一种盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的制备方法及通过该方法制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂，其中，所述方法包括如下步骤：a)将磷脂、胆固醇和修饰材料溶于乙醇得有机相，将该有机相注入到含梯度调节剂的水溶液中搅拌，经均质形成空白脂质体；b)采用切向流过滤的方法用去离子水将空白脂质体外水相中的离子梯度调节剂置换出来，形成空白脂质体内外水相的离子浓度梯度；c)取盐酸拓扑替康，与步骤b)形成的空白脂质体混合，在高于所述磷脂相转变温度的温度下孵化，得到盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。该方法操作简单、耗时较少、质量易控，适合工业化大量生产。

说明书

技术领域

本发明属于药品制剂领域，具体涉及一种盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的制备方法，以及通过该方法制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。所述方法操作简单、耗时较少、质量易控，适合工业化大量生产。

背景技术

拓扑替康（Topotecan，TPT）是一种新型喜树碱半合成衍生物，对多种肿瘤，如非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、血液淋巴瘤等均具有疗效，是DNA拓扑异构酶I(Topo I)的抑制剂，拓扑替康与其活性代谢产物通过与DNA-Topo-1复合体的稳定结合引起DNA单链的断裂，使DNA产生不可逆的损伤而死亡。

目前，国内上市的产品为盐酸拓扑替康的注射剂，该药抗癌活性强，作为常用的肿瘤化疗药物，骨髓抑制常见的毒性为3-4度中性粒细胞减少和血小板降低，常见不良反应为食欲下降、恶心、呕吐、脱发和疲乏等，这些不良反应给患者带了巨大的痛苦，大大限制了该药在临床上的使用。

纳米制剂技术在药物研究中的应用正是基于它能改变药物在制剂中的存在状态而使药物表现出缓控释性、靶向性，从而提高药物疗效、降低药物的毒副作用等。纳米制剂技术在药物研究中的应用大致可分为二方面，一是纳米药物粒子的制备，例如纳米结晶技术、超细粉碎(纳米级)技术等，使药物的粒径在1000nm以下；二是纳米药物载体的制备，纳米载药系统(nanoparticle delivery system，NDS)，使用于载药的载体尺寸在纳米级。由于肿瘤血管间隙可达到100-780nm，正常血管内皮细胞之间的间隙通常在2nm左右。静脉注射给药后，纳米制剂可有效穿透肿瘤区的血管，聚集在肿瘤区，更好发挥疗效，成为国际药剂学界研究的热点领域。大量的研究表明它在肿瘤治疗领域具有潜在的应用价值。

针对拓扑替康治疗肿瘤中出现的问题，已经制备了一种盐酸拓扑替康长循环脂质体，实现靶向给药，降低游离药物在人体内其他组织部位的分布，降低毒副作用，减少不良反应，大大提高了药物的治疗效果。

但是，盐酸拓扑替康是一种水溶性药物，采用薄膜分散法、乙醇注入法等常规方法制备脂质体时，药物不易进入脂质体内水相，致使包封率低。由于盐酸拓扑替康是两亲性弱碱性药物，适合采用离子梯度法制备脂质体制剂，即以离子梯度调节剂为水相制备空白脂质体，此时脂质体的内水相和外水相都含有等浓度的离子梯度调节剂，然后以去离子水置换外水相的离子梯度调节剂，造成脂质体内外调节剂的浓度梯度，再将温度提高到脂质体相变温度以上，依靠离子梯度调节剂浓度梯度的驱动，即主动载药，将盐酸拓扑替康载入脂质体内，能极大地提高药物在脂质体内的包封率。

在如上的制备过程中，一个关键的步骤就是置换外水相的离子梯度调节剂，引起脂质体内外调节剂的浓度梯度。目前，常用的方法是透析袋透析或葡聚糖凝胶G50洗脱分离。这两种方法存在的问题是处理量少，会稀释原脂质体的浓度，因此只适合实验室小量的应用，不适合大规模样品的处理。

