一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗

摘要

本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。该方案首先构建温控表达载体，电转化入鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆后28℃增菌培养，然后42℃诱导裂解基因的表达，待OD

说明书

技术领域

本发明属于兽用疫苗生产领域，涉及一种鸭用细菌疫苗的制备方法，尤其是涉及一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏菌（Riemerella Anatipestifer, RA）主要侵害2-7周龄雏鸭，以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，是目前危害养鸭生产的主要细菌性传染病之一。该病可通过呼吸道、消化道及皮肤创伤感染，并常常与大肠杆菌、副黏病毒等病原形成混合感染，引起鸭的大批死亡。

鸭疫里默氏菌虽然对一些抗生素敏感，但机体内难以完全清除；同时由于抗生素的不合理使用，其耐药性日益普遍，一方面加大了抗生素治疗的难度，另一方面往往导致禽产品的药物残留问题日益突出。防控该病的科学方法，是在强化饲养管理的基础上，接种适宜的鸭疫里默氏菌疫苗。

目前关于鸭疫里默氏菌的疫苗方面已经有一些研究报道，例如，鸭疫里默氏菌灭活苗、二价复合佐剂灭活疫苗等。细菌经过灭活，其细胞表面的结构往往被破坏而影响抗原性，不能刺激机体产生较为全面的保护。近年来，疫苗制备方面开展了新型菌影（或菌蜕、鬼影）的许多研究，解决了保持细菌外表完整性的问题。该方面的研究在鸭疫里默氏菌也有一些报道，证实利用该方法制备的菌影疫苗具有较高的保护率。动物的主要感染途径是呼吸道和消化道，呼吸道、消化道表面的黏膜免疫屏障（以分泌型免疫球蛋白SIgA为代表）是抵御病原感染的第一道屏障。由于鸭疫里默氏菌制备成菌影后基本丧失了在呼吸道的定殖能力，所以不能产生局部免疫，只能通过注射免疫动物，因而仍然存在以下几方面的问题：①通过注射免疫，给动物造成很大的免疫应激，往往引起副黏病毒、大肠杆菌乘虚而入，导致严重的继发感染。②灭活苗只能引起体液免疫，不产生或仅产生轻微局部黏膜免疫，不能提供可靠的抵抗感染的黏膜免疫屏障。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。本发明所提供的技术方案对有效防治鸭疫里默氏菌感染，以及减少家禽养殖过程中抗菌药物的使用、减少药物残留等具有重要意义。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：

选择本实验室鉴定保存的2型鸭疫里默氏菌临床分离株（编号为WF1）作为基础菌株。冷冻保存的菌种复苏后，按常规试验方法制备成原生质体备用。

 利用常规分子生物学技术，将噬菌体PhiX174的E基因（简称E）与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因序列（SN）通过 15 个柔性氨基酸串联为E-SN双基因，然后与温控表达载体pBV220连接，构建温控表达载体pBV-E-SN。将该表达载体按常规试验方法电转化前述制备的鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆得到鸭疫里默氏菌工程菌。

将得到的鸭疫里默氏菌工程菌常规方法28℃增菌培养，生长至OD₆₀₀至0.6~0.7时迅速升温至42℃诱导裂解基因的表达。当OD₆₀₀不再降低时，降温至37℃于菌影中按9:1的比例加入10μg/mL的聚赖氨酸在37℃条件下作用24h，以充分灭活残存的活菌而不破坏其表面结构。菌体抽样，稀释后涂平板检测，无活菌生长的判定为合格。然后离心分离菌体，冷冻干燥。

干燥菌体按1：1（w/v）的比例加入到按常规方法配制的浓度为6mg/mL的聚肌胞溶液中，搅拌成菌泥初步溶胀6h，使聚肌胞包埋进入菌影内。

壳寡糖配制成2%（w/v）的水溶液，将上述经过溶胀的菌泥按2：8的比例加入，充分搅拌形成均一混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。

