一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用

摘要

本发明提供了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及应用，利用基因编辑技术在猪PKD1基因5号外显子处引入插入突变，敲除猪PKD1基因，构建了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪模型。本发明建立的基因突变猪模型可用于常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种常染色体显性多 囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用。

背景技术

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性多囊肾病， 在人群中的发病率为1/400～1/1000。ADPKD以双侧肾脏出现充满液 体的囊泡为主要特征，并伴随多种肾外症状，随着疾病的发展，肾实 质逐渐被囊泡和纤维化组织替代导致肾脏功能丧失。患者的临床表现 通常在20～30岁时出现，仅有不到2%的病例出现在胎儿或儿童时 期。60岁时，大约50%的患者将会出现终末期肾脏病（ESRD），这 占了所有ESRD病例的5%，这也是我国终末期肾病中的排名第四的 致病因素。ADPKD是一种系统性疾病，除了肾脏表现异常外还可以 影响全身其他器官，如：囊泡还可以发生在肝脏，胰腺，脾脏，甲状 腺，蛛网膜和精囊腺，其中精囊腺的囊泡可能是导致ADPKD患者不 育的一个主要原因。颅内动脉瘤是导致ADPKD患者死亡的另外一个 原因，其发生率为5～7%，由于其往往发生在同一个家族成员中，因 此认为其发生是家族性遗传导致。高血压是ADPKD患者最为常见的 症状，它与囊泡的发展及肾脏体积的增大成正相关，大约60%的患者 在肾衰竭前都会出现高血压。

目前人们已经发现ADPKD是由于PKD1和PKD2发生基因突变 引起的，前者占据了所有ADPKD病例的85%，后者则占据了15%。 研究发现PKD1突变能导致更严重的表型，例如更高的几率发生高血 压和血尿，而且与ADPKD2患者通常在74岁左右发生ESRD相比， ADPKD1的患者要早20年左右到终末肾衰竭。PKD1突变导致更严 重表型的原因并不是由于囊泡生长速度要快于PKD2突变，而是由于 PKD1突变往往引起囊泡更早、更多地出现。

为了研究ADPKD的机理及筛选治疗药物，人们建立了大量小鼠 模型。这些模型证明了PKD1与PKD2能调节细胞的增殖、凋亡、分 化、极性及分泌过程，但是目前仍然没有对ADPKD很好的治疗方法 通过小鼠模型的研究出现。猪作为一种与人类在生理学及解剖学上高 度相似的生物，在生物医学研究中具有重要的价值。而且猪和人的肾 脏在解剖功能上都要比其他动物更为接近，都表现为多肾叶和多肾乳 头结构，肾上腺位于肾的头部，右侧肾上腺与后腔静脉壁相连，血流 供应也是头部和尾部分开，而不是像多数物种那样纵向的血管分布。 猪已经在发育和儿童泌尿学研究中作为模式生物，主要研究膀胱尿液 回流和肾内回流。因此我们希望通过构建猪ADPKD疾病模型，给多 囊肾病的治疗带来一些新的理论和方法。

构建基因敲除动物模型需要使用的方法有常规基因敲除和基因 编辑技术，前者能够按照人们的目的定点改变基因序列。基因打靶技 术最早是70年代在酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中实现的，它的 实现需要达到以下几个要求：能够在实验室中操作酵母DNA；能够 将外源DNA片段引入酵母细胞中；供体DNA能够与宿主基因组发 生同源重组；缺少与同源重组竞争的反应；能够利用筛选技术挑选出 阳性产物。这些技术要求在当时其他真核生物中都难以实现，直到后 来小鼠ES细胞的建立才为真核生物基因打靶筛选提供了良好的材 料。同时在1988年，Mansour发明了正负筛选技术，大大提高了基 因打靶阳性细胞的富集，由此人们利用基因打靶技术在小鼠和酵母菌 中获得了大量知识。虽然基因打靶具有很多的优点，但是由于打靶效 率低下(10^-6)和缺少胚胎干细胞，使得在其他物种中基因打靶技术的 应用并不是十分广泛。随着分子生物学的发展，基因编辑技术的出现 大大提高了基因敲除效率。基因编辑技术目前主要包括：ZFN、Talen 和CRISPR-Cas9，他们通过特异地识别DNA序列，定点地引入DNA 双链断裂，并利用宿主细胞中倾向错误的修复机制--非同源重组的末 端连接引入突变造成目的基因失活。因此本发明中，我们利用基因编 辑技术在猪成纤维细胞中高效实现PKD1基因突变，并通过体细胞核 移植得到PKD1基因突变的小型猪模型。这些基因突变猪模型的建 立，为常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选提供了很好的基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种常染 色体显性多囊肾病基因突变猪模型的生产方法，建立的基因突变猪模 型可用于常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选。

