Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法

摘要

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法。本发明提供了Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。本发明通过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促进间充质干细胞的增殖，本发明还提供了培养间充质干细胞的培养基和培养方法，实验表明，经培养五代后，与未添加Y-27632的对照组相比，添加Y-27632的实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31.87％；羊膜间充质干细胞的数量提高30％，骨髓间充质干细胞的数量提高27.27％。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y-27632在间充质干细胞培养中的 应用及间充质干细胞的培养方法。

背景技术

ROCK信号通路抑制剂Y-27632的CAS NO.为146986-50-7，分子式为 C₁₄H₂₁N₃O·HCl，相对分子量为320.3，是一种高效的Rho相关的卷曲蛋白形 成丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(ROCK)家族的小分子特异性抑制剂，能选择性 的抑制ROCK1(p160ROCK)和ROCK2，IC₅₀(半数有效浓度)值分别为140nmol 和800nmol；并且，Y-27632也抑制PRK2，其IC₅₀为600nmol/L。其抑制作用 是通过与ATP竞争结合催化位点来实现的.现有技术表明，Y-27632的功能主要 包括以下几个方面：1、选择性的抑制平滑肌钙离子敏感性并阻断其收缩，阻 止Rho诱导的、p160ROCK介导的细胞张力纤维的形成；2、降低几种高血压 大鼠模型的血压；3、保护艾氏腹水癌小鼠免于肿瘤的形成；4、阻止肝癌肝 内转移。

人间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是具有明显可塑性和多 向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3 个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细 胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不 表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性 低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人羊膜间充质干细 胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作 用，在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研究应用中具有重要意义。

人间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺 等组织以及羊水、脐带血中。目前，骨髓间充质干细胞的应用最为广泛。不 同来源的干细胞的生物学特征存在相似之处，例如，都成纤维样形态生长， 具有强大的体外扩增能力，都能像不同的组织分化。但是，不同来源的干细 胞之间生物学特征还存在着差异：

骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMMSC) 志物除表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族。

人羊膜间充质干细胞(human amnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC), 来源于胎盘的羊膜组织的间质层，形态学类似于骨髓间充质干细胞。hAMSC 的表面标志物除表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族外，还表达胚胎 干细胞类的表面标志物，这些因子的阳性表达说明hAMSC的增殖能力比 BMMSC要强。hAMSC不表达HLA-DR、CD14，弱表达HLA-ABC，且不表达 共刺激银子，CD80、CD83、CD86、CD40L，这表明hAMSC具有较低的免疫 原性。且研究表明，hAMSC能表达多种比骨髓源MSC表达更丰富的造血细胞 因子，例如：IL3细胞因子。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesnchymal stem cells，MSCs) 是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，增殖能力优于骨髓 MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低。研究表明，分离后的脐带血淋巴细胞和单 核细胞百分比分别为60.56％和17.93％，明显多于骨髓血46.75％和10.70％。分 离后脐血干细胞的CD34、CD38明显多于骨髓血干细胞，分别为5.7:1.6和 2.4:1.6。

目前对人MSC的培养基主要采用基础培养基(如DMEM/F12)联合胎牛 血清(FBS)，但存在细胞增殖速度慢的特性。并且，异源血清的食用存在污 染外源病毒和致病因子的风险。因此，进一步开发不采用异源血清而能保证 细胞增殖速度和干性的培养方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供Y-27632在间充质干细胞 培养中的应用及间充质干细胞的培养方法，本发明提供的方法不采用异源血 清，而使用Y-27632促进MSC的增殖，从而实现在无血清条件下MSC的快 速稳定增殖，且能够保持良好的干性。

本发明提供了Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。

本发明通过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促 进间充质干细胞的增殖，实验表明，经培养五代后，与未添加Y-27632的对 照组相比，添加Y-27632的实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31.87％； 羊膜间充质干细胞的数量提高30％，骨髓间充质干细胞的数量提高27.27％。

在本发明的实施例中，间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞、人脐带间 充质干细胞或人羊膜间充质干细胞。

在本发明的实施例中，Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的剂量为1 ng/mL～100ng/mL。

在一些实施例中，Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的剂量为10 ng/mL。

本发明提供的实施例表明，采用1g/mL～100g/mL的Y-27632作为间充质 干细胞增殖促进剂能够很好的促进间充质干细胞的增殖，但当浓度达到 10nmol/mL时，虽然仍能起到促进细胞增殖的作用，但细胞的干性出现下降。

因此，本发明还提供了一种间充质干细胞的培养基，包括lonza完全培养 基和Y-27632；Y-27632的浓度为1ng/mL～100ng/mL。

在一些实施例中，本发明提供的间充质干细胞的培养基中Y-27632的浓 度为10ng/mL。

lonza完全培养基是一种一样丰富的无血清培养基，其中以无血清培养基 Lonza UltraCULTURETM为基质，添加血清替代物PALL Ultroser G。能够给 细胞提供丰富的营养，使细胞快速、稳定增长。

本发明还提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括：将原代间充质干 细胞接种于本发明提供的培养基中，经培养获得P1代间充质干细胞后传代。

