一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置及取样方法

摘要

本发明公开了一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置，在生长槽主体上设有沿轴向延伸的生长槽，生长槽为梯形槽，每个生长槽模块上均设置有轴向贯穿的固定孔，至少一根固定轴依次穿过每一个生长槽模块的固定孔将生长槽模块串联形成生长槽主体，取样装置还包括有机薄膜，有机薄膜能覆盖在生长槽上阻隔直径大于膜孔径的颗粒物质进入生长槽，伸入生长槽中的植物根的直径随其远离根基的距离而逐渐递减，生长槽的槽径递减幅度与植物根的直径递减幅度相适应。本发明具有能原位定量无干扰采集湿地植物根不同部位根际微量沉积物、能根据根的不同部位直径设计相应槽径的生长槽保证根不同部位根际沉积物厚度一致可比较的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物采样技术领域，具体涉及一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置及取样方法。

背景技术

湿地植物根际-沉积物（根际圈）微界面存在相互分异又密切联系的氧化-还原异质环境，发生着剧烈的交换、降解、转化和沉积等过程，往往是有机物降解、物质循环及生命活动最为强烈的场所，其中根际微生物的代谢活动被认为是根际环境物质循环的基础机制，在污染物的吸附和降解中起着核心作用，湿地植物根际微生物研究也因而成为热点。

目前有部分研究将湿地植物置于土壤中培养，并参照陆生植物根际微生物取样方法，即取样时将植物连根拔起，抖掉根周围松散的土壤，剩下为根际土并进行微生物分析，实际上湿地植物普遍生长在沉积物中，因而这些研究缺乏实际意义，由于沉积物含水率远高于普通土壤，陆生植物根际微生物取样方法并不适用，因而现有研究往往将湿地植物生长区域的沉积物作为根际沉积物样品进行微生物分析，实际上根际微界面厚度只有数毫米，上述方法采集的沉积物样品相对湿地植物根系而言尺度太大，均难称根际沉积物，且在采样过程中易受根系外部沉积物干扰，不能真实定量反映湿地植物根际微界面微生物的实际状况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种能原位定量无干扰采集湿地植物根不同部位根际微量沉积物、并根据根的不同部位直径设计相应槽径的生长槽，根部粗处生长槽槽径相应变大，根部细处生长槽槽径相应变小，保证根际沉积物厚度一致的湿地植物根际微生物的取样装置及取样方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置，包括由若干个生长槽模块依次拼接而成的生长槽主体，生长槽主体上设有沿轴向延伸的生长槽，生长槽为梯形槽，且生长槽的槽径随其远离湿地植物根基的距离而逐渐递减，每个生长槽模块上均设置有轴向贯穿的固定孔，至少一根固定轴依次穿过每一个生长槽模块的固定孔将生长槽模块串联形成生长槽主体，取样装置还包括有机薄膜，有机薄膜能覆盖在生长槽上阻隔直径大于膜孔径的颗粒物质进入生长槽，伸入生长槽中的植物根的直径随其远离根基的距离而逐渐递减，生长槽的槽径递减幅度与植物根的直径递减幅度相适应。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

固定轴依次穿过每一个生长槽模块的固定孔后，通过螺帽旋在固定轴上将生长槽模块相互固定。

上述的有机薄膜为醋酸纤维膜。

上述的固定轴的数量为两根，相应地，每个生长槽模块的固定孔数量为两个，且两个固定孔左右对称地设置在生长槽模块上。

上述的生长槽主体的材质为有机玻璃。

对湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样方法，包括以下步骤：

步骤一、剥离湿地植物根系, 并将拟测定根自根基处拉直后测量其根直径，得到该拟测定根直径变化率，通过该直径变化率设定生长槽的槽径变化率，然后将拟测定根水平放置于生长槽中，使生长槽的两侧槽壁与拟测定根之间始终保持预定同一距离；

