血管生成素样4及其用于伤口愈合的方法

摘要

用于增进有需要的个体的伤口愈合的方法和药物组合物，所述方法包括施用血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段。

说明书

相关申请的引用

本申请要求2012年7月19日提交的美国临时专利申请61/673,463的优先权的利益，为了所有目的其内容在此通过引用以其整体合并于此。

技术领域

本发明涉及用于伤口愈合的组合物和伤口愈合治疗的方法。

背景技术

II型糖尿病是一种医疗的威胁，其影响约2亿人，并因其视网膜病变、心血管疾病和糖尿病肾病的发病率而继续在世界范围内对医疗保健资源产生日益加重的负担。受损的伤口修复代表了当今世界上最显著的未满足的医疗需求之一，并且是糖尿病的主要并发症，导致显著的发病率、生产力损失和医疗保健支出。此外，愈合不良的糖尿病性伤口为感染打开门户，常引起慢性炎症、败血症、开裂和死亡。尽管这些慢性伤口具有巨大的影响，但一直缺乏有效疗法。为了有效解决这些问题，我们必须了解愈合过程，并创造有利于愈合的有益健康的物理和生化环境。

正常伤口愈合通过一系列连续的事件进行，所述事件包括急性炎症、增殖和成熟阶段^3,4。这些事件牵涉结缔组织的形成、细胞活性和生长因子激活之间的复杂相互作用。所有这三个生理过程在在糖尿病状态^5,6下被改变。胞外基质(ECM)成分对于伤口愈合的每个阶段都是不可或缺，其以动态交互的方式与细胞和生长因子相互作用，最终导致创面闭合。

慢性伤口例如静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡或褥疮，代表了当今世界上最显著的未满足的医疗需求之一，是糖尿病的主要并发症，导致显著的发病率，生产力损失和医疗保健支出。糖尿病足溃疡是发病的一个显著原因，并且是为糖尿病患者入院的最常见的原因。大约15％的糖尿病患者将在他们的一生中发展出慢性溃疡。在那些需要下肢截肢的患者中，70-90％之前患有足溃疡²。

糖尿病性伤口的特征在于失活组织的积累，增加的/长时间的炎症，与不良伤口相关的血管生成和ECM组分的不足^6,7。糖尿病患者的伤口显示升高水平的基质金属蛋白酶(MMP)、增加的ECM组分的蛋白降解，在损坏的ECM中积累的生长因子的失活(其不能支持愈合)^5,8。异常的一氧化氮(NO)产生也促成了受损的愈合的发病机制。细胞，如角质形成细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，同时显示表达和对许多生长因子和细胞因子的响应的功能失调。因此，这些伤口通常对大多数治疗是非响应性的。由于这些原因，可能最有利的是利用可在糖尿病性伤口中恢复损坏的细胞外微环境的侵袭性策略进行干预。替换丢失或功能失调的ECM组分的伤口愈合策略可以是有益的。理想的是，这样的替换应该是多方面的和交互性的，并且非常接近正常ECM的组分。在这个方面，细胞基质蛋白(matricellular protein)在伤口愈合中的作用引人关注。细胞基质蛋白可与胞外基质储库中的各种各样的蛋白质结合，将它们与它们的同源细胞表面受体桥接^9-11。他们在伤口愈合过程中依时空表达，并且保留住在细胞-基质通信的交叉路口，用作若干调控网络的调制剂。据推测，调控途径由复杂网络组成，这使得很难设计用于伤口修复所需的补偿性调整。可能最有利的是干预侵袭性的治疗方法是利用替换丢失的或功能失调的胞外基质(ECM)组分的侵袭性愈合策略进行干预。理想的是，这样的替换应该是多方面的和互动性的，并且非常接近正常ECM的组分，从而导致加速的创面闭合，以最低限度形成疤痕。因此，虽然靶向或替换必需细胞基质蛋白可能比单独的细胞因子介导的候选者更有效，但难以知道从哪开始，或什么样的策略可能会成功。

为了有效地解决这些问题，我们必须了解愈合过程，创造有利于愈合的有益健康的物理和生化环境。这些非愈合伤口一直是过去15年中广泛研究的主题。许多努力集中在重组生长因子。鉴于表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)以及转化生长因子β家族的成员的靶是参与皮肤伤口修复过程的细胞，因此合乎逻辑地首次使用该模型涉足涉及这些生长因子的临床研究。有一个明显的例外(PDGF-BB或贝卡普勒明)，这种药物的开发工作因为几个原因可以说是失败的(Pierce&Mustoe 1995)，其中最明显的原因是这些生长因子通常针对向伤口愈合所必需的单个生物过程。迄今天为止，被美国食品和药物管理局批准的用于治疗糖尿病性足溃疡的唯一生长因子是重组PDGF-BB(贝卡普勒明)，其被配制在局部乳膏中。已知PDGF-B是间质细胞的有效促细胞分裂剂和趋化剂，并且可用于通过刺激血管生成来增加创伤血管形成。因此目前迫切需要更好的、新的或辅助性治疗。

血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是主要在肝中表达的分泌蛋白，已证明其通过抑制富含甘油三酯的脂蛋白的脂解来调节甘油三酯代谢。实验结果表明，ANGPTL4在不同的营养状态过程中调节循环甘油三酯水平，从而在喂食/禁食过程中通过脂蛋白脂酶(LPL)的差异抑制来在脂质代谢中起作用。已显示促血管生成素样蛋白的N-末端结构域在脂质代谢中发挥积极作用。通过使用缺失突变体，证明了包含片段-(17-207个)的N端结构域而非包含片段-(207-460)的C末端血纤蛋白原样结构域升高小鼠的血浆甘油三酯水平：ANGPTL4已被鉴定为脂质代谢的新型旁分泌和可能地内分泌调节剂，以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的靶标。其在许多细胞类型例如脂肪细胞和肝细胞中表达，并且在禁食和缺氧后被上调。重要的是，ANGPTL4经历蛋白水解加工以释放其C-末端的血纤蛋白原样结构域(cANGPTL4)，其作为单体循环，然而其功能还不清楚。ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域(nANGPTL4)介导ANGPTL4的寡聚化并结合至脂蛋白脂酶以调节脂蛋白代谢，从而介导寡聚化和脂蛋白代谢。与此相反，cANGPTL4以单体形式存在，然而其功能仍然未知。已显示ANGPTL4在血管生成和血管通透性^13-15中起着背景依赖性作用。ANGPTL4最近被鉴定为牵涉能量代谢和伤口愈合¹²的调节的细胞基质蛋白。小鼠(ANGPTL47^-/-)中ANGPTL4的缺乏导致延迟的伤口再上皮化，减少基质蛋白表达，增加炎症和受损的伤口相关血管生成^16,17。然而，ANGPTL4的表达和在慢性伤口修复例如糖尿病性伤口修复中的作用仍然不清楚。

发明内容

因此，本发明的第一方面包括用于增进有此需要的个体的伤口愈合的方法，所述方法包括施用血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段。

本发明的另一个方面包括用于增进个体的伤口愈合的药物组合物，其包含血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段；和药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面包括确定伤口部位是否将变成慢性缓慢愈合伤口的方法，包括以下步骤：(a)测定存在于获自伤口部位的样品中的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的水平，(b)将样品的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的水平与来自健康个体(具有正常伤口愈合)的对照相比较，其中相较于对照，样品中降低的水平的ANGPLT4表明伤口部位将变成慢性缓慢愈合伤口。

通过参考以下附图和各种非限定性实施方式的描述，本发明的其它方面对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