为了实现本发明目的，本发明首先提出一种常染色体显性多囊肾 病基因突变猪的生产方法，包括下述步骤：

1）利用基因编辑技术在猪PKD1基因引入插入突变；2）采用PCR 和测序鉴定方法筛选猪PKD1基因插入突变的猪细胞克隆点；3）将筛 选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞 中，在体外培养成重构胚，非手术法将其移入代孕母猪子宫中，妊娠 生产出克隆猪；4）采用PCR和测序方法鉴定出PKD1基因突变的克隆 猪。

进一步的，所述插入突变为猪PKD1基因5号外显子第642-643位 点处引入“T”的插入突变，所述PKD1基因突变序列见SEQ ID No.1。

所述插入突变还可以是猪PKD1基因5号外显子第642-643位点处 引入“TGCT”的插入突变，所述PKD1基因突变序列见SEQ ID No.2。

更进一步的，所述引入插入突变的方法为ZFN、Talen和 CRISPR-Cas9技术。

本发明还提供了一种鉴定PKD1基因敲除位点的PCR引物，所述 PCR鉴定引物包括：

引物F：5’-TAATTACAGGGGCCAAGCAG-3’；

引物R：5’-GAGGCAGGGAAGACGTTGT-3’。

本发明还提供了前述生产方法构建的基因突变猪模型在针对常 染色体显性多囊肾病进行药物实验和临床前药物筛选中的应用。包 括：分子、细胞、个体水平上对常染色体显性多囊肾病的基础生物学 研究，以期找到和发现影响囊泡形成的分子机理；利用小型猪模型进 行药物筛选，以得到治疗肾囊肿、肾功能衰退及其他多个器官并发症 的药物。

本发明的有益效果在于：

本发明选择在肾脏解剖功能上与人更为接近的猪作为动物模型， 构建常染色体显性多囊肾病模型。通过基因编辑技术在猪PKD1基因 引入插入突变，而构建了一种常染色体显性多囊肾病模型，为研究疾 病分子机理及为治疗药物筛选提供了合适的动物模型。

附图说明

图1为PKD1基因编辑的靶位点；

图2为PCR鉴定克隆猪基因型；

图3为PKD1敲除小型猪照片；

图4为定量PCR检测克隆猪耳组织中PKD1的表达；

图5为定量PCR和Western blot检测三种基因型克隆猪肾脏中 PKD1的表达；

图6为各年龄阶段各基因型小型猪肾脏的外观表现；

图7为各年龄阶段各基因型小型猪肾脏的组织学检测；

图8为利用免疫组化对肾囊泡来源、肾纤维化及上皮细胞增殖进 行检测；

图9为克隆小型猪血尿素氮检测；

图10为克隆小型猪尿液24小时蛋白质含量检测；

图11为克隆小型猪影像学检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 猪多囊肾病基因克隆及突变位点筛选

发明人以猪多囊肾病基因PKD1的mRNA序列（GenBank  Accession No.:NM_001246202)为基础，通过ZFN、Talen和 CRISPR-Cas9等基因编辑技术在位于PKD1的5号外显子的第642-643 位点引入插入突变（图1）。作为基因编辑的靶位点，这样产生的突变 蛋白将不能保留大部分的功能结构域，因此使PKD1失去功能。