疫苗使用前，加生理盐水适当稀释，饮水免疫雏鸭。由于菌影被带正电荷的壳寡糖所包裹，可以较紧密地吸附于消化道黏膜表面，便于被树突状细胞捕获，发生抗原递呈而刺激黏膜免疫反应，而且壳聚糖作为载体具有保护抗原免除降解和缓释作用；另一方面，抗原加工过程中，菌影包含的聚肌胞苷酸被释放，刺激机体内源性干扰素水平升高，提高了机体免疫力，尤其是增强了对病毒性病原的抵御能力。

与现有技术相比，本发明涉及的利用温控裂解基因制备鸭疫里默氏菌菌影疫苗具有如下优点和显著进步：

① 本发明所提供的鸭疫里默氏菌菌影疫苗，通过饮水免疫，避免了注射免疫的应激；免疫不仅可以刺激机体产生对鸭疫里默氏菌的抗体，还可引起机体内源性干扰素水平升高，防止病毒性感染的发生。

② 传统灭活疫苗以及目前所报道的有关鸭疫里默氏菌菌影疫苗，通过注射免疫，只能引起体液免疫反应，保护效果有一定局限性。本发明所提供的技术方案，一方面刺激呼吸道和消化道局部的黏膜免疫反应，为抵御鸭疫里默氏菌的侵染提供第一道免疫防御屏障；另一方面，壳寡糖可以促进菌影透过黏膜进入体内，刺激机体的体液免疫，从而提供较全面的免疫保护。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施实例一  鸭疫里默氏菌菌影的制备

1.1 原生质体的制备：将编号为WF1的RA2型菌株活化后，培养至OD₆₀₀为0.7时，将菌液置于冰水浴中30min，取10mL菌液，4℃, 5000rpm离心10min，弃上清，用10mL冰水浴灭菌水洗涤菌泥，再次离心，如此重复洗涤三次。再用冰水浴高渗缓冲液悬浮，加入预热的溶菌酶溶液至5mg/mL，37℃水浴30min后，再加入预热的EDTA溶液至0.01mol/L，37℃水浴20min。作用过程中，每隔5min取处理的菌液于载玻片上，复红染色，油镜下观察原生质体的生成情况。当原生质体的形成率达到95%以上时，5000rpm离心20min，弃上清，再加入改良TSB液体再生培养基离心洗涤3次，弃上清。最后将原生质体用改良TSB液体再生培养基悬浮。

 1.2温控表达载体的构建：将噬菌体PhiX174 裂解蛋白E基因序列（E，GI:9626372）与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因序列（SN，GI:21281729）通过 15 个柔性氨基酸linker(G₄S)₃串联为E-SN双基因，转入克隆载体PMD19T-simple中，构建重组克隆载体pMD-E-SN。然后用ECORⅠ和PSTⅠ分别对温控表达载体pBV220和重组克隆载体pMD-E -SN进行双酶切和连接，构建重组温控表达载体pBV-E-SN。

 1.3电转化及阳性克隆的筛选：取10μL溶菌质粒加入40μL 制备好的原生质体细胞中，小心混匀，冰上放置5min后移入0.1cm的电击杯中。电参设置为:15Kv/cm，50μFd，150Ω，5ms，进行电击转化。电击后，立即往电击杯中加入960μL TSB再生培养基，将菌液转移至灭菌1.5mL离心管中，28℃，150r/min摇菌2h。离心菌液，弃掉800μL上清，用剩余液体重悬菌体，与冷至45℃的TSB再生软琼脂培养基(35μg /mL Amp+)混匀，倾入到TSB再生固体培养基(35μg/mL Amp+)上面，28℃培养。挑取平板上长出的单菌落，接种到含Amp+ (100μL/mL)的TSB液体培养基的试管中，28℃振摇培养过夜，通过菌液PCR鉴定为阳性。

