一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法

摘要

本发明涉及动物饲料加工技术领域，特别涉及一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法。该利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，以家禽羽毛为原料，其特征在于，采用以下步骤：（1）羽毛粉的制备；（2）酶解；（3）过滤烘干。本发明工艺简单，且拓宽了工艺适用领域，酶解温度低，pH作用范围广，酶解成本低，酶解效率高，且酶解上清液可溶性蛋白含量较高，同时含有11种含量较高的氨基酸成分，其中苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸为人体必需氨基酸，可以加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，降低了生产成本，提高了综合经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及动物饲料加工技术领域， 特别涉及一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法。

背景技术

羽毛是我国重要的资源之一，产量非常丰富，年产量百万吨以上，是由一种双键结构十分牢固的角蛋白构成，化学成分与一般蛋白质一样，但分子形状与纤维相似，结构紧密坚实，密度大，其本身难以被动物消化吸收，需经过物理或化学方法加工处理后，变为动物可消化吸收的蛋白质。

采用气爆酶解方法制备羽毛蛋白粉，该方法工序复杂，存在安全隐患，另一方面对羽毛粉中的氨基酸的破坏大，制备出的羽毛蛋白粉中的粗蛋白含量达到90%，且只能用作饲料蛋白。本专利申请人在申请号为2014104846137的专利中公开了一种羽毛蛋白粉的制备方法，利用角蛋白酶/中性蛋白酶对羽毛进行复合酶解，其最实用的温度为40度，对实际生产来说能耗偏高；由于角蛋白酶的pH作用范围为7～10，中性蛋白酶的pH作用范围为5.5～8.5，两种酶复合后研究发现最适作用pH为8。两者重叠的作用区域较小，生产中会投入过多的费用用于调节pH，且最适应的酶的添加量为角蛋白酶 0. 0375/ 中性蛋白酶 0. 125 g，用量较高，这些都会增加生产者的生产成本，降低经济效益。除此以外，由于不同的蛋白酶的酶解作用位点有差异，采用角蛋白酶/中性蛋白酶对羽毛进行复合酶解释,并未在酶解液中检测到氨基酸，大大降低了其应用范围。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、生产成本低、酶解率高的利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其特征在于：以家禽羽毛为原料，采用以下步骤：

（1）羽毛粉的制备：将家禽羽毛经清洗、除杂、剪碎、晾干装入烧杯，置入高压蒸汽灭菌锅内120℃灭菌40min，然后经处理、沥干，于恒温干燥箱中80℃干燥12h，最后经粉碎、研磨、过100目筛后得到羽毛粉，干燥保存待用；

（2）酶解：将羽毛粉置于容器中， 1g羽毛粉加入100ml蒸馏水、角蛋白酶0.015-0.0525g/碱性蛋白酶0.0075-0.02652g，其中酶解液的pH为4-12，酶解温度25-50℃，酶解时间4-36h，置于恒温摇床中进行酶解；

（3）过滤烘干：将酶解反应液过滤，测定过滤液可溶性蛋白及氨基酸含量，滤过残渣经烘干后称量待用。

步骤（1）中所述的家禽羽毛为鸡羽毛或鸭羽毛。

优选的，步骤（2）所述的酶解过程，每1g羽毛粉的酶添加量为角蛋白,0.0375g/碱性蛋白酶0.015g，酶解温度为35℃，酶解液pH为12，酶解时间36h。

优选的，步骤（3）中所述的可溶性蛋白的含量的测定采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595nm，计算可溶性蛋白含量（μg/g)及羽毛分解率（％），绘制曲线。

进一步的，步骤（3）中测定体外消化率，测定方法为滤出残渣中添加胃蛋白酶和预制至45℃的酸性水，将其混合物置于45℃恒温摇床中消化16h，将反应液过滤、烘干、称重， 其中，每1g 滤出残渣添加3000单位的胃蛋白酶，酸性水的添加量为 100ml。

本发明的有益效果是：本发明工艺简单，且拓宽了工艺适用领域，酶解温度低，pH作用范围广，酶解成本低，酶解效率高，且酶解上清液可溶性蛋白含量较高，同时含有11种含量较高的氨基酸成分，其中苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸为人体必需氨基酸，可以加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，降低了生产成本，提高了综合经济效益。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图1为本发明的蛋白质含量标准曲线图；

附图2为本发明的酶解温度试验曲线图；

附图3为本发明的酶解液初始pH试验曲线图；

附图4为本发明的复酶添加量试验曲线图；

附图5为本发明的酶解时间试验曲线图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例：

一．材料及方法

材料

鸡及鸭的羽毛（从家禽屠宰厂获得），角蛋白酶：100000U/g（济南诺能生物工程有限公司），碱性蛋白酶:200000U/g（济南诺能生物工程有限公司），1mol/L NaOH溶液，1mol/L HCL溶液，蒸馏水，考马斯亮蓝试剂（称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％乙醇中，加入100mL85％磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL。），蛋白质标准溶液（结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成100μg/mL的蛋白质标准溶液。），胃蛋白酶（蛋白酶实际效价为1：3000）。