步骤二、在生长槽中添加预定厚度的培养该湿地植物根系的沉积物，覆盖拟测定根；

步骤三、在生长槽上覆盖有机薄膜,并在有机薄膜上添加培养该湿地植物根系的沉积物以覆盖有机薄膜,培养预定时间；

步骤四、移除有机薄膜上的沉积物,将拟测定根从根基剪断,并将有机薄膜移除,取出生长槽主体；

步骤五、将所述拟测定根在生长槽模块连接间隙处逐段剪断,将生长槽模块分离，将每个生长槽模块内的沉积物分离并提取微生物,得到所述拟测定根不同部位同一厚度根际微生物。

步骤一中通过游标卡尺测量拟测定根的直径。

沉积物为培养湿地植物的拟测定根的经过均质化处理的培养物。

预定培养时间大于七天。

在步骤五中，采用试剂盒提取所述根际沉积物中微生物的总DNA。

本发明将湿地植物拟测定根水平放置于可拆卸分段的有机玻璃生长槽中覆泥培养，根据根不同部位直径设计生长槽槽径，根据植物根的直径随其远离根基的距离而逐渐递减的特性将生长槽设计为槽径随其远离湿地植物根基的距离而逐渐递减，使生长槽的两侧槽壁与拟测定根之间始终保持预定距离；因为根际微界面厚度只有数毫米，如不设置槽径变化，根末端处槽壁于拟测定根之间的距离会比较远，根不同部位根际沉积物由于厚度不一而缺乏可比性，设置了槽径变化后，可使根不同部位根际沉积物厚度一致。本发明还可设计生长槽槽径确定拟采集的根际沉积物厚度，而后在生长槽上覆盖具有一定孔径的醋酸纤维膜，该膜具有阻隔泥沙等大颗粒物质但不影响水、无机盐及细菌等小颗粒物质通过的作用，使膜内、外沉积物环境近似一致，培养一段时间后，小心揭除醋酸纤维膜即可分段采集根不同部位根际沉积物。本发明可以原位定量无干扰采集湿地植物根不同部位根际微量沉积物，可利用T-RFLP等技术从分子水平上表征根际微生物种群结构多样性及空间差异，进而为探讨根际环境物质循环的影响机制提供理论基础。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是图1的结构拆分图；

图3是本发明的正视图；

图4是湿地植物拟测定根放置于生长槽中的结构示意图；

图5是图4的正视图；

图6是在生长槽中添加预定厚度的沉积物覆盖拟测定根的结构示意图；

图7是在生长槽上覆盖有机薄膜的结构示意图；

图8是将拟测定根在生长槽模块连接间隙处逐段剪断、生长槽模块分离的结构示意图；

图9是实施例中菖蒲根某部位根际细菌群落T-RFLP显示图；

图10是膜外-无根沉积物细菌群落T-RFLP显示图；

图11是膜内-无根沉积物细菌群落T-RFLP显示图；

图12是每克沉积物微生物总峰面积计算值比较示意图。

其中，附图标记为：生长槽主体1、生长槽模块2、生长槽3、固定孔4、固定轴5、有机薄膜6。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。

如图1至图8所示，一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置，包括由若干个生长槽模块2依次拼接而成生长槽主体1，生长槽主体1上设有沿轴向延伸的生长槽3，生长槽3为梯形槽，且生长槽3的槽径随其远离湿地植物根基的距离而逐渐递减，每个生长槽模块2上均设置有轴向贯穿的固定孔4，至少一根固定轴5依次穿过每一个生长槽模块2的固定孔4将生长槽模块2串联形成生长槽主体1，取样装置还包括有机薄膜6，有机薄膜6能覆盖在生长槽3上阻隔直径大于膜孔径的颗粒物质进入生长槽3，伸入生长槽3中的植物根的直径随其远离根基的距离而逐渐递减，生长槽3的槽径递减幅度与植物根的直径递减幅度相适应。固定轴5依次穿过每一个生长槽模块2的固定孔4后，通过螺帽旋在固定轴5上将生长槽模块2相互固定。

实施例中，有机薄膜6为醋酸纤维膜。有机薄膜6的孔径为0.8μm，厚度为0.03mm。

实施例中，固定轴5的数量为两根，相应地，每个生长槽模块2的固定孔4数量为两个，且两个固定孔4左右对称地设置在生长槽模块2上。

实施例中，生长槽主体1的材质为有机玻璃。

对湿地植物根不同部位根际微生物取样的方法，包括以下步骤：

步骤一、剥离湿地植物根系, 并将拟测定根自根基处拉直后测量其根直径，得到该拟测定根直径变化率，通过该直径变化率设定生长槽3的槽径变化率，然后将拟测定根水平放置于生长槽3中，使生长槽3的两侧槽壁与拟测定根之间始终保持预定同一距离；如图4、图5所示；