附图说明

附图不必按比例绘制，而是通常将重点放在举例说明各种实施方式的原理上。在下列说明中，本发明的各种实施方式参考下列附图来进行描述。

图1.伤口愈合在糖尿病(ob/ob)小鼠中被延迟。

(A)在创伤后第1、3、5、7和10天获自的正常(ob/+)和糖尿病(ob/ob)伤口活检组织的代表性图像。比例尺：5mm。

(B)ob/+和ob/ob小鼠的创面闭合动力学。将伤口表面积以占第0天(＝100％)的伤口表面积的百分比作图。数据为平均值±SEM，n＝10。

(C)通过qPCR测定的在指定的创伤后天数上的ob/+和ob/ob伤口活检组织中的ANGPTL4的相对mRNA表达。核糖体蛋白L27用作参照管家基因。数据为以一式三份进行的3个独立研究的平均值±SEM。

(D)来自ob/+和ob/ob伤口活检组织的cANGPTL4的免疫印迹分析。β微管蛋白用作上样和转移对照。示图显示在指定的创伤后天数上来自ob/+和ob/ob伤口活检组织的cANGPTL4的相对蛋白质表达水平。使用imageJ软件测定蛋白质条带的光密度值。数据为3个独立伤口研究的平均值±SEM。

(E)ob/+和ob/ob伤口活检组织的ANGPTL4(红色)的免疫荧光染色。利用DAPI(蓝色)对切片进行复染。点线描绘表皮与真皮的界面，比例尺：40μm，使用Mann-Whitney检验：*p<0.05；**p<0.01和***p<0.001。

图2.ANGPTL4的局部施用改善糖尿病性伤口愈合。

(A)利用单份剂量的盐水或1％羧甲基纤维素中的cANGPTL4(50μg)处理的糖尿病ob/ob伤口的创面闭合动力学。将伤口表面积以占第0天(＝100％)的伤口表面积的百分比作图。数据为平均值±SEM，n＝10。使用Mann-Whitney检验：**p<0.01和***p 0.001。

(B)显示ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口的基因表达谱的热图。按照它们的生物学基因功能：增殖、血管生成、迁移、ECM、细胞凋亡和炎症对基因进行分选和聚类。从蓝色至红色的有色光谱描述从-1.0至1.0的Log-倍数变化。

(C)比较来自ob/+(蓝色)、盐水处理(红色)和cANGPTL4处理的ob/ob(黑色)的基因的总数的维恩图。

(D)在创伤后不同的天数上的来自ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口愈合的指定的蛋白质的代表性免疫印迹。β微管蛋白用途上样和转移对照。

(E)示图显示在指定的创伤后天数上的来自ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口活检组织的指定的蛋白质的相对表达水平。使用imageJ软件测定蛋白质条带的光密度值。数据为3个独立研究的平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001。

(F)ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口活检组织的CD31(褐色)和Ki67(绿色)的免疫组织化学和免疫荧光染色。点线描绘表皮与真皮之间的界面，比例尺：40μm。

图3.ANGPTL4调节ob/ob小鼠中的NO产量。

(A)通过DAF-FM双乙酸盐荧光测定的在指定的创伤后天数上的ob/+、盐水和cANGPTL4处理的ob/ob的一氧化氮产量(任意单位，AU)。将值针对利用通过UV280nm分光光度法测量的总蛋白质浓度进行标准化。数据为3个独立实验的平均值±SEM，n＝10。

(B-C)显示通过qPCR测量的在指定的创伤后天数上的ob/+、盐水和cANGPTL4处理的伤口活检组织的eNOS(B，左图框)和iNOS(C，左图框)的相对mRNA表达水平。核糖体蛋白L27用作参照管家基因。示图显示在用cANGPTL4处理后相较于同种未处理的对照原代人成纤维细胞中的iNOS(B，右图框)和原代人真皮微血管内皮细胞中的eNOS(C，右图框)的相对mRNA水平。数据为以一式三份进行的3个独立研究的平均值±SEM，**p<0.01。

(D)在创伤活组织检查后第7天，盐水和cANGPTL4处理的ob/ob伤口活检组织上的iNOS(红色)的免疫荧光染色。用DAPI对细胞核(蓝色)进行复染。点线描绘表面与真皮之间的界面，比例尺：50μm。WB：创面。

图4.ANGPTL4调节iNOS表达。

(A)在伤口活组织检查后第7天，ob/+、盐和cANGPTL4处理的ob/ob上的pSTAT3(Y705)(绿色)、pSTAT1(Y701)(红色)和pNFκB(S276)(绿色)的代表性免疫荧光染色。利用DAPI对细胞核进行复染(白色)。点线描绘表皮与真皮之间的界面，比例尺：40μm。WB：创面。

(B)在伤口活组织检查的第7天，使用免疫前IgG或针对pSTAT3(Y705)、pSTAT1(Y701)和pNFκB(S276)的抗体在盐水处理的(U)和cANGPTL4处理的ob/ob(T)中进行ChIP测定。使用适当的引物(表S1)扩增小鼠iNOS基因的横跨启动子结合位点的区域。结合位点上游的对照区域用作阴性对照。

(C)在指定的cANGPTL4处理后时间上的人皮肤成纤维细胞中的ID3的cANGPTL4相对mRNA表达。核糖体蛋白L27用作参照管家基因。数据为3个独立实验的平均值±SEM。

(D)在放线菌素D(10μg/μl)存在的情况下cANGPTL4处理的或盐水(媒介物)处理的人皮肤成纤维细胞中ID3 mRNA的相对稳定性。核糖体蛋白18S用作参照管家基因。通过qPCR测定ID3的相对mRNA表达水平，将其针对18S值进行标准化，以占时间0时的值的百分比作图。使用Orgin Pro 8.1通过线性回归分析计算每一种mRNA的半衰期。数据为3个独立实验的平均值±SEM。

图5.ANGPTL4减少ob/ob伤口中的胶原瘢痕组织。

(A)来自盐水和cANGPTL4处理的ob/ob的指定的伤口组织的羟脯氨酸含量。从羟脯氨酸标准曲线测定羟脯氨酸的总量(mg)，用通过UV 280nm分光光度法测量的总蛋白质浓度对其进行标准化。数据为平均值±SEM，n＝3***p<0.001。

(B)来自盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob伤口的第10天伤口切片的代表性VanGieson染色。胶原被染成红色，肌肉或血纤蛋白被染成黄色，细胞核被染成黑色。

(C)来自盐水处理的、cANGPTL4处理的以及cANGPTL4和氨基胍一起处理的ob/ob伤口的第10天伤口切片的Masson三色染色。胶原纤维被染成蓝色，细胞质被染成红色，细胞核被染成黑色。

(D)来自创伤后第10天的盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob伤口的创面区域附近的结缔组织的代表性扫描电子(SEM，最上方和中间的图框)和透射电子显微镜(TEM，最下方的图框)图像。将来自对应伤口活检组织的胶原纤维尺寸的横切面图像进行TEM成像。比例尺：最上方的图框，50μm；中间图框，5μm和最下方图框，50nm。

图6.伤口切片的苏木精伊红(H&E)染色。

(A)在指定的创伤后天数上的来自ob/+和ob/ob小鼠的创面切片的代表性苏木精伊红(H&E)染色。WB，创面。箭头表示伤口边缘。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例尺：100μm。

(B)H&E染色的伤口切片(左图框)的图示(右图框)。将上皮细胞间隙(a)测量为向内生长的上皮的两个边缘之间的再上皮形成间隔的距离。通过舌上皮内的上皮面积测量表皮伤口面积(b)。

(C)ob/+和ob/ob伤口中活检组织切片的表皮伤口面积。对于每一个指定的时间点，所有测量使用Adobe Photoshop CS5.1从3个随机切片进行3次。使用比例尺将像素针对μm进行标准化。数据为平均值±SEM，n-9(*p<0.05)。