2. 主要仪器设备

主要仪器

250mL三角瓶18只，吸量管（10mL)，试管及试管架，容量瓶（50mL),研钵，100目标准筛，滴管，漏斗，滤纸，量筒，移液器（100—1000μl；5ml），大小枪头，比色杯，擦镜纸，玻璃棒，精密pH试纸。

主要设备

    立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI型）（上海申安医疗器械厂）；恒温培养摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）；可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；恒温干燥箱；微量电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Biochrom 30+全自动氨基酸分析仪（百康）。

试验方法及内容

羽毛的预处理及羽毛样品的制备

    从家禽处理厂获得的羽毛样品一般含有许多的血液泥沙等杂质，所以使用前需要清洗除杂，否则会影响试验效果和品质。为了酶解反应更均匀需要把羽毛制成粉末。

羽毛预处理：羽毛→清洗、除杂→剪碎、晾干→装入烧杯→置入高压蒸汽灭菌锅（120℃、40min）→处理→沥干→恒温干燥箱（80℃、12h)→粉碎、研磨、过筛（100目）→羽毛粉→干燥保存待用。

复酶（碱性蛋白酶/角蛋白酶）酶解羽毛粉试验

单因子试验确定复酶酶解最佳条件

     取18只250ml三角瓶，6个处理组，每组3个重复组，每瓶加100ml蒸馏水和1g羽毛粉样品。

A.酶解温度试验：酶添加量角蛋白酶0.030g/ 碱性蛋白酶0.100g，调节pH为7，酶解时间24h，酶解温度分别为25、30、35、40、45、50℃，恒温摇床下反应。

B.酶解液初始pH试验：酶解温度以上次试验为参考，酶添加量角蛋白酶0.030g/ 碱性蛋白酶0.015g，酶解时间24h，酶解液pH分别为4、6、7、8、10、12恒温摇床下反应。

C.酶添加量试验：酶解温度和pH以上次试验为参考，酶添加量分别为角0.015/中0.0075g、角0.0225/0.01125g、角0.030/中0.015g、角0.0375/中0.01875g、角0.045/中0.0225g、角0.0525/中0.02625 g，恒温摇床下反应。

D.酶解时间试验：酶解温度、pH、酶添加量以上次试验为参考，酶解时间分别为4、6、10、12、24、36h，恒温摇床下反应。

每组试验结束后，将酶解反应液过滤，取过滤液测定可溶性蛋白含量，滤过残渣经烘干后称重待用。

可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595nm，计算可溶性蛋白含量（μg/g)及羽毛分解率（％），绘制曲线，如附图1所示。蛋白质含量的计算方法如下：

蛋白质含量：                                                

式中：W-由标准蛋白曲线上查得蛋白质的质量，μg；

      1.0-吸取提取液体积，mL；

      V-提取液总体积，mL；

      m-称取试样质量，g。

羽毛分解率（％）=（羽毛样品干质量—酶解液残渣干质量）/ 羽毛样品干质量×100

3.2.3正交实验验证实验结果

选取酶解温度、酶解液初始pH、酶添加量和酶解时间为观察因素，每个因素取五个水平，设计一个四因素、五水平的试验，选用L25（5⁴）正交进行实验。每次实验取3个250mL三角瓶，都加入1g羽毛粉样品和100mL蒸馏水，相同条件重复三次。按照正交试验确定的最佳酶解参数进行酶降解试验。

3.2.4体外消化率的测定

    根据GB/T 17811-1999《动物蛋白质饲料消化率的测定胃蛋白酶法》，采用酸性水中胃蛋白酶体外消化率的测定方法进行试验。

     试验方法步骤：称取1g酶解羽毛粉残渣→添加胃蛋白酶（按样品1：3000单位加入胃蛋白酶）→加入预热至45℃的酸性水100ml→将三角瓶置于45℃恒温摇床中消化16h→反应液过滤→烘干→称重。

3.3单独角蛋白酶酶解羽毛粉试验

参照复酶（碱性蛋白酶/角蛋白酶）酶解羽毛粉的方法步骤进行试验，只是把使用的复酶换成角蛋白酶进行试验。将实验结果与复酶酶解效果进行对比分析。

3.4酶解液中氨基酸成分的测定

使用Biochrom（百康） 30+全自动氨基酸分析仪对酶解中含有的各种氨基酸进行分析。

二．实验结果及分析

3.1蛋白质含量标准曲线

附图1为蛋白质含量标准曲线图，根据此标准曲线获得蛋白质标准曲线方程为y=0.0043x+0.0879,根据方程和测得的数据可以得到可溶性蛋白含量。根据数据制作数据表格和曲线图，分析数据获得实验结果。

3.2单因子试验结果及分析

3.2.1酶解温度试验

可溶性蛋白含量（单位mg/L)