实施例2 PKD1敲除成纤维细胞的筛选

根据实施例1确定的靶位点设计用于基因编辑的ZFN，也可采取 Talen和CRISPR-Cas9等技术进行基因编辑操作，本实施例优选ZFN 技术。在得到ZFN后，首先需要对其转染成纤维细胞的量进行优化。 我们采用0.3μg，0.5μg，1μg，2μg，4μg的ZFN质粒（ZFN转染时 是成对质粒，此时的量表示其中每一个质粒的量）转染1×10⁶个成 纤维细胞。成纤维细胞的培养条件是37℃，培养基为DMEM（Sigma） 加上10%的胎牛血清（Gibco），在转染前24小时换液，使细胞处于 指数生长状态。良好的转染条件基于以下两个准则：1）转染后成纤 维细胞状态良好，形态正常，没有大量死亡；2）基因编辑效率高， 具体为转染后24小时，提取成纤维细胞基因组，用引物 TAATTACAGGGGCCAAGCAG和GAGGCAGGGAAGACGTTGT扩 增基因组目的敲除位点，然后纯化PCR产物，连接至pMD-19T （Takara）载体上，转化大肠杆菌细胞，然后挑取100个菌落测序， 计算发生基因编辑DNA的比例。

在本发明中，当ZFN质粒量大于1μg时，成纤维细胞大量死亡； 而ZFN使用0.3μg时，细胞发生基因编辑的效率为0；只有当ZFN 质粒转染量为0.5μg时，成纤维细胞状态良好，且基因编辑效率为 11.8%，因此在后续操作中ZFN的量设定为0.5μg。

在转染条件优化完成后，我们利用EcoRI和BamHI酶切pL452 质粒，回收并纯化带有新霉素抗性的片段，随后将0.5μg的新霉素抗 性片段与0.5μg的ZFN质粒（总共1.5μg）混合、转染1×10⁶中国实 验用小型猪胚胎成纤维细胞。转染完成后将成纤维细胞铺入T25培养 皿中恢复24小时，随后用胰酶消化，并均匀的将消化下的细胞转入 6个10cm培养皿中，并在培养基中加入400μg/ml G418（Promega） 筛选。经过7～8天的筛选，培养皿中总共有72个克隆点生成。之后， 利用克隆环将克隆点消化并将细胞传入24孔板培养，随后再转入12 孔及6孔板。将6孔板中细胞分为两份，一份用来提DNA鉴定，另 一份冷冻保存。用引物TAATTACAGGGGCCAAGCAG和 GAGGCAGGGAAGACGTTGT扩增从72个克隆点所提的基因组，将 PCR产物纯化后直接送测序鉴定各个克隆点基因型。在本发明中，经 鉴定有12个克隆点发生了基因突变事件，其中9个克隆点发生单等 位基因突变，3个克隆点是复合型杂合体（即两个等位基因均发生突 变，但突变类型不同），因此突变效率为（9+3×2）/（72×2）=10.4%。 这一结果与我们在转染条件优化过程中的突变效率一致。

进一步筛选出c.642_643insT和c.642_643insTGCT两个突变型细胞， 两种基因型细胞分别命名为PKD1^T ins/+和PKD1^TGCT ins/+（图2）， 其突变序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

实施例3 体细胞核移植技术制备PKD1基因敲除小型猪

将筛选出的阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核 的卵母细胞中，在体外培养成重构胚，再将其以每个受体猪平均384 个重构胚的数量移入13头受体猪输卵管中。经过大约114天，5头 代孕母猪产下了20头克隆小型猪（图3）。

操作步骤如下：从屠宰场取回猪卵巢→用针管抽取卵泡→将卵泡 放入成熟液中体外成熟→突变克隆点成纤维细胞长满培养孔后，消 化、洗涤并重悬→受体卵母细胞在显微镜下去核，再将供体细胞注入 卵周隙中使两者细胞膜紧密接触→将重构卵转移至融合液中，用直流 电脉冲诱导融合形成重构胚→将重构胚采取非手术法移植入代孕母 猪子宫内→克隆猪生成。

实施例4 克隆小型猪的分子生物学鉴定

采集新生克隆小型猪耳组织样本，提取基因组(DNeasy Blood& Tissue kit，Qiagen)及RNA(RNeasy，Qiagen)，利用引物 TAATTACAGGGGCCAAGCAG和GAGGCAGGGAAGACGTTGT扩 增基因组目的敲除位点，鉴定出阳性敲除猪（PKD1^TGCTins/+和PKD1^Tins/+）和野生型个体。再利用定量PCR（引物 CATGTGGCTCCTCTCAAGCA和GCTTCCAGCAGGACCTTGAGT） 技术扩增由耳组织RNA反转录得到的cDNA，鉴定出阳性敲除猪 PKD1基因的表达量下降大约一半（图4）。随后随机从3种基因型克 隆猪中选取一只，提取肾脏RNA和蛋白质，利用定量PCR和Western  blot的方法，鉴定PKD1基因在肾脏中转录和翻译水平的表达，结果 发现敲除猪PKD1表达下调（图5）。