图7.在糖尿病ob/ob小鼠的全厚夹板伤口上局部施用重组ANGPTL4。

(A)举例说明糖尿病小鼠的背部皮肤上全厚切开夹板伤口的位置和尺寸。对每一只小鼠进行cANGPTL4和对照盐水的局部施用。旋转施用部位以避免部位偏倚性。蓝色点线描绘中央切开的伤口组织。

(B)在创伤后第3、5、7和10天拍摄的盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob伤口活检组织的照片。比例尺：5mm。

(C)来自盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob小鼠伤口活检组织的代表性H&E染色。红色箭头表示伤口边缘。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例尺：100μm。WB，创面。

图8.利用ANGPTL4处理的或未利用其处理的伤口听一氧化氮和iNOS水平。

(A)利用检测一氧化氮的DAF-FM双乙酸盐(绿色)染色的伤口活检组织的代表性荧光图像。伤口切片来自ob/+、盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob的创伤后第7天的活检组织。点线描绘表皮与真皮之间的界面。比例尺：50μm。WB，创面。

(B)来自如(A)中描述染色的伤口切片的DAF-FM双乙酸盐的平均荧光强度。从每一个组织的至少3个活检组织和3个显微镜视野计算平均荧光强度值(任意单位，AU，±SEM)。*p<0.05，**p<0.01。

(C)创伤后第7天的ob/+、盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob伤口活检组织的代表性免疫荧光染色iNOS(绿色)。细胞核用DAPI(蓝色)进行复染。点线描绘表皮和真皮之间的界面。比例尺：50μm。

图9.氨基胍对ANGPTL4介导的伤口愈合的作用。

(A)来自2只小鼠的盐水、cANGPTL4-处理的ob/ob以及cANGPTL4和氨基胍(AG)处理的ob/ob伤口的照片。在创伤后第7天拍摄图像。比例尺：5mm。

(B)来自创伤后第7天盐水、cANGPTL4以及cANGPTL4和AG一起处理的ob/ob伤口的伤口切片的代表性苏木精伊红(H&E)图像。比例尺：500μm。箭头指向上皮伤口边缘。

具体实施方式

我们显示了ANGPTL4，特别地C末端血纤蛋白原样结构域(cANGPTL4)的局部施用加速了糖尿病小鼠的夹板伤口模型的创面闭合，并在斜面使命的重塑阶段减少胶原沉积即瘢痕形成。cANGPTL4为细胞基质蛋白，从而其可在伤口愈合过程中调节许多关键调控网络。因此，细胞基质蛋白ANGPTL4比单个细胞因子介导的候选更有效。

因此，本发明的第一方面包括用于增进有此需要的个体的伤口愈合的方法，所述方法包括施用血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段。

血管生成素样4(ANGPTL4)多肽的多肽优选具有约406个氨基酸，编码具有许多活性，例如与创面中的特定基质蛋白相互作用，延迟其被基质金属蛋白酶蛋白水解降解的酶，并通过改变完整基质蛋白的可用性直接影响细胞-基质通信的交叉对话。ANGPTL允许各种细胞例如伤口角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、内皮细胞或炎症细胞与周围ECM的。我们还显示，ANGPTL4减少朝向伤口愈合的后期阶段的胶原沉积。

优选地，血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段包含；(i)SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列：或(ii)在整个长度上与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少60，至少70，至少80，至少85，至少90，至少95，至少97，至少98或至少99％的序列一致性的氨基酸序列：升在其整个长度；或(iii)在其整个长度上与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少70，至少80，至少85，至少90，至少95，至少97，至少98或至少99的序列同源性的氨基酸序列；或(iv)(i)至(iii)中任一项的片段。

优选地治疗活性片段包含血管生成素样4(ANGPTL4)多肽的C末端区域或其功能性片段。在各种不同的实施方式中，片段包含：(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；或(ii)在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99％的序列一致性的氨基酸序列；和(iii)在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99的序列同源性的氨基酸序列。

ANGPTL4(cANGPTL4)的C末端血纤蛋白原样结构域的功能性结构域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其等位变体、同源物或片段的氨基酸186至406或由所述氨基酸组成。cANGPTL4结构域优选包含SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有同源性的序列。

术语“多肽”指的是氨基酸和其等同物的聚合物，并且不指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义内。该术语也不指或不包括多肽的修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。包括在该定义内的是例如含有氨基酸(包括例如，天然氨基酸等)的一种或多种类似物的多肽，天然和非天然存在的具有取代键以及本领域中已知的其他修饰的多肽。

术语“伤口”是指其中皮肤的真皮被破坏从而在动物的皮肤中形成撕裂、切割、穿刺、切口、撕裂、擦伤、裂开、刀痕、划痕、裂缝或破裂的一类伤口。这样的伤口可以包括溃疡例如静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或糖尿病足。糖尿病足是指可能患有糖尿病的个体的下肢上的慢性缓慢愈合伤面。在各种不同的实施方式中，伤口选自溃疡、慢性缓慢愈合伤口和开放性伤口。

增进伤口愈合是指减小伤口表面积的大小，优选直至真皮几乎或完全覆盖区域，基本上愈合伤口。伤口愈合可被测量为伤口表面积相对于施用组合物或本文中描述的组合物时初始表面积的减少的百分比。“治疗”和“医治”和其同义词是指其中通过在最短时间内减小伤口表面积的尺寸来使对象加速(增进)伤口愈合的治疗性治疗。增进伤口愈合可包括减少伤口部位的胶原蛋白的量，减少可见瘢痕形成或增加的一氧化氮合酶(iNOS)表达。治疗可包括手术时患者的预防性被动治疗。需要这种治疗的那些对象包括具有伤口例如切口、溃疡或皮肤的破坏或糖尿病个体中常见的慢性缓慢愈合伤口的对象。个体是指动物，例如哺乳动物，优选人。在各种不同的实施方式中，个体具有糖尿病。

在各种不同的实施方式中，本发明的方法还可包括执行辅助治疗的步骤。辅助治疗可包括清创治疗如使用木瓜蛋白酶或本领域中已知的其他清创剂。辅助治疗可包括细胞因子治疗。辅助治疗可包括高压氧治疗。类似地，辅助治疗可以包括敷料选择和糖尿病鞋或本领域中已知的任何其它治疗。

优选地，血管生成素样4(ANGPTL4)多肽包含；(i)SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列：或(ii)在其整个长度上与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99％的序列一致性的氨基酸序列；和(iii)在其整个长度上与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少70,.至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99的序列同源性的氨基酸序列；(iv)(i)至(iii)的任一项的功能性片段。

优选地，血管生成素样4(ANGPTL4)多肽的C末端区的多肽或其功能片段包含：(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列：或(ii)在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99％的序列一致性的氨基酸序列；和(iii)在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98或至少99的序列同源性的氨基酸序列。

在本发明的说明书中，同源序列被认为包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在氨基酸水平上在至少20、50、100、200、300或400个氨基酸上与SEQ ID.NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID.NO:2所示的氨基酸序列具有至少60％、70、80或90％，优选至少95或98％的同一性。特别地，通常应当考虑已知是蛋白质的功能所必需的那些序列区域而非非必需相邻序列的同源性。本发明的优选多肽包含连续序列，所述序列与SEQ ID NO:1的氨基酸的一个或多个或与SEQ ID NO:2的氨基酸的一个或多个具有大于50、60或70％的同源性，更优选大于80或90％的同一性。

其它优选多肽包含连续序列，所述序列与SEQ ID No:1具有40、50、60或70％的同源性，并且能够结合SEQ ID No:1。其它优选多肽包含一个连续序列，所述序列与SEQ ID No:2具有大于50、60、70或80％的同源性，并且能够结合SEQID NO:2，对伤口愈合具有类似的效果。虽然也可根据序列相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的说明书中，优选地根据序列一致性来表达同源性。术语“大体上的同源”或“大体上的同一性”，当指多肽时，表示所述多肽或蛋白质显示与整个天然存在的蛋白质或其部分至少约70％的同一性，通常至少约80％的同一性，优选至少约90或95％的同一性。