在不同温度条件下进行酶解羽毛粉试验，根据上述表格1制得曲线图如附图2所示，从曲线图可知酶解温度是35℃时，酶解液中可溶性蛋白含量最高，随温度的升高或降低蛋白含量都降低，因此复酶酶解羽毛粉的最适温度为35℃。

3.2.2酶解初始pH试验

可溶性蛋白含量（单位mg/L)

   以前次试验确定的温度35℃为参考，在不同pH条件下进行酶解羽毛粉试验，根据上述表格2制得曲线图如附图3所示，从图中可知酶解液初始pH为12时，酶解液中可溶性蛋白含量最高，随pH的升高或降低蛋白含量都降低，因此复酶酶解羽毛粉的最适初始pH为12。

3.2.3酶添加量试验

可溶性蛋白含量（单位mg/L)

以前次试验确定的温度35℃和pH12为参考，在不同的复酶添加量下进行酶解羽毛粉试验，根据上述表格3制得曲线图如附图4所示，从曲线图中可知随酶添加量的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当酶添加量达到角0.0375/中0.015g 时，可溶性蛋白含量达到170.98mg/L,随着酶添加量的增加可溶性蛋白含量上升缓慢。因此复酶酶解羽毛粉的最适酶添加量为角蛋白酶0.0375/碱性蛋白酶0.015 g。

3.2.4酶解时间试验

可溶性蛋白含量测定（单位mg/L）

 

     以前次试验确定的温度、pH和酶添加量条件为参考，在不同的酶解时间下进行试验，根据上述表格4制得曲线图如附图5所示，从曲线图中可以看出随酶解时间的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当酶解时间达到36h时，可溶性蛋白含量为133.9mg/L，随着酶解时间的增加可溶性蛋白含量增加变缓，因此复酶酶解羽毛粉的最适酶解时间为36h。

根据数据分析初步得出最适反应条件为酶解温度是35℃、酶解液初始pH是12、复酶添加量是角蛋白酶0.0375/碱性蛋白酶0.015 g和酶解时间是36h。通过设计正交实验对结果进行验证。

3.3正交实验验证实验结果

3.3.1正交实验结果统计

根据以上试验确定试验因素水平

正交实验设计结果及数据统计

 

根据上表对正交实验结果处理

注：K1：对应的是各因素水平“1”的各组实验结果之和；K2:对应的是各因素水平“2”的各组实验结果之和；K3：对应的是各因素水平“3”的各组实验结果之和；K4：对应的是各因素水平“4”的各组实验结果之和；K5：对应的是各因素水平“5”的各组实验结果之和。极差R对应的哪一因素值最大，影响就最大：反之，影响最小。

3.3.2正交实验结果分析

从表格7中的极差R可以看出，在一定的范围内，对羽毛粉降解影响最大的是酶解液的初始pH，影响力第二的是酶解时间，第三是复酶添加量，影响最小的是酶解温度。酶解温度试验组中k2＞k1＞k3＞k4＞k5,所以酶解温度最适为35℃；用相同的统计原理确定最适的酶解液初始pH为12，最适复酶添加量为角0.0375/碱0.015g，最适酶解时间为36h。酶解液可溶性蛋白含量为494.18mg/L。过滤后残渣烘干备用。

3.4羽毛分解率

在最适反应条件下酶解羽毛粉，酶解液过滤，残渣烘干后称重。在最佳酶解参数下，羽毛分解质量为798mg,即羽毛的分解率达到79.8％。

3.5酶解羽毛粉体外消化率

采用胃蛋白酶盐酸溶液进行体外消化率实验，实验结果结果显示酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到了45％。

酶解羽毛分解率加酶解羽毛粉体外消化率，羽毛的总分解率为88.89%。

酶解液氨基酸成分分析

本发明通过对鸡羽毛粉进行复酶（碱性蛋白酶/角蛋白酶）降解的一系列试验，并经过正交实验验证，得到了复酶降解羽毛粉的最佳工艺条件，采用高温高压预处理与复酶降解的最适宜工艺条件为：鸡羽毛经120℃高温高压处理40min，80℃烘干、粉碎、过筛，每克羽毛粉加入角蛋白酶0.03/碱性蛋白酶0.015g,酶解液初始pH为12，在35℃下酶解36h。羽毛分解率达到79.8%，酶解液可溶性蛋白含量为494.18mg/L，酶解上清液中富含各种氨基酸；酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到了45％ 。羽毛的总分解率为88.89%。显示了具有很好的酶解效果。酶解上清液中可溶性蛋白含量较高和酶解羽毛蛋白粉较高的胃蛋白酶消化率，可以加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白。

酶解鸭毛的实验

将以鸡毛为原料进行酶解研究后得到的最适酶解条件应用于鸭毛的酶解，得到结果：鸭羽毛分解率80.5%，可溶性蛋白含量411.69mgL。

综上所述，该酶解方法可广泛应用于包括鸡、鸭等禽类羽毛生产羽毛粉的加工过程。