在本发明的实施例中，接种的密度为5000个/cm²。

在本发明的实施例中，培养的条件为37℃，5％CO₂，95％湿度。

在本发明的实施例中，培养的时间为3天。

在本发明的实施例中，传代的次数为5次。

经传代5次，细胞数量能够达到1.2×10⁷。能够满足大部分常规实验的要 求。若仍需更大量的细胞数量，可进一步传代培养，通常经传代10代，细 胞仍保持良好的干性及旺盛的增殖能力。

在本发明的实施例中，间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞、人脐带间 充质干细胞或人羊膜间充质干细胞。

本发明提供了Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。本发明通 过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促进间充质干细 胞的增殖，本发明还提供了培养间充质干细胞的培养基和培养方法，实验表 明，经培养五代后，与未添加Y-27632的对照组相比，添加Y-27632的实验组 中，脐带间充质干细胞的数量提高31.87％；羊膜间充质干细胞的数量提高 30％，骨髓间充质干细胞的数量提高27.27％。

附图说明

图1-a示采用培养基1培养脐带MSC 5代后的的流式检测图；

图1-b示采用培养基3培养脐带MSC 5代后的的流式检测图；

图1-c示采用培养基1培养脐带MSC10代的细胞增殖曲线；

图1-d示采用培养基1养脐带MSC10代后的流式检测图；

图1-e示采用培养基1养脐带MSC10代后的的流式检测图；

图2-a示采用培养基1培养羊膜MSC的流式检测图；

图2-b示采用培养基3培养羊膜MSC的流式检测图；

图3-a示采用培养基1培养骨髓MSC的流式检测图；

图3-b示采用培养基3培养骨髓MSC的流式检测图。

具体实施方式

本发明提供了Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的 培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特 别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见 的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的 方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

Y-28632购自美国StemRD公司；

Y-28632用DMSO溶解，配成10μg/mL的保存液，置于4℃冰箱保存。

培养基的配制：

培养基1：lonza完全培养基+Y-28632(10ng/ml)

培养基2：lonza完全培养基

培养基3：lonza完全培养基+Y-28632(10nmol/ml)

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

以不同的培养基培养脐带MSC，考察Y-28632对脐带MSC的增殖促进 作用。方法：

将P1代人脐带MSC以5000个/cm²的密度种植于六孔板上，分别用培养 基1～3培养，每3天将细胞用0.25％胰酶消化下来，计算细胞量，并以5000 个/cm²的密度再次接种培养，直至P5代，记录每个代次的细胞收获量，结果 如表1。

表1 脐带MSC数量

结果显示，培养基1所培养的细胞增殖速率显著(P<0.05)大于培养基2， 这说明Y-28632对脐带MSC有明显的促进增殖作用。

传代5次后，收集细胞进行流式细胞检测，结果如图1-a～图1-b所示。

采用培养基1培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105表达量分别为 99.1％、99.3％，而采用培养基3培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105 表达量分别为91.5％、94.3％。结果显示，过量的Y-28632使细胞干性下降。

以培养基1培养脐带间充质干细胞，传代10次，绘制生长曲线如图1-c 所示，并于传代10次后，收集细胞进行流式细胞检测，结果如图1-d～图1-e 所示。结果显示，细胞经传代10次，增殖依旧旺盛，CD90、CD105表达量 分别为99.1％、99.9％，干性良好。

实施例2

以不同的培养基培养羊膜MSC，考察Y-28632对羊膜MSC的增殖促进 作用。方法：

将P1代人羊膜MSC以5000个/cm²的密度种植于六孔板上，分别用培养 基1～3培养，每3天将细胞用0.25％胰酶消化下来，计算细胞量，并以5000 个/cm²的密度再次接种培养，直至P5代，记录每个代次的细胞收获量，结果 如表2。

表2 羊膜MSC数量

结果显示，培养基1所培养的细胞增殖速率显著(P<0.05)大于培养基2， 这说明Y-28632对羊膜MSC有明显的促进增殖作用。

传代5次后，收集细胞进行流式细胞检测，结果如图1-a～图1-b所示。

采用培养基1培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105表达量分别为 98.7％、98.8％，而采用培养基3培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105 表达量分别为92.4％、72.3％。结果显示，过量的Y-28632使细胞干性下降。

实施例3

以不同的培养基培养骨髓MSC，考察Y-28632对骨髓MSC的增殖促进 作用。方法：

将P1代人骨髓MSC以5000个/cm²的密度种植于六孔板上，分别用培养 基1～3培养，每3天将细胞用0.25％胰酶消化下来，计算细胞量，并以5000 个/cm²的密度再次接种培养，直至P5代，记录每个代次的细胞收获量，结果 如表3。

表3 羊膜MSC数量

结果显示，培养基1所培养的细胞增殖速率显著(P<0.05)大于培养基2， 这说明Y-28632对骨髓MSC有明显的促进增殖作用。

传代5次后，收集细胞进行流式细胞检测，结果如图1-a～图1-b所示。

采用培养基1培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105表达量分别为 99.9％、99.7％，而采用培养基3培养的脐带间充质干细胞的CD90、CD105 表达量分别为94.6％、83.1％。结果显示，过量的Y-28632使细胞干性下降。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。