同源性比较可通过眼来进行，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些商购可得的计算机程序可计算两个或多个序列之间的百分比同源性。

可对连续序列计算百分比(％)同源性，即将一个序列与其它序列对齐并一次一个残基地将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的对应氨基酸直接比较。这被称为“无缺口”比对。通常，这种无缺口比对仅对相对短的数目的残基(例如少于50个连续氨基酸)进行。

尽管这是非常简单而一致的方法，但它没有考虑到的是，例如，在另外的相同的一对序列中，一个插入或缺失将使随后的氨基酸残基脱离对齐，从而当进行全局比对时有可能导致10％的同源性的巨大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳比对，所述比对考虑可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性评分。这通过在序列比对中插入“缺口”以试图最大化局部同源性来实现。

然而，这些更加复杂的方法为每一个存在于比对中的缺口分配“缺口罚分”，以便对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对-反映两个比较序列间的较高相关性-将实现比具有许多缺口的序列比对更高的评分。通常使用“仿射缺口成本”，其对于缺口的存在而索取相对较高费用，并对于缺口中每一个随后的残基而索取较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。当然，高缺口罚分将产生具有更少缺口的最优化的比对。大多数比对程序允许缺口罚分被修改。然而，当使用这样的软件进行序列比较时，优选地使用默认值。例如当使用GCGWisconsin Bestfit程序包时，氨基酸序列的默认缺口罚分对为-12(对于缺口)和-4(对于每一个延伸)。

最大同源性百分比的计算因而首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳比对。用于进行这样的对比的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包以及在本领域是已知的其它软件。可进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST包和GENEWORKS成套比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索。

尽管最终的同源性百分比是根据同一性测量的，但其自身的比对过程通常不基于全有或全无对比较。相反，通常使用缩放相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将评分赋予每一个配对比较。这种常用矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST成套程序的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或者提供自定义符号比较表(关于进一步的细节参见用户手册)(如果提供的话)。优选使用GCG软件包的公共默认值的GCG软件包，或在其他软件的情况下默认矩阵，如BLOSUM62。

一旦软件已产生最佳比对，就可能计算百分比同源性，优选百分比序列一致性。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，和产生数字结果。

多肽同源物包括具有氨基酸序列的那些同源物，其中一个或多个氨基酸被另一种氨基酸置换，所述置换大体上不改变分子的生物活性。根据本发明的ANGPTL4或cANGPTL4同源物优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸序列一致性，并且对伤口愈合具有相似作用。本发明的范围内的多肽同源物的实例包括SEQ ID NOS:1或2的氨基酸序列，其中：(a)一个或多个天冬氨酸残基被谷氨酸置换；(b)一个或多个异亮氨酸残基被亮氨酸置换；(c)一个或多个甘氨酸或缬氨酸残基被丙氨酸置换；(d)一个或多个精氨酸残基被组氨酸置换；或(e)一个或多个酪氨酸或苯丙氨酸残基被色氨酸置换。

优选地，"蛋白质"或"多肽"是指由表达SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸序列、其变体或片段编码的蛋白质或多肽。还包括的是由在高或低严格条件下与所述编码核酸杂交DNA编码的蛋白质。还可包括被针对SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的多肽的抗血清获得的密切相关的多肽或蛋白质。

本发明提供了针对多肽或其片段的"蛋白质修饰或片段"，其与一级结构序列大体上同源但包括例如体内或体外化学和生物化学修饰，或掺入罕见氨基酸。这样的修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记，例如，利用放射性核素，以及各种酶促修饰，这对于本领域技术人员将是很容易理解的。多种用于标记多肽的方法和用于此类目的取代物或标记物在本领域中是公知的，包括放射性同位素例如³²P，结合标记的抗配体(例如，抗体)的配体、荧光团、化学发光剂、酶和可用作标记配体的特异性结合对成员的抗配体。标记的选择取决于所需的灵敏度、与引物缀合的容易性、稳定性要求和可用的仪器。标记多肽的方法在本领域中是众所周知的。

“多肽”可包括按照本领域已知的方法，例如在原核或真核细胞中例如在CHO细胞中进行的重组生产，或通过合成方法例如本领域中已知的tBoc或Fmoc产生的本文中描述的任何多肽。或者，组合物可包括在伤口部位增加ANGPTL4的天然表达的激动剂。已知低氧条件诱导ANGPTL4表达。缺氧诱导因子α(HIF-á)诱导ANGPTL4的表达。类似地，过氧化物酶体增殖物-活化的受体(PPAR)蛋白是激活ANGPTL4表达的转录因子。这样组合物就可包括PPAR蛋白或HIF-á蛋白质。

本发明的另一个方面包括用于增进个体的伤口愈合的药物组合物，其包含血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段；和药学上可接受的载体。

本发明的组合物

可以以药物组合物的形式施用根据本发明的产生的多肽以治疗伤口。

因此，本发明还涉及组合物，其包括：

包含有效量的(a)针对血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的激动剂和，或(b)针对血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的C末端区的激动剂和载体。如本文中所用，如果组合物能够影响伤口愈合，则其在治疗上是有效的。

适于局部施用的本发明的药物剂型包括无菌水溶液例如无菌磷酸盐缓冲盐水(其中水可溶的)或分散体和无菌粉剂(用于局部溶液的临时制备)和/或一种或多种载体。或者，可将局部溶液封装在脂质体中进行递送，以帮助它们转运穿过细胞膜。可选择地或另外地，这样的制剂可含有自组装孔结构的成分，以有利于跨细胞膜转运。它必须在生产和贮存条件下是稳定的，并且必须进行防微生物例如细菌和真菌的污染/破坏性作用的保存。

以纯净形式存在的本发明的组合物可以是直接地局部施用于需要治疗的皮肤区域。在各种实施方式中，将直接施用所得的活性化合物而无需稀释，或可选择地，可用水稍微稀释组合物，随后用于局部施用。或者，可配制本发明的活性组合物，通过添加药学上可接受的载体或赋形剂将其作为喷雾剂、肥皂、凝胶、乳膏、洗剂、软膏等局部施用。优选载体包括去离子水、植物油或矿物油、白矿脂、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇。还可包括乳化剂、稳定剂和抗氧化剂以及着色剂和精油(以赋予香味)。

常见地，可将本发明的组合物配制成洗剂或补品，其中将它们直接施用，或用水稀释后施用。还可将组合物配制成乳膏或软膏。在这样的制剂中，可以以10％至60％w/w的基础保湿霜的量添加活性多肽，将其混合在基础霜中。例如，山梨醇烯(sorbolene)乳膏或其它保湿剂可具有以10％至60％w/w的量添加至其中的本发明的组合物。或者，澳洲坚果油、霍霍巴油、杏仁油或其它坚果和种子油可具有以10％>至60％>w/w的量添加至其中的本发明的活性多肽。

其它其中可配制本发明的组合物的局部产品包括皮肤产品例如乳膏剂、凝胶剂、糊剂、乳剂、软膏、喷雾剂、面膜和果皮(peels)等。

与本发明的组合物一起使用的合适的局部媒介物在制药领域中是公知的，包括水、脂质基质材料，包括油和脂肪、皂类、表面活性剂、润肤剂、皮肤调理剂和乳化剂。这些媒介物的实例于马丁代尔大药典(Martindale-The ExtraPharmacopoeia)(Pharmaceutical Press)中进行了描述。很显然，合适的媒介物的选择取决于制剂的递送模式。通常以制药领域中公知的常规方式将活性组合物通常掺入在皮肤病学上可接受的媒介物/载体。