 1.4菌影疫苗的生产：以1:100比例将小摇菌液接种200mL含Amp+抗性的新鲜TSB培养基中，混匀，取适量菌液测摇菌培养前的OD₆₀₀，然后28℃振摇培养，每隔1h测OD₆₀₀，待OD₆₀₀为0.6时，42℃升温诱导。42℃升温后，仍然每隔1h测OD₆₀₀，并取适量菌液做好时间标记保存，直至OD₆₀₀值不再下降，然后按9:1的比例加入10μg/mL的聚赖氨酸在37℃条件下继续作用24h。然后取菌液100μL涂布平板， 37℃培养16-20h，观察有无细菌生长。将无菌检查合格菌影根据OD₆₀₀值调整浓度，使菌影含量达到5×10¹⁰cfμ/mL，干燥菌体按1:1（w/v）的比例加入到按常规方法配制的浓度为6mg/mL的聚肌胞溶液中，搅拌成菌泥初步溶胀6h，使聚肌胞包埋进入菌影内。壳寡糖配制成2%（w/v）的水溶液，将上述经过溶胀的菌泥按2:8的比例加入，充分搅拌形成均一的混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌菌影壳寡糖佐剂疫苗。

实施实例二  疫苗免疫保护试验

为了验证本发明制备的菌影疫苗对鸭的临床保护效果，选择樱桃谷商品肉鸭作为实验动物，将菌影疫苗分别通过加入不同的佐剂，以不同的免疫途径进行接种，同时进行传统甲醛灭活方法制备的同源株油佐剂苗的对照试验。通过抗体水平检测和攻毒保护率的对比试验评价其免疫保护效果。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

菌影+壳聚糖佐剂：按实施实例1.4所述方法制备。

菌影+油佐剂：将前述制备的RA2型菌株(WF2)与矿物油佐剂按照1:1比例混合，使菌数含量达到5×10¹⁰ cfμ/mL。

甲醛灭活苗+油佐剂：甲醛灭活的RA2型菌株(WF2)与矿物油佐剂按照1:1比例混合，使菌数含量达到5×10⁹ cfμ/mL。

实验动物：1日龄樱桃谷商品肉鸭。

1.2 试验方法

1.2.1 试验方案

经检测为RA阴性的健康1日龄樱桃谷商品肉鸭50羽，饲养至5日龄，随机分为5组分别进行免疫。免疫后2周进行同型RA(WF1)腿部肌肉攻毒并观察一周，攻毒剂量根据预试验结果确定。分组免疫及攻毒情况见表1。

表1 疫苗免疫保护效果

1.2.2 抗体水平检测

将2型RA超声裂解上清作为包被抗原包被酶标板，检测每周采血分离的血清抗体的消长规律。

2. 试验结果

2.1 攻毒试验结果

攻毒结果显示：在攻毒后48h，未免疫攻毒组开始出现死亡，发病鸭死亡前均有神经症状，死后呈角弓反张姿势，剖检可见肝脾肿大，脑膜充血，并能从上述组织中分离到攻毒菌株。在一周观察期内，未免疫攻毒组10只鸭有8只发病死亡，剩下2只鸭生长缓慢；甲醛灭活苗免疫组有2只鸭出现扭颈的神经症状但未死亡；通过饮水免疫途径的菌影疫苗组出现1只鸭发病但未死亡，随后的饲养过程中形成僵鸭；而注射途径的菌影疫苗免疫组均未出现发病死亡的情况；未免疫未攻毒组鸭均健康存活。表明制备的RA2型菌影疫苗不论通过注射还是饮水途径对易感鸭均具有良好的保护效果。

2.2 抗体消长规律

疫苗免疫后4周内，抗体水平持续上升，4周达到高峰，到免疫后5周仍维持较高的水平。其中菌影+油佐剂免疫组与甲醛灭活苗+油佐剂免疫组诱导机体产生的抗体水平相当。而菌影+壳聚糖佐剂免疫组在每个阶段的抗体水平均低于注射免疫组的抗体水平（图1），究其原因，可能是饮水免疫途径产生的抗体主要是黏膜抗体，而采用ELISA方法检测的主要是循环抗体。但从免疫后2周的攻毒结果来看，饮水免疫途径提供的保护效果与注射途径并无显著差异。

附图说明

说明书附图1显示了鸭疫里默氏菌灭活苗及菌影疫苗不同免疫途径在免疫樱桃谷商品肉鸭后5周内的抗体动态变化。