实施例5 PKD1基因敲除小型猪肾脏形态学检测

取新生猪（出生48小时）、6月龄及11月龄时克隆猪肾脏，首 先进行观察发现新生猪肾脏没有出现明显可见的囊泡，而6月龄时出 现了大小约为5mm的充满液体的囊泡，而到11月龄时囊泡在数量和 大小上明显增多（图6）。随后将肾脏切块并放入10%的中性福尔马 林溶液中固定。之后采用HE检测同样证实新生猪肾脏没有囊泡的形 成，而6月龄与11月龄小型猪肾脏出现了明显的人类常染色体显性 多囊肾病一致的囊泡（图7）。运用多种抗体证明这些囊泡起源于肾 小管和集合管，伴随典型的肾纤维化趋势，并且上皮细胞增殖增强（图 8）。

1、本发明所用石蜡包埋步骤如下：

50%乙醇，30min；

70%乙醇，1h+（时间依情况而定）；

80%乙醇，1h；

95%乙醇，1h；

100%乙醇，30min×2；

二甲苯：乙醇（1：1），15min；

二甲苯，30min×2；

二甲苯：石蜡（1：1），30min；

软蜡，1h；

硬蜡，3h；

石蜡包埋，然后放冷却台2小时。

2、本发明所用HE步骤如下：

1）脱蜡水化

二甲苯I     10min

二甲苯II    10min

无水乙醇I   5min

无水乙醇II  5min

95%乙醇     3min

80%乙醇     3min

75%乙醇     3min

2）染色

片子放入蒸馏水中洗稍许；放入苏木精中染色6-10min；在水龙 头下冲洗5min；放入1%盐酸酒精中分化30s；自来水冲洗1min；放 入0.2%氨水中30s-1min；自来水冲洗5分钟；放入蒸馏水蘸洗一次； 放入95%乙醇中，蘸洗10次；复染伊红30s-1min；80%乙醇2min； 95%乙醇2min；无水乙醇I2min；无水乙醇II2min；二甲苯I2min； 二甲苯II5min；二甲苯+中性树胶封片，镜检。

3、本发明所用免疫组化步骤如下：

1）脱蜡水化

二甲苯I     10min

二甲苯II    10min

无水乙醇I   5min

无水乙醇II  5min

95%乙醇     3min

80%乙醇     3min

75%乙醇     3min

2）PBS洗2～3次各5分钟；

3）3%H2O2（甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；

4）PBS洗2～3次各5分钟；

5）抗原修复

微波热修复:在微波炉里加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0） 至沸腾后将组织芯片放入，液体温度保持在92℃～98℃之间并持续 10～15分钟。取出容器，室温冷却5-10分钟反复1-2次；

6）PBS洗2～3次各5分钟；

7）甩去PBS，蜡笔画标本范围，滴加正常山羊血清封闭液,室温 20分钟。甩去多余液体；

8）甩去血清，滴加I抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或 者37℃1小时;

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟;

10）PBS洗3次各5分钟；

11）滴加II抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；

12）PBS洗3次各5分钟；

13）辣根过氧化酶标记链酶卵白工作液，37℃/室温10-30min；

14）PBS洗3次各5分钟；

15）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度，阳性显 色为棕色或红色；

16）PBS或自来水冲洗10分钟；

17）苏木精复染2分钟，自来水冲洗五分钟，盐酸酒精分化30 秒，自来水冲洗1分钟，氨水30秒返蓝；

18）自来水冲洗10～15分钟；

19）切片脱水：80％酒精——90％酒精——100％酒精——二甲 苯（1）——二甲苯（2），各约2分钟;