有效量的本发明的组合物至需要治疗的皮肤区域的局部施用提供从各种伤口的症状例如溃疡、慢性非愈合创面和痤疮的快速有效的愈合。处理的皮肤的区域需要改善，因为伤口表面积在尺寸上减小为组合物的第一次施用的百分比，优选其中真皮已重新生长的区域可具有表现光滑和紧绷的皮肤色调。

通常，将本发明的组合物局部施用于动物，优选人，以用于所有表皮伤口的治疗或预防，包括溃疡、昆虫叮咬、第一、第二和第三度烧伤，溃疡、伤口和皮肤感染的愈合。通常，本发明的组合物减少了瘢痕形成并减小多产纤维化对表皮的影响。优选地，可在本发明的组合物施用后相较于其中未施用所述组合物的相似伤口，观察到澄明度、皮肤质地和最终疤痕的外观的一般改善。

通常，将包含本发明的组合物的制剂(例如组合物和载体和/或稀释剂)局部施用至适当的区域，并允许其保持。在各种实施例中，可因此而进行多个应用。因此，典型地，本发明的局部组合物可以以面膜或洗剂或凝胶或乳膏或软膏的形式存在。

载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。载体可以是羧甲基纤维素。适当的流动性可以被保持，例如，在分散体的情况下通过所需颗粒大小的维持，和通过使用表面活性剂。防止微生物在本发明的组合物中的作用是通过添加抗菌和/或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来产生。

可通过在适当的溶剂(上文中已例举了几种其它成分)中按需要，以所需量掺入活性组合物，随后进行过滤灭菌来制备用于局部应用的无菌可注射溶液。一般而言，分散体通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物来制备，所述分散体包含基本分散介质和来自上文中列举的所需其它成分。

活性成分可保持在控制活性剂的释放的基质中。优选地，基质包含选自脂质、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己酸内酯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚己酸内酯、聚乳酸、聚酐、聚丙交酯-共-乙交酯、聚氨基酸、聚环氧乙烷、丙烯酸封端的聚环氧乙烷、聚酰胺类、聚乙烯、聚丙烯腈、聚磷腈、聚(原酸酯)、蔗糖乙酸异丁酸酯(SAIB)及其组合和其它聚合物的物质。优选地，基质持续释放激动剂。

药学上可接受的载体和/或稀释剂也可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。载体和/或稀释剂可以是羧基甲基纤维素。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则预期在治疗组合物中使用其。

组合物可进一步包含辅助治疗剂。在各种实施方式中，辅助治疗剂可包括清创剂，例如木瓜蛋白酶。优选地多肽或组合物适合用于在伤口部位的治疗。

“治疗”和“医治”及其同义词是其中通过在最短时间内减小伤口表面积的尺寸、减少伤口部位的胶原的量、减少可见瘢痕形成或增加的一氧化氮合酶(iNOS)表达来使对象加速(增进)伤口愈合的治疗性治疗。治疗可包括手术时患者的预防性被动治疗。需要这种治疗的那些对象包括具有伤口例如切口、溃疡或皮肤的破坏或糖尿病个体中常见的慢性缓慢愈合伤口的对象。个体是指动物，优选人。

关闭伤口愈合是指减小伤口表面面积的大小，优选直至真皮几乎或完全覆盖区域，基本上愈合伤口。伤口愈合可被测量为伤口表面积相对于施用本文中描述的多肽或组合物时的初始表面积的减少的百分比。

治疗有效量将能够在伤口部位增加血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)多肽。如本文中所用，组合物的“治疗有效量”是能够加快(增进)伤口愈合的活性剂的量。本发明的组合物在药物组合物中的剂量和施用可通过临床药理学或药代动力学的领域中的普通技术人员来确定。待治疗用的组合物例如多肽的有效量，将取决于例如治疗对象、施用途径和哺乳动物的状况。因此，治疗师必需滴定剂量并改变施用途径(根据需要)，以获得最佳的疗效。典型的日剂量可能在约10ng至高达100mg/伤口或更多/天的范围内，优选地在约1μg至10mg/伤口的范围内。剂量可包括在10至100μg/伤口的范围内的任何地方，或更优选25、50或75μg/伤口的蛋白质量。

优选地，血管生成素样4(ANGPTL4)多肽或其治疗活性片段是如上文中所描述的。

伤口部位是指其中皮肤的真皮被破坏从而在动物的皮肤中形成撕裂、切割、穿刺、切口、撕裂、擦伤、裂开、刀痕、划痕、裂缝或破裂的一类伤口。这样的伤口可以包括溃疡例如静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或糖尿病足。糖尿病足是指可能患有糖尿病的个体的下肢上的慢性缓慢愈合伤面。优选地，伤口部位选自溃疡、慢性缓慢愈合伤口和开放性伤口。

本发明的另一个方面包括确定伤口部位是否将变成慢性缓慢愈合伤口的方法，包括以下步骤：(a)测定存在于获自伤口部位的样品中的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的水平，(b)将来自样品的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的水平与来自健康个体(具有正常伤口愈合)的对照相比较，其中相较于对照，样品中降低的水平的ANGPLT4表明伤口部位将变成慢性缓慢愈合伤口。

慢性缓慢愈合伤口是指受损的伤口愈合或在4周内不表现遵循正常愈合过程的伤口。

方法还可包括测定疑似具有慢性缓慢愈合伤口的个体的血糖水平的步骤，其中相较于健康个体的血糖水平，高血糖水平进一步表明该伤口部位将成为慢性缓慢愈合伤口。

由伤口角蛋白细胞产生的ANGPTL4与创面中的特定基质蛋白相互作用，从而延迟了MMP对它们的蛋白水解降解，并通过改变完整基质蛋白的可用性直接影响细胞-基质的通信。因此，ANGPTL4的多方面作用联系炎症、糖尿病和伤口愈合。

糖尿病性伤口的管理是复杂的，需要多学科的方法。糖尿病性伤口的特征在于失活组织的积累、慢性炎症、不良伤口相关血管生成和几种ECM分的缺乏。尽管存在来自不良糖尿病伤口愈合的巨大医学负担，但一直缺乏可再生该被破坏的ECM的有效疗法。

我们已经表明，ANGPTL允许各种细胞例如伤口角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、内皮细胞或炎症细胞因与周围ECM交叉对话，从而使其比单个细胞因子介导的候选更有效。我们还发现，ANGPTL4在接近我们的糖尿病伤口愈合的后期减少胶原沉积。与PDGF不同，可将ANGTPL4作为局部乳膏或通过生物相容性支架进行施用。ANGPTL4也可用作抗瘢痕形成剂。

我们的研究表明，操纵ANGPTL4可提供糖尿病相关并发症例如糖尿病足部溃疡的辅助或新的治疗途径。其抗瘢痕性质可彻底改变伤口愈合策略，不仅通过提高愈合速率而且还通过改善皮肤的美学外观。还可将其掺入非处方乳膏、伤口石膏、敷料等以改善愈合和减少瘢痕形成。

具体实施方式

我们显示，重组ANGPTL4的局部施用促进糖尿病小鼠的伤口愈合。ANGPTL4通过整联蛋白β1信号传导/iNOS表达的pSTAT3诱导在受伤的角蛋白细胞中升高NO产量水平。伤口微环境中升高的NO通过稳定ID3 mRNA减少胶原瘢痕组织，所述ID3抑制皮肤成纤维细胞的COL1A2表达。我们聚焦的基因表达谱分析也揭示，当与野生型对应物(ob/+)相比较时，在糖尿病小鼠伤口(ob/ob)中观察到的大部分细胞因子、生长因子和转录因子的失调的时间和表达水平，在利用ANGPTL4处理后得以恢复。我们的研究表明ANGPTL4的替换提供了糖尿病相关并发症例如糖尿病足溃疡的辅助或新的治疗途径。

