粉活力检测时，也可以用染色法，有活力的木棉花粉在0.5％和1％的TTC试剂中均可全部或局部被染成红色或暗红色，没有生命力的花粉呈褐色。但是，在统计花粉活力时，染成暗红色或局部染色的花粉受人为因素影响较大，没有固定培养基法的结果直观，估算控制授粉工作量和成功率存在一定的误差。因此，本发明所述的木棉花粉活力的检测方法与TTC染色法相比结果直观，数据可靠，本发明的方法可在15h内检测出新鲜木棉花粉的活力，对开展杂交控制授粉组合，预测杂交控制授粉的工作量和成功率，节约花粉保存和杂交控制授粉的成本，培育木棉优良新品种具有重要现实意义。

附图说明

图1为木棉花粉活力检测显微镜拍摄图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

本实施例中按以下方法测定木棉花粉的活力：

1花粉收集

1.1花蕾采集

3～4月，当天气晴朗，在优良的木棉单株上剪取蕾体饱满、无缺损、大蕾期的花蕾，用封口袋装好，贴上采集号和采集时间带回实验室备用。

1.2花粉脱粒

用手将花瓣先端撕开，用干净的小剪从花粉囊下方约0.2cm处剪断，花粉囊置于垫有称量纸的培养皿中，放入硅胶干燥器中干燥9～10h，当花粉囊大部分裂开，将花粉囊装进2ml的离心管，盖好离心管的盖子，编号，放在转速为2800转/min的漩涡混合器(海门其贝尔VORTEX-5漩涡混合器)中振荡2～3min，待多数花粉粘在离心管内壁时，停止转动，打开离心管的盖子，倒掉空花粉囊。

1.3花粉干燥

将粘有花粉的离心管放回硅胶干燥器里干燥，并在干燥器内放1个温湿度计，当干燥器中温湿度计的相对含水量约20％时，打开干燥器的盖子，重新盖上离心管的盖子，留3个离心管进行活力测定，其余的用信封装好放入密封袋中，信封上标明采集号、采集时间、采集人员、相对湿度等内容，置于-20度冰箱内保存。

2花粉活力检测

2.1培养基的配制

以配制50mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基为例，培养基的配制包括以下步骤：

(1)用蒸馏水配制好50mg/L的硼酸溶液，待用；

(2)将10g蔗糖放入100ml烧杯内，加入步骤(1)配制的20～30ml硼酸溶液，待蔗糖充分溶解后定容至100ml，配制成50mg/L硼酸+100g/L蔗糖溶液，作为培养液待用；

(3)将0.8g琼脂粉放入250ml的锥形瓶中，然后将步骤(2)配制的培养液100ml倒入锥形瓶中，待琼脂粉充分溶解后，用报纸包住瓶口，并用橡皮筋捆扎。锥形瓶放在微波炉中煮1～2min，间隔30～40s取出摇晃一次，直至煮沸，煮好的培养基在凝固之前倒入9个90mm培养皿中，盖上培养皿的盖子，自然冷却，配制成50mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基，待用。

2.2花粉萌发培养

用移液枪分别吸取300μl2.1制备的培养液到3个装有花粉的离心管，轻轻摇晃，使花粉溶于溶液中，形成花粉液，再用移液枪把每个花粉液分别喷到3个培养基的表面，并用干净的推玻棒将花粉液均匀铺开，盖上培养皿盖子，用封口膜封口，编号，置于25℃人工气候培养箱中恒温、恒光照培养。

2.3花粉活力检测

待花粉萌发后，将培养皿置于100倍倒置显微镜下观察，每个培养皿随机选取3～6个不重叠的视野，用显微镜自带软件拍照(如图1所示)，统计每个培养皿的花粉的数量、萌发的花粉的数量，统计花粉活力，并要求每个培养皿统计的花粉总数100个以上，并计算出此批花粉的活力。计算公式：花粉活力＝萌发的花粉的数量/花粉的数量×100％，计算萌发的花粉的数量时，花粉管长度超过花粉粒直径的花粉则视为萌发的花粉。

3、检测结果

3.1培养基的筛选结果

以相同琼脂浓度，不同的硼酸和蔗糖浓度作培养基，用上述方法收集的编号为混合1号的花粉按上述“2花粉活力检测”所述的方法开展木棉花粉活力测定，结果表明：50mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基活力最高，平均为73.9％，其次是25mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基，平均为69.86％(表1)。

表1木棉花粉培养基试验

3.2花粉萌发培养的时间筛选结果

以2.1配制的50mg/L硼酸+100g/L蔗糖溶液为培养液，以2.1配制的50mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的为培养基，按上述“2花粉活力检测”所述的方法开展花粉活力测定。木棉花粉管长度超过花粉粒直径则视为萌发的花粉；由于花粉萌发存在一定的时间差异，萌发结果显示(表2)，当大部分花粉管长度为花粉粒直径6～8倍时，即培养2～3h为观测花粉萌发的最佳时间，即花粉萌发培养的最佳时间为2～3h。

表2花粉萌发最佳观察时间试验结果

3.3花粉活力检测的结果

用上述方法收集的编号为FS16-13和混合1号的花粉分别在50mg/L硼酸+100g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基用2.2所述的方法培养2～3h，即大部分花粉管长度为花粉粒直径的6～8倍时，以2.3所述方法检测花粉活力，检测结果如表3所示。

表3固体萌发法花粉活力测定结果

4花粉保存

在装有本批次木棉花粉的信封上标明花粉活力、检测时间、检测人员等内容；在-20℃冰箱内保存，如果新鲜花粉活力达76.3％以上，含水量降到20％时，保存半年花粉活力达58.1％以上，保存1年花粉活力仍有51.2％以上(表4)，可满足杂交育种的需求。

表4在-20℃保存条件下花粉活力(％)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。