20）封片：干净盖玻片，中性树胶＋二甲苯封片。镜检。

4、本发明所用免疫组化抗体名称、稀释倍数及作用如下：

anti-Lrp2(Abcam,1:100):近端小管；

anti-THP(Santa Cruz,1:100)：髓袢升枝粗段、远曲小管；

anti-Calbindin-D-28K(Sigma Aldrich,1:100)：远曲小管、皮质集合 管；

biotinylated-DBA(Vector Laboratories,1:200)：集合管；

anti-alpha-SMA(Abcam,1:100)：分析多囊肾的纤维化；

Ki-67(Abcam,1:100)：分析肾小管上皮细胞增殖变化。

实施例6 克隆小型猪的血液学检测

对克隆小型猪采用颈动脉采血，各取10ml，待血液凝固后离心 取上清（血清），利用血液自动生化仪对血清各成分进行分析。发现 敲除PKD1小型猪血液肾脏功能指标血尿素氮（BUN）含量明显上升， 其中PKD1^TGCT ins/+小型猪BUN增加更多，而由于样本量的原因PKD1^Tins/+BUN含量也提高但是没有达到统计学显著水平。这些结果说明 PKD1敲除小型猪肾功能开始下降（图9)。

实施例7 克隆小型猪泌尿学检测

将克隆小型猪放入代谢笼中，采集24小时尿液。放入代谢笼的 小型猪能够正常饮水及进食。每天早上9点开始进行尿液收集，直到 第二天早上9点结束。将收集的尿液首先混匀、过滤并测量体积，然 后取10ml放入尿管，交由尿液生化仪检测尿液中蛋白质浓度，得到 的结果乘以体积变为24小时尿蛋白含量。结果发现PKD1基因敲除 猪尿蛋白含量显著高于野生型个体，说明其出现了蛋白尿现象，证明 肾脏出现功能问题（图10）。

实施例8 影像学检测肾脏及肝脏囊泡

在三种基因型小型猪中每组随机抽取三头，麻醉后注入CT增强 剂，再用多重螺旋CT仪检测肾脏及肝脏。发现敲除PKD1小型猪肾 脏出现大量囊泡，而且肝脏也有少量囊泡出现，野生型个体正常。在 对肾脏体积计算后发现，三种类型克隆猪肾脏体积没有发生明显的变 化，说明本发明中的小型猪模型正处于常染色体显性多囊肾的初期阶 段（图11）。

实施例9 常染色体显性多囊肾病小型猪模型的应用

1）采集不同时间段、不同组克隆猪的肾脏，提取蛋白质及RNA， 首先利用Western blot和定量PCR分析目前已知的与多囊肾相关信 号通路的变化，如：mTOR，JAK/STAT，G蛋白偶联通路，标准及 非标准Wnt通路等等，找到与ADPKD密切相关的信号通路及分子， 比较其与小鼠和人类结果的异同；利用基因芯片分析寻找疾病发生不 同阶段差异表达的基因，并用定量PCR证实基因芯片的结果；采用 GO(Gene Ontology)分析结合KEGG、IPA等生物信息学工具及数据 库确认与ADPKD有关的新的信号通路和关键分子，为药物筛选提 供靶点。

2）新药的筛选、诊断及治疗方法的建立

在小型猪常染色体显性多囊肾模型与人相似性、实用性和有效性 的基础上，筛选新的治疗药物，确立精确的诊断方法和建立良好的外 科治疗手段。

利用信号通路研究的结果，筛选针对特定关键靶分子的药物。

例如：mTOR抑制物rapamycin，血管加压素受体拮抗剂 (vasopressin V2receptor antagonist)，血管紧张素转换酶抑制剂 (angiotensin converting enzyme inhibitor)等等，用以常染色体显性多囊 肾疾病模型小型猪临床前试验，以达到抑制疾病发展和提高肾功能的 目的，并最终用于人类临床试验；

建立BUN、Scr和24小时尿蛋白与常染色体显性多囊肾发展的 动态关系，确立诊断常染色体显性多囊肾的血液、尿液生化参数标准， 另外对血液和尿液中其他物质进行详细分析，以找到是否存在更敏感 的诊断参数；

通过CT和MRI对不同发病阶段的疾病模型小型猪进行扫描， 完善和补充现有影像学诊断标准；

利用肾穿刺技术结合病理分析的方法，建立活体组织体外检测组 织学及病理学诊断标准；

利用小型猪常染色体显性多囊肾模型改进现有手术治疗方法， 如：腹腔镜肾囊肿去顶减压术、后腹腔镜去顶减压术、囊肿去顶减压 加带蒂大网膜填塞术、B超、CT引导下注入无水乙醇、硬化剂等等， 并寻找新的外科手术治疗方法，以减少常染色体显性多囊肾病患的痛 苦。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。