实施例1

动物。杂合BTBR.V(B6)-Lep^ob/WiscJ小鼠(+/ob)购自The JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)。通过与+/ob同胞仔品种间杂交获得年龄和性别匹配的纯合ob/ob和野生型(+/+)。在3周龄时，将后代与它们的亲代分离，使用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行基因分型。雄性C57BL/6J小鼠获自新加坡国立大学实验动物中心。在12h的光暗周期下，将本研究中使用的所有小鼠单个地笼养在温度受控的房间(23℃)中，并允许随意获取标准小鼠食物饮食和水。突变小鼠从8周龄开始表现出严重糖尿病病症，糖尿病小鼠的血糖水平为473±14.6mg/dL，非糖尿病小鼠为122.5±5.21mg/dL，如通过Accu-Chek Advantage血糖仪(Roche Diagnostic)测定的。

实施例2

利用PCR-RFLP对杂交小鼠进行基因分型。从每只小鼠收集小尾巴活检组织以进行基因分型和在麻醉后进行耳朵标记。使用如先前描述的²⁵的改良的蛋白酶K方案提取基因组DAN。使用PCR-RFLP测定对提取的DNA进行基因分型。引物序列为(5'-TGTCCAAGATGGACCAGACTC-3')和(5'-ACTGGTCTGAGGCAGGGAGCA-3')。用DdeI限制性内切酶消化PCR产物。通过2％琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段。通过使用PCR-RFLP，+/+小鼠显示单个155-bp的条带；杂合(+/ob)和纯合突变体(ob/ob)分别产生3个条带(155、100和55-bp条带)和2个条带(100和55-bp的条带)。

实施例3

受损的糖尿病伤口愈合中降低ANGPTL4表达。为了证明相较于正常(OB/+)小鼠，糖尿病小鼠(ob/ob)的受损的伤口愈合，我们评估进展情况和对ob/+与ob/ob小鼠之间的全厚切除夹板伤口的进展和动力学。

手术前，通过单次利用氯胺酮/甲苯噻嗪(80mg/kg+10mg/kg)的腹膜内麻醉来麻醉小鼠。在每一只小鼠的背内侧背上产生全厚切除伤口(0.5x0.5cm²)。在创伤后第0、3、5、7和10天通过CO₂吸入对小鼠实施安乐死。在指定的时间上，对伤口活检组织进行照片成像、组织形态学和其它生物学分析。

肉眼观察表明，当与到创伤后第10天具有完全伤口闭合的ob/+小鼠相比较时，ob/ob小鼠闭合伤口的40％(图1A)。当与ob/+小鼠相比较时，在ob/ob中创伤活检后第3、5、7和10天的苏木精和伊红(H&E)染色显示受损的上皮再生和肉芽组织形成。在创伤后第7天观察到ob/+伤口的完全再上皮化(图6A)。

将伤口活检组织在4℃下于4％多聚甲醛-PBS中固定过夜，随后包埋在OCT组织冷冻介质(Leica)中，用液体氮立即冷冻。将8μm厚的冰冻切片用于组织学染色。中央解剖的ob/ob伤口切片的组织形态学分析显示创伤后第3-10天之间的显著延迟的再上皮化(ob/+相对ob/ob：第3天，52.1％对79.6％，p<0.01；第5天，13.3％对35.4％，p<0.01；第7天，3.0％对28.6％，p<0.01；第10天，0％对23.6％，p<0.01；图1B和图6B)。在创伤后第10天，ob/ob小鼠的创面上方的表皮伤口区域相较于ob/+小鼠仍然较大(11.8x 10⁵对2x 10⁵μm²，p<0.01；图6C)，表明ob/ob小鼠中伤口再上皮化的延迟的决定。

ANGPTL4对于正常的全厚度切除伤口的愈合是非常重要的。ANGPTL4缺陷型小鼠显示与扰乱的角质形成细胞迁移、高度表明糖尿病伤口愈合的不良伤口相关血管生成相关的伤口愈合的延迟。为了调查ANGPTL4在糖尿病性伤口中的作用，我们首先比较受伤的ob/ob小鼠与ob/+小鼠之间的ANGPTL4mRNA和蛋白质的时空表达谱。

RNA提取和反转录。在指定的时间上，如先前所描述²⁶，切取皮肤伤口活检组织，使用Illustra RNAspin Mini(GE Healthcare)，按照供应商的方案提取总RNA。使用五个总RNA微克逆转录使用RevertAid^TM H Minus M-MuLV利用寡聚-dT引物反转录5μg的总RNA。利用RNA酶H消化去除RNA，随后进行定量实时PCR(qPCR)。使用RecoverAll^TM总核酸分离(Ambion)从人糖尿病性伤口的存档多聚甲醛固定、石蜡包埋的切片(FFFPE)分离总RNA。按照制造商的建议，将50ng的RNA经历Full Spectrum^TM完全转录组RNA扩增(System Biosciences)，随后进行qPCR。定量实时PCR(qPCR)分析显示，相较于ob/+小鼠，从创伤后第3天ob/ob小鼠中的ANGPTL4表达降至约1/2(ob/ob对ob/+：第3天，0.790对0.511，p<0.01；第5天，0.735对0.222，p<0.01；第7天，0.359对0.164，p<0.01；图1C)。

用冰冷的蛋白质裂解缓冲液pH 8.0(20mM Na₂H₂PO₄，250mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS和1mM PMSF)将伤口检组织进行匀浆中。通过氯仿/甲醇溶剂法使蛋白质裂解物沉淀，随后将其在10％SDS-PAGE上进行分离。将蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。将膜用含0.05％Tween-20的TBS(0.25MTris.Cl，pH 7.6，1.5M NaCl)中的5％的脱脂乳进行封闭。用指定的一抗将膜在4℃温育过夜，在室温下于适当的抗IgG-HRP二抗(1:10000)中进行1小时。使用Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP底物(Millipore)显现蛋白质条带，借助于ImageJ 1.38x版(NIH)通过光密度法定量信号。与qPCR数据一致，western印迹分析显示相较于ob/+小鼠，在创伤后第5天在ob/ob小鼠中ANGPTL4的水平降至约1/5(ob/ob对ob/+；第3天，2.36对1.43，p<0.05；第5天，1.90对0.38，p<0.01；第7天，1.21对0.93，p<0.01；第10天，1.25对0.62，p<0.01；图1D)。

类似地，ob/ob小鼠的第3-10天的伤口活检组织的免疫荧光染色显示，当与ob/+(图1E)相比较时，伤口上皮细胞和创面中较低的ANGPTL4表达。将伤口活检组织在4℃下于4％多聚甲醛-PBS中固定过夜，随后包埋在OCT组织冷冻介质(Leica)中，用液体氮立即冷冻。除使用缀合有Alexa488-或Alexa594的二抗外，如先前所述²⁸，将8μm厚的冰冻切片用于免疫组织学染色。根据制造商的建议(Roche)，使用TUNEL测定检测凋亡细胞。作为TUNEL测定的阳性对照，用DNA酶I预处理切片。用DAPI(Vectashield)复染载玻片，使用Eclipse TE2000-U显微镜(Nikon)捕捉图像。

实施例4

cANGPTL4的局部应用提高了糖尿病性伤口的愈合速度。随后，我们检查了重组ANGPTL4的局部施用对糖尿病性伤口愈合速度的效果。我们在DB小鼠的背侧表面上施以两个完整切除的夹板伤口，并用cANGPTL4处理一个伤口，另一个伤口用4％羧甲基纤维素中的盐水处理(图7A)。

在每一只小鼠的背内侧(dorso-media)后部上产生两个圆形的直径5mm全切除伤口，将直径为10mm的硅环形夹板置于伤口上方中央。用氰基丙烯酸酯胶将硅夹板粘附至皮肤。在手术当天(第0天)，50μL的与1％羧甲基纤维素(CMC)混合的1mg/mL或2mg/mL或PBS的重组人ANGPTL4(rhANGPTL4)蛋白局部施用至它们各自的皮肤伤口，在整个研究的持续时间中利用封闭敷料(Tegaderm，3M)保护伤口。