步骤二、在生长槽3中添加预定厚度的培养该湿地植物根系的沉积物，覆盖拟测定根；如图6所示；

步骤三、在生长槽3上覆盖有机薄膜6,并在有机薄膜6上添加培养该湿地植物根系的沉积物以覆盖有机薄膜6,培养预定时间；如图7所示；

步骤四、移除有机薄膜6上的沉积物,将拟测定根从根基剪断,并将有机薄膜6移除,取出生长槽主体1；

步骤五、将所述拟测定根在生长槽模块2连接间隙处逐段剪断,将生长槽模块2分离，将每个生长槽模块2内的沉积物分离并提取微生物,得到所述拟测定根不同部位的根际微生物。如图8所示。

步骤一中通过游标卡尺测量拟测定根的直径。

沉积物为所述培养湿地植物的拟测定根的经过均质化处理的培养物。

预定培养时间大于七天。

在步骤五中，采用试剂盒提取所述根际沉积物内的微生物总DNA。

以下以菖蒲为例，具体讲述本发明的取样方法：

一、实验材料：菖蒲、富营养化湖泊底泥。

二、实验方法：

首先，剥离菖蒲的根系, 并将拟测定根自根基处拉直后水平放置于有机玻璃生长槽中。有机玻璃生长槽靠近根基处槽径大，远离根基处槽径小，然后在生长槽3中添加富营养化湖泊底泥作为沉积物，保持同一切面上的槽径均大于根直径2mm，拟测定根际沉积物为1mm厚。接着，在生长槽3上覆盖孔径为0.8μm的醋酸纤维膜,并在醋酸纤维膜上添加沉积物，待沉积物覆盖生长槽和醋酸纤维膜后,培养7天。

培养7天后，移除醋酸纤维膜上的沉积物,将菖蒲的拟测定根从根基剪断,并将醋酸纤维膜移除,取出生长槽3。最后，将拟测定根逐段剪断,并将生长槽3逐段分离,将每段生长槽内的沉积物分离并提取微生物, 可以在将不同槽段内的沉积物刮出后，立刻使用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒（MOBIO，美国）提取根际沉积物中的微生物总DNA。

运用T-RFLP技术（综合运用了PCR技术、DNA限制性酶切技术、荧光标记技术和DNA序列自动分析技术），在DNA水平上通过对特定核酸片段长度多态性的测定分析并比较菖蒲根不同部位根际微生物的群落结构和种群数量。

对照实施例所检测的沉积物中的微生物为醋酸纤维膜外-无根沉积物（膜外对照）和膜内-无根沉积物（膜内对照）。

三、实验结果：

菖蒲根某部位根际细菌群落T-RFLP图谱显示如图9至图11所示：

（1）   膜外对照、膜内对照微生物种类（一般认为峰值图上的每一个峰代表了一种菌）与数量（每一个峰的峰面积）无显著差异，表明醋酸纤维膜对沉积物中大颗粒物质具有阻隔作用但小颗粒物质如微生物等并无显著影响，因此利用醋酸纤维膜的阻隔作用消除采集根际沉积物时的根外沉积物干扰是可行的；

（2）   菖蒲根对沉积物微生物物种多样性无显著影响，膜内-根际、膜外对照、膜内对照微生物种类基本一致；

（3）   菖蒲根对不同种类微生物种群数量影响显著，与膜外对照、膜内对照相比，对如T-RF121bp、 466 bp、488 bp等部分种类微生物生长有促进作用，对如T-RF 61 bp、507 bp等部分种类微生物生长有抑制作用，对如T-RF 286bp、462 bp等部分种类微生物生长则无显著影响。

如图12所示，从微生物种群数量上看，菖蒲根际微生物种群数量存在显著的空间差异，呈现自根中部向根基、根尖逐渐下降的现象，但各根各部位根际微生物种群数量均显著高于膜内对照和膜外对照，而膜内对照与膜外对照沉积物微生物种群数量无显著差异。

根据上述实施例可以看出，采用本发明一种湿地植物根不同部位同一厚度根际微生物的取样装置及取样方法采集并检测得到的湿地植物根际微生物种类和数量明显多于非根际微生物，能直接反应湿地植物根际微生物种群结构多样性及空间差异，真正意义上实现根际微生物研究，可利用T-RFLP等技术从分子水平上表征根际微生物种群结构多样性及空间差异，进而为探讨根际环境物质循环的影响机制提供理论基础。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。