基于拉曼光谱生鲜猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于拉曼光谱生鲜猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测方法，涉及畜肉品质与安全检测技术领域。本方法是：①测定肌苷酸标准品拉曼光谱；②获取生鲜猪肉样本拉曼光谱；③利用化学法测定肌苷酸含量；④进行拉曼光谱校正；⑤优选肌苷酸特征峰；⑥计算特征拉曼峰面积；⑦建立肌苷酸含量的检测模型。本发明通过显微共焦拉曼光谱技术对生鲜猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测，寻找到一种有效、操作简单、花费及耗时较少的猪肉鲜味物质肌苷酸快速检测方法；该检测方法简单、安全和高效，可以适应产业化生产需要和消费者对产品质量的要求，满足在实际生产加工过程中猪肉产品风味品质的评价需要。

说明书

技术领域

本发明涉及畜肉产品品质与安全检测技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱生鲜猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测方法。

背景技术

猪肉味道鲜美，营养丰富和易于被人体消化吸收的特点，一直深受人们的喜爱。、我国是世界猪肉生产第一大国，自1972年至今，猪肉产量一直位居世界第一。猪肉及其肉制品同时也是我国居民的主要肉食品和我国农户收入的重要来源，在国民经济中占有相当重要的地位；对于改善人民生活，增加农民收入，保证社会稳定起到了重要的作用，因此，猪肉产品一直受到社会各界广泛关注。随着人民生活水平的不断提高，消费观念逐步从数量型向质量型转变，不仅要求其数量充足，而且更关心其品种和内在质量安全，包括风味、营养成分、瘦肉率和有毒有害物质的含量等。

肌苷酸，又称次黄嘌呤核苷酸（Inosine Monophosphate，IMP），是动物体内物质ATP代谢过程中的中间产物，广泛分布于体内，在活体中具有生物活性，参与调节生物能量代谢，处于动态平衡。研究表明，肌苷酸是肉中的主要鲜味物质，同时其降解产物核糖或5'-磷酸核糖在加热过程中与氨基酸发生美拉德反应，可产生多种挥发性风味化合物，因此，肌苷酸还是产生肉香味的重要前体物。可见，肉品中肌苷酸的含量对肉的滋味和香味有重要影响。

传统的猪肉肌苷酸含量检测方法主要有毛细管电泳法、薄层层析法和高效液相色谱法（HPLC）。毛细管电泳法存在分离度偏低、肌苷和腺苷单磷酸等相似物质的干扰问题；薄层层析法操作步骤繁琐、耗时长。HPLC方法较上述2种方法相对简单、测定精确，但仍然耗时耗力，难以实现在线检测，需要利用高腐蚀性化学试剂进行样本前处理工作，既对环境造成污染又不不能满足猪肉品质无损检测和实时分级的产业化发展需求。

光谱检测技术由于避免了传统化学方法破坏性、化学试剂污染和耗时耗力等缺点，在生鲜肉品质检测和安全评定上得到广泛应用，主要体现在生鲜肉的营养成分分析、食用品质检测与分级、品种鉴定与判断以及安全性评价等方面。肉类IMP鲜味物质光谱检测研究过程中主要存在信号难获取以及具有IMP相似基团其他物质会对IMP特征光谱产生干扰等问题，难以实现定量研究。近年来，随着拉曼光谱学、仪器学、化学计量学和激光技术的不断发展，各种拉曼光谱增强手段使得拉曼光谱技术的应用范围日益广泛，在肉类品质检验方面的应用也开始逐步增多。拉曼光谱具有快速、无损、环保以及水或醇溶液干扰小等特点，特别有利于生物样本组织的检测。猪肉样本和肌苷酸标准品对比拉曼光谱中显示出猪肉样本中包含有丰富的信息和比较明显匹配的谱峰。因此，采用该技术对猪肉IMP进行快速检测分析具有可行性，利用优选的光谱特征变量建立对肌苷酸的预测模型，计算速度快，准确率较高，可以满足对猪肉肌苷酸快速检测的要求。

发明内容

本发明的目的是为了解决猪肉风味品质难以评价问题，和基于传统化学检测方法检测过程中难以快速大规模检测肌苷酸含量等难题，提供一种基于拉曼光谱生鲜猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测方法。

本发明的目的是这样实现的：

通过优化拉曼光谱、比对肌苷酸标准品和生鲜猪肉样本拉曼光谱，优选特征拉曼峰，对猪肉肌苷酸建立预测模型，提高检测速度和效率。

具体地说，本方法包括下列步骤：

①测定肌苷酸标准品拉曼光谱

采用显微共焦拉曼光谱仪检测肌苷酸标准品拉曼谱图，设定激光波长633nm，激光功率为17mW，曝光时间为5s，扫描次数平均值为3次，采集得到肌苷酸标准品拉曼光谱，拉曼光谱范围为1000-4000cm^-1；