伤口的图像显示在创伤后第7和10天，cANGPTL4-处理的ob/ob小鼠相较于盐水处理的ob/ob小鼠的伤口闭合的显著改善(图7B)。如实施例3所述从在指定的天数上收获的伤口获得的切片的组织形态学检查表明，相较于盐水对照，cANGPTL4显著加速再上皮化，如通过减小的上皮间隙所指示的(盐水处理对cANGPTL4处理的；第3天，76.2％对60.1％，p<0.05；第5天，34.3％对28.1％，p<0.05；第7天，25.6％对4.6％，p<0.01；第10天，20.3％对0％，p<0.01；图2A和图7C)。ANGPTL4处理的伤口显示相较于盐水对照在第7-10天，总体表皮伤口面积的显著减小(3.6x 10⁵对6.0x 10⁵μm²，p0.01；图7D)。

生长因子和细胞因子的产生的失调以及信号级联的随后异常活化促成不良糖尿病伤口愈合。已知这些因子和信号介质在细胞的趋化、迁移、刺激和增殖中必不可少的，并且基质物质是伤口愈合所必需的。为了调查利用ANGPTL4治疗糖尿病性伤口是否可影响参与伤口愈合的几个生物学方面的各种基因的表达谱，在不同的创伤后天数，对来源于用ANGPTL4处理的ob/+、ob/ob和ob/ob小鼠的伤口活检组织进行集中的qPCR阵列。

我们分析了总共79个基因，可将其在伤口愈合过程中的时间表达谱聚类至它们的生物学功能例如增殖、血管生成、细胞迁移、胞外基质(ECM)、细胞凋亡和炎症中(图2B)。实时PCR测定用于分析聚焦的一小组基因的表达。利用KAPA^TMSYBR qPCR通用预混合物(KAPABiosystems)进行qPCR。解链曲线分析被包含来确保仅形成一种PCR产物。引物被设计用来产生100至250bp的PCR扩增产物。随后仅将产生唯一扩增产物而无引物二聚体形成的引物对用于实时PCR测定。表达与对照基因核糖体蛋白P0(RPLP0)相关，所述蛋白在所研究的任何实验条件下不发生改变。qPCR引物的序列可在表1中获得。

表1.引物对序列的列表

从qPCR聚焦的阵列数据(表2、3和4)构建热图来进行比较(图2B)构成。我们的分析表明，在可能的79中有18个基因(～22.7％)，其中大多是与血管生成和炎症相关的基因，已回复至利用cANGPTL4处理的ob/ob的ob/+基因表达谱(图2C)。

表2.Ob/+伤口中的基因表达

表3.ob/ob伤口中的基因表达

表4.ANGPL4处理的ob/ob伤口中的基因表达

为了进一步理解ANGPTL4如何提高糖尿病性伤口的愈合速度，我们使用实施例3中所述的western印迹研究相较于ob/+和ob/ob，利用ANGPTL4处理的ob/ob的特定蛋白质标志例如内皮细胞标志(CD31)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、细胞增殖标志(PCNA)和巨噬细胞标志(F4/80)的表达的时间过程。如所预期的，自创伤后第3天以来，当与正常ob/+伤口相比较相比较时，盐水处理的ob/ob伤口显示减少的CD31和αSMA表达(图2D，E)。值得注意地，cANGPTL4-处理的ob/ob伤口的CD31和αSMA表达谱与ob/+相似(图2D，E)。

与western印迹数据一致，在创伤活组织检查后第5天，如实施例3中所描述的，CD31的免疫荧光染色显示相较于盐水处理的ob/ob伤口cANGPTL4-处理的ob/ob伤口的内皮脉管系统的增加(图2F)。与ob/+伤口相反，ob/ob伤口中F4/80和PCNA的表达保持升高直至创伤后第10天，这表明巨噬细胞的持久浸润和活化(图2D，E)。虽然相较于盐水对照ANGPTL4处理的伤口中F4/80和PCNA的表达模式保持不变，但它们的总体表达水平略微降低(图2D)。综上所述，观察表明ANGPTL4改善糖尿病性伤口听血管生成。

实施例5

GPTL4调节ob/ob伤口中的NO产生谱。为了理解ANGPTL4如何调节血管生成，我们研究NO的水平，所述NO是血管生成的强效介质。我们的早期聚焦的基因阵列分析还显示iNOS的表达在ANGPTL4处理的ob/ob伤口中相较于盐水处理得以显著升高(参见图2B)。已显示一氧化氮通过促进内皮增殖、角蛋白细胞迁移和间接减少炎症来改善组织修饰。

使用细胞渗透性4,5-二氮基-荧光素(DAF-FM双乙酸盐)(Invitrogen，USA)测量来自伤口活检组织的NO的细胞内水平。将伤口活检组织在Krebs缓冲液中裂解，与10μΜDAF-FM双乙酸盐一起在37℃于黑暗处温育30分钟。使用GloMax 20/20照度计(Promega，USA)在495nm激发和515nm发射波长立即记录荧光团信号。荧光表达为任意荧光单位(AU)，对于所有实验利用相同的仪器设置来进行测量。

使用DAF-FM双乙酸盐，我们比较来自盐水和ANGPTL4-处理的ob/ob的创伤后活检组织中的NO水平。我们观察到当与ob/+伤口比较时ob/ob中总体下降的NO水平(图3A)。ANGPTL4处理的ob/ob伤口显示当与盐水对照相比较时从创伤后第3天开始以后在NO产量上存在显著的增加，表明ANGPTL4可介导NO产生(图3A)。通过对伤口活检组织使用DAF-FM双乙酸盐荧光染色，我们观察到NO水平在ANGPTL4处理的ob/ob伤口组织，特别在伤口上皮和真皮创面中升高(图8A)。为了进一步理解背后的机制，我们研究在指定的创伤后天数上的iNOS、eNOS和NO水平的mRNA表达水平。与其eNOS表达在创伤后第7天达到峰值的ob/+伤口相反，ob/ob伤口中的eNOS表达在创伤后第3天更早地达到峰值(图3B，左图框)。利用ANGPTL4的处理使eNOS的峰值表达偏移至创伤后第5天，但对表达水平没有影响，表明这可能是第二效应。我们还使用原代人皮肤微血管内皮细胞确认ANGPTL4不调节eNOS的表达(图3B，右图框)。我们的结果显示当与其iNOS表达在创伤后第3天短暂地达到峰值的正常ob/+小鼠相比较时，糖尿病ob/ob小鼠几乎不表达iNOS mRNA。糖尿病性伤口的ANGPTL4处理增加iNOS表达，虽然在创伤后第7天达到峰值(图3C，左图框)。我们还确认ANGPTL4增加第7天的伤口活检组织的成纤维细胞的iNOS的表达(图3C，右图框)和免疫荧光染色，如实施例3中描述的(图3D)。综上所述，观察表明ANGPTL4的处理调节iNOS的表达，所述iNOS在伤口部位增加NO生成。

实施例6

ANGPTL4调节iNOS表达。ANGPTL4^-/-小鼠在伤口愈合过程中显示受损的血管生成。糖尿病性伤口的特征在于不良伤口相关血管生成¹，其类似地表达低水平的ANGPTL4蛋白(图1D)。NO的促血管生成作用是已知的^18-20。然而，ANGPTL4如何调节iNOS，从而调节NO生成仍然不清楚。ANGPTL4结合整联蛋白，激活粘着斑激酶，随后激活下游介质例如ERK1和STAT以调节基因表达和细胞行为^17,21。已显示转录因子STAT和NF-κB转录调节iNOS的表达²²。因此，我们首先通过实施例3中所述的免疫荧光染色研究磷酸化STAT1、3和NF-κΒ在伤口活检组织中的表达水平。我们在利用cANGPTL4处理的ob/ob伤口中观察到相较于盐水处理升高的水平的磷酸化STAT1、3和NF-κΒ(图4A)。随后，我们进行体内染色质免疫沉淀(ChIP)以确定这些转录因子是否结合至小鼠iNOS基因的调控区。我们的ChIP显示在ANGPTL4处理的但非盐水处理的ob/ob伤口中磷-STAT1、STAT3和NF-κΒ特异性结合至它们在小鼠iNOS基因的启动子中的同种应答元件(图4B)。对于免疫前IgG和对于启动子iNOS基因中的应答元件上游的控制序列未看到免疫沉淀和扩增(图4B)。已显示一氧化氮分别通过不依赖于转录的mRNA的稳定化和细胞蛋白质靶的修饰^23,24调节基因表达和蛋白质活性。特别有趣地，我们观察到DNA结合3(ID3)的转录因子抑制剂的mRNA表达在利用ANGPTL4处理的原代成纤维细胞中升高(图4C)。已显示一氧化氮稳定ID3 mRNA23。因此，我们研究在放线菌素D存在的情况下，利用ANGPTL4或盐水处理的成纤维细胞中的mRNA水平。我们的数据显示相较于盐水处理，ANGPTL4处理的成纤维细胞的ID3 mRNA水平较慢地降低(图4D)。综上所述，这些观察表明ANGPTL4刺激NO生成的水平，至少通过牵涉iNOS基因的转录调控(通过STAT1、3和NF-κB至启动子上的直接结合)的机制。此外，我们还显示ANGPTL4诱导的NO产生稳定ID3 mRNA。

实施例7

ANGPTL4减少胶原在ob/ob伤口中的沉积。延迟的糖尿病伤口愈合导致胶原在创面的过量产生和沉积，这至少部分地可归因于降低NO水平。研究已显示NOS的表达和NO产生在人肥厚性瘢痕和糖尿病性伤口^27,28中减少。为了阐明ANGPTL4是否可影响瘢痕形成的水平，我们测量盐水和cANGPTL4-处理的ob/ob伤口中的胶原沉积。首先，我们测量来自盐水处理的和ANGPTL4处理的ob/ob伤口的每一个伤口活检组织的羟脯氨酸(胶原的主要成分)的量。

羟脯氨酸测定。将伤口活检组织在液氮中冷冻，随后于蒸馏水中充分匀浆。预先测定伤口活检组织的净重量以便标准化。此外，将反-4-羟基-L-脯氨酸(0-300μg/mL)包括作为标准。在2N NaOH中于120℃水解样品的等分(50μL)，进行2小时，随后用氯胺-T试剂(0.0127g/mL)在室温氧化25分钟。随后通过添加对-二甲氨基苯甲醛(DMBA)试剂(0.3g/mL，溶解于甲醇/盐酸溶液(2:1v/v)中)使生色团显色。使用M2e Multi-Mode微板读数器和Pro微板数据获取和分析软件(Molecular Devices，USA)在550nm测量形成的淡红色复合物的吸光度。将吸光度值针对标准羟脯氨酸的浓度作图，随后从标准曲线测定未知羟脯氨酸的值。

我们仅对创伤后第10天的伤口活检组织检测到降低的水平的羟脯氨酸，其中在ANGPTL4处理的伤口中观察到完全创面闭合(图5A和2A)。使来自小鼠伤口活检组织的伤口组织切片的Van Gieson杂色脱蜡，随后在PBS中再水化。将这些切片在Weigert铁苏木素中在室温下染色8分钟，随后在室温于苦味酸-品红溶液中染色1分钟。Van Gieson染色显示当与盐水处理的ob/ob伤口比较时cANGPTL4-处理的ob/ob伤口中创面上的胶原沉积减少(图5B)。

随后，我们用ANGPTL4和氨基胍(一种iNOS的选择性抑制剂)共处理ob/ob伤口。与我们的上述发现一致，伤口再上皮化被延迟(图9)并且伤口部位具有较高水平的胶原沉积，如通过Masson三色染色证明的(图5C)。为了进一步确认我们的观察：ANGPTL4减少胶原瘢痕组织，我们使用扫描和透射电子显微镜来表征盐水和ANGPTL4处理的ob/ob伤口中的胶原纤维的构造重排。如所预期的，盐水处理的伤口的胶原纤维较厚，并且处于明显的单一方向排列(图5D)，指向瘢痕组织形成。相反地，ANGPTL4处理的伤口中的胶原纤维较细并处于随机化排列中(图5D)。综上所述，我们表明ANGPTL4在ob/ob糖尿病性伤口加速再上皮化和减少胶原瘢痕组织。

实施例8

试剂。使用的抗体：Ki67和角蛋白6(NovoCastra)；PCNA(PC10)和αSMA(α-SMI)(Santa Cruz Biotechnology)；CD31(BD Pharmingen)；CD68(FA-11)(Biolegend)；F4/80(AbD Serotec)；cANGPTL4：抗ANGPTL4的C末端小鼠(190-410个氨基酸)的单克隆抗体分别由ProSci产生；山羊抗-兔和抗-小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)；Alexa Fluor 488或594山羊抗-小鼠IgG、抗-大鼠IgG和抗-兔IgG(Molecular probes)。DAB过氧化物酶底物试剂盒(VectorLaboratories)。除非另外提及，否则所有化学试剂皆来自Sigma-Aldrich，并且分子生物学酶来自Fermentas。所有寡核苷酸均由Sigma-Proligo合成。

实施例9

伤口愈合的评估。在创伤后第1、3、5、7和10天，使用Canon G12数字相机捕捉伤口图像。每一个图像中包含标尺来允许进行测量的标准校准。使用Plus 5.1.0.20版软件(Media Cybernetics，USA)定量表面伤口面积。对每一个时间点上的表面伤口面积进行标准化，将其表达为占第1天的初始伤口面积的百分比(100％)。从切片通过伤口中心进行组织形态计量学测量以获得实际的伤口呈现。通过苏木精-伊红染色法对随指定的时间流逝伤口活检组织的切片进行染色。使用10x/0.30物镜利用Nikon Eclipse 90i亮视野显微镜显现组织学图像，利用QCapture Pro 5.0.1.26版软件(Qlmaging)拍摄所述图像。使用Adobe PhotoshopCS5.1从随机切片进行3次测量，使用比例尺将图像素针对μm进行校准。

“包含”，其意指包括，但不限于在词语“包含”之后的任何事件。因此，术语“包含”的使用表示所列元素是必需的或强制性的，但其它元素是任选的并且可存在或不存在。

“由...组成”是指包括，但不限于短语“由...组成”之后的任何事件。短语“由...组成”表示所列元素是需要的或强制性的，并且可以不存在其它元素。

可在本文中未明确公开的任何元素或多个元素、限制或多个限制不存在的情况下适当地实践本文中举例说明性地描述的本发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地读出而无限制。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且不存在使用这样的术语和排除所示的和描述的特征的任何等价物或其部分的表达的意图，但应承认，各种修改可能在所述发明的范围内。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方式和任选特征明确地公开，但本文中公开的于其中体现的本发明的修改和变化可求助于本领域普通技术人员，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。

与给定数值(例如对于温度和时间段)相关的"约"，其意指包括在指定值的10％内的数值。

本发明已在本文中被广泛和一般性地描述。落在一般性公开内容内的每一个更窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的带有从该属中去除任何主题的附带条件或消极限制的一般性描述，而无论切除的材料是否在本文中被明确地引用。

其它实施方式在下列权利要求和非限制性实施例内。此外，当根据马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域普通技术人员将承认，本发明也由此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来进行描述。

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