②获取生鲜猪肉样本拉曼光谱

活猪宰杀分割后6h，取猪肉背最长肌肉，采用切片机根据猪肉纹理切取1mm厚薄均匀的猪肉切片样本置于载玻片上，放置在显微拉曼光谱仪载物台后选择自动调节焦距调整显微拉曼激光探头，使样本位于探头正下方，多点采集样本测量点，设定激光输出功率为17mW，激光波长为633nm，曝光时间为5s，扫描次数平均值为3次，获取生鲜猪肉拉曼光谱；

③利用化学法测定肌苷酸含量

按照国标GB/T19676-2005所述高效液相色谱法测定肌苷酸含量；

④进行拉曼光谱校正

在Reinshaw软件中去除样本拉曼谱线中宇宙射线无关谱峰及Baseline基线校正后，将同一切片样本不同采样点采集光谱以水的特征频谱作为内标进行校正由于同一切片采样微区含水量相等，则水的特征拉曼峰也应相等，由此校正由于光强不稳定及人工对焦差异等造成的光谱差异；

⑤优选肌苷酸特征峰

对比分析IMP标准品及猪肉样本拉曼光谱，分析猪肉拉曼光谱中IMP的拉曼光谱特征峰位置，通过对比可以得出1322.31、2620.83、2645.46、2935.54、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1附近均比较明显匹配的拉曼峰；

⑥计算特征拉曼峰面积

将校正后的拉曼光谱在Matlab软件中经Savitzky-Golay平滑处理之后，针对优选后的拉曼特征峰通过积分求拉曼光谱图中相应曲线段的面积即为特征拉曼峰面积；

⑦建立肌苷酸含量的检测模型

利用特征拉曼峰面积对肌苷酸含量建立肌苷酸定量检测模型，利用预测值和真实值相关系数及校正集均方根误差评价检测模型的准确度。

本发明具有下列优点和积极效果：

通过显微拉曼光谱技术对猪肉中鲜味物质肌苷酸的快速检测，寻找到一种有效、操作简单、花费及耗时较少的猪肉鲜味物质肌苷酸快速检测方法；

该检测方法简单、安全和高效，可以适应产业化生产需要和消费者对产品质量的要求，满足在实际生产加工过程中猪肉产品风味品质和新鲜度的评价需要。

附图说明

图1是本方法的工作流程图；

图2是肌苷酸标准品拉曼光谱和生鲜猪肉平均拉曼光谱对比图（波数范围：1000-4000cm^-1）；

图3是肌苷酸标准品拉曼光谱和生鲜猪肉平均拉曼光谱对比图（波数范围：2600-4000cm^-1）；

图4是肌苷酸标准品拉曼光谱和生鲜猪肉平均拉曼光谱对比图（波数范围：1000-2000cm^-1）；

图5是生鲜猪肉特征拉曼峰面积计算示意图（波数范围：2600-4000cm^-1）；

图6是生鲜猪肉特征拉曼峰面积计算示意图（波数范围：1000-2000cm^-1）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

一、方法

如图1，本方法包括下列步骤：

①测定肌苷酸标准品拉曼光谱1；

②获取生鲜猪肉样本拉曼光谱2；

③利用化学法测定肌苷酸含量3；

④进行拉曼光谱校正4；

⑤优选肌苷酸特征峰5；

⑥计算特征拉曼峰面积6；

⑦建立肌苷酸含量的检测模型7。

二、实施例

1、实施例1：市售当日新鲜猪肉肌苷酸含量的检测

A、测定肌苷酸标准品拉曼光谱

采用Renishaw公司InVia型显微共焦拉曼光谱仪检测肌苷酸标准品拉曼谱图，激光波长633nm，激光功率17mW，曝光时间5s，扫描次数平均值3次，采集得到肌苷酸标准品拉曼光谱，拉曼光谱范围1000-4000cm^-1；

B、获取市售当日新鲜猪肉样本拉曼光谱

取猪肉背最长肌肉，采用切片机根据猪肉纹理切取1mm薄厚均匀的猪肉切片样本，将样本置于载玻片放置在显微拉曼光谱仪载物台，选择自动调节焦距调整显微拉曼激光探头，使样本位于探头正下方，多点采集样本测量点。激光输出功率为17mW，激光波长633nm，设置曝光时间为5s，扫描次数平均值为3次，获取猪肉拉曼光谱；

C、利用高效液相色谱法测定肌苷酸含量

按照国标GB/T19676-2005所述高效液相色谱法测定肌苷酸含量在1.42-2.13mg/g；

D、进行拉曼光谱校正

在Reinshaw软件中去除样本拉曼谱线中宇宙射线等无关谱峰及Baseline基线校正后，将同一切片样本不同采样点采集光谱以水的特征频谱作为内标进行校正，同一切片采样微区含水量相等，校正由于样本表面不均匀及人工对焦差异等造成的光谱差异；

E、优选肌苷酸特征峰

对比分析IMP标准品及猪肉样本拉曼光谱，分析猪肉拉曼光谱中IMP的拉曼光谱特征峰位置。通过对比可以得出1322.31、2620.83、2645.46、2935.54、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1明显匹配的拉曼峰作为特征峰；

F、计算特征拉曼峰面积

将拉曼曲线在Matlab软件中经Savitzky-Golay平滑处理之后，针对优选后的特征拉曼峰通过积分求图中相应曲线段的面积即为特征拉曼峰面积；

G、建立肌苷酸含量的定量检测模型

利用特征拉曼峰面积对肌苷酸含量建立肌苷酸定量检测模型（公式1），拉曼特征峰面积代入公式1即可得到肌苷酸含量：

Y=1.780+0.055A₁+0.276A₂+0.115A₃-0.172A₄-0.013A₅+0.391A₆-0.382A₇

其中，Y为肌苷酸含量（mg/g），A₁-A₇分别代表1322.31、2620.83、2645.46、2935.54、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1处的峰面积，预测值和真实值相关系数达到0.968，预测集均方根误差RMSEP=0.0607mg/g，准确度较高。

2、实施例2：活猪宰杀后放置不同时间猪肉中肌苷酸含量的检测

a、测定肌苷酸标准品拉曼光谱

采用Renishaw公司InVia型显微共焦拉曼光谱仪检测肌苷酸标准品拉曼谱图，激光波长633nm，激光功率17mW，曝光时间5s，扫描次数平均值3次，采集得到肌苷酸标准品拉曼光谱，拉曼光谱频率范围1000-4000cm^-1；

b、获取猪肉样本拉曼光谱

活猪宰杀清洗后室温下（20±1℃）放置，分别于在0、1、2、3、4、6、12、24 h分别测定IMP含量，采用切片机根据猪肉纹理切取1mm薄厚均匀的猪肉切片样本，将样本置于载玻片放置在显微拉曼光谱仪载物台，选择自动调节焦距调整显微拉曼激光探头，使样本位于探头正下方，多点采集样本测量点。激光输出功率为17mW，激光波长633nm，设置曝光时间为5s，扫描次数平均值为3次，获取猪肉拉曼光谱；

c、利用高效液相色谱法测定肌苷酸含量

按照国标GB/T19676-2005所述高效液相色谱法测定肌苷酸含量在0.08-2.34mg/g；

d、进行拉曼光谱校正

在Reinshaw软件中去除样本拉曼谱线中宇宙射线等无关谱峰及Baseline基线校正后，将同一切片样本不同采样点采集光谱以水的特征频谱作为内标进行校正，同一切片采样微区含水量相等，校正由于样本表面不均匀及人工对焦差异等造成的光谱差异；

e、优选肌苷酸特征峰

对比分析IMP标准品及猪肉样本拉曼光谱，分析猪肉拉曼光谱中IMP的拉曼光谱特征峰位置。通过对比可以得出1322.31、2620.83、2645.46、2935.54、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1明显匹配的拉曼峰作为特征峰；

f、计算特征拉曼峰面积

将拉曼光谱曲线经Savitzky-Golay平滑处理之后通过积分求图中相应曲线段的面积即为特征拉曼峰面积；

g、建立肌苷酸含量的定量检测模型

利用特征拉曼峰面积对肌苷酸含量建立肌苷酸定量检测模型（公式2），特征拉曼峰面积代入公式2即可得到肌苷酸含量：

Y=4.215-0.348A₁-0.216A₂+0.296A₃-0.003A₄+1.024A₅+0.246A₆+0.236A₇

其中，Y为肌苷酸含量（mg/g），A₁-A₇分别代表1322.31、2620.83、2645.46、2935.54、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1处的峰面积，预测值和真实值相关系数达到0.996，预测集均方根误差RMSEP=0.0686mg/g，准确度较高。

三、实施结果

由图2可看出：

对比肌苷酸纯物质标准品和所获取的生鲜猪肉样本拉曼信息，光谱信息清晰，匹配的峰位较多，可以看出按照步骤1所述条件可以有效获取生鲜猪肉样本中肌苷酸的拉曼特征信息。

由图3可看出：

2600-4000cm^-1波段范围内优选出6个与生鲜猪肉样本中肌苷酸含量密切相关特征拉曼峰，分别是2620.83、2645.46、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1。

由图4可看出：

1000-2000cm^-1波段范围内优选出1个与生鲜猪肉样本中肌苷酸含量密切相关特征拉曼峰为1322.31cm^-1。

由图5可看出：

拉曼光谱曲线经Savitzky-Golay平滑处理之后，曲线比原始光谱曲线平滑便于特征拉曼峰面积的计算，图中黑色部分即为通过积分求得的2620.83、2645.46、3591.40、3699.87和3750.74cm^-1位置的特征拉曼峰峰面积范围。

由图6可看出：

拉曼光谱曲线经Savitzky-Golay平滑处理之后，曲线比原始光谱曲线平滑便于特征拉曼峰面积的计算，图中黑色部分即为通过积分求得的1322.31cm^-1位置的特征拉曼峰峰面积范围。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。