常规过滤或者超滤的方法去除外水相离子梯度调节剂，建立离子梯度时存在随着过滤的进行，会出现过滤或者超滤效率下降的问题，切向流过滤的过滤方向跟滤液流动方向垂直，在以多孔膜作为过滤介质的过程中，剪切力抑制了溶质的沉积，保证了截留颗粒或者分子能够从溶液中分离，该方法受到压力、介质类型、膜材料、pH酸碱度以及粘度等因素的影响，目前在医药领域主要是应用于细胞收集、蛋白浓缩、蛋白脱盐、抗生素纯化等方面，本发明将其应用与脂质体外水相离子梯度调节剂的去除，在具有较大创新性的同时，能够满足工业化生产的要求。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的发明人进行了广泛深入的研究，最终得到本发明。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种制备盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将磷脂、胆固醇和修饰材料溶于乙醇得有机相，将该有机相注入到含离子梯度调节剂的水溶液中搅拌，经均质形成空白脂质体；

b)采用切向流过滤的方法用去离子水将空白脂质体外水相中的离子梯度调节剂置换出来，形成空白脂质体内外水相的离子浓度梯度；

c)取盐酸拓扑替康，与在步骤b)中形成的空白脂质体混合，在高于所述磷脂相转变温度的温度下孵化，得到盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。

在所述方法中，所述磷脂优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、鞘磷脂、心磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化卵磷脂。

步骤a)中的搅拌的转速可以设定在200-600rpm。

所述离子梯度调节剂用以在空白脂质的内外水相中形成离子梯度实现对盐酸拓扑替康的主动载药，从而提高盐酸拓扑替康在脂质体纳米制剂中的包封率。本发明中，对离子梯度调节剂没有特殊要求，只要其是药学上可接受的并可以在内外水相中形成离子梯度实现对盐酸拓扑替康的主动载药即可。优选地，离子梯度调节剂选自柠檬酸、硫酸铵、硫酸铜、钙离子载体A23187；优选硫酸铵，硫酸铵实现主动载药的同时，能够在内水相中与盐酸拓扑替康形成结构稳定的螯合物，使药物不容易泄露出来。所述离子梯度调节剂溶液为水溶液，其浓度范围为50-400mM，pH为3-6。

所述修饰材料用于实现脂质体纳米制剂的主动靶向及长循环功能，延长药物在血液中的循环时间，增加药物在肿瘤部位的蓄积，以进一步提高药效，降低毒性。本发明中，所述修饰材料优选为分子结构中含有聚乙二醇部分的材料，优选为选自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE），其中聚乙二醇部分的数均分子量优选为1000-5000。

在所述方法中，涉及各组分的用量优选为盐酸拓扑替康1重量份；磷脂10-30重量份；胆固醇2-5重量份；修饰材料1-5重量份。进一步优选地，乙醇为1-3重量份，含有离子浓度调节剂的水溶液为50-150重量份。

所述磷脂相转变温度是指脂质凝胶态和液晶态之间相互转变时的温度。在高于磷脂相转变温度的温度下孵育，可使脂质膜通透性增强，盐酸拓扑替康在离子梯度的驱动下更易透膜，聚集于脂质体的内水相中。

在所述方法中，孵化的温度优选为45～70℃。

在所述方法中，使用切向流过滤时，优选地，滤膜材料选自聚醚砜树脂（PES）和三醋酸纤维素（CT），通过滤膜的流速为20-400ml/min，过滤系统中压力在0-5Bar之间，置换外水相的去离子水的体积与空白脂质体的体积比为6-15。

在所述方法得到的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中，90wt%以上的盐酸拓扑替康包载在由磷脂、胆固醇以及修饰材料形成的空白脂质体中，在优选的实施方式中，92wt%以上的盐酸拓扑替康包载在空白脂质体中，在更优选的实施方式中，95wt%以上的盐酸拓扑替康包载在空白脂质体中。

在所述方法得到的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中，盐酸拓扑替康脂质体的粒径在100nm以下，在实施方式中，制得的盐酸拓扑替康脂质体的粒径在50-95nm。

在制备空白脂质体后，本发明采用切向流过滤的方法置换空白脂质体内水相中的梯度调节剂，形成空白脂质体内外水相的离子浓度梯度。切向流过滤是一种能分离不同分子量物质的过滤系统。如图2所示，当两种不同分子量的物质经过膜时，小分子物质透过膜孔被排除，而大分子物质则不能透过膜孔。由于物质通过方式是切向流，不能透过膜孔的大分子物质不会堆积在膜表面，而顺着切向流被带走，如此可以循环流动的切向流对膜产生的压力又能促使小分子物质透膜排除。因此，切向流过滤起能够分离出小分子物质、置换大分子物质外水相、浓缩大分子物质浓度。

与目前经常使用的透析袋透析或葡聚糖凝胶G50洗脱分离比较，切向流过滤处理500ml空白脂质体，只需2小时，透析袋透析15ml需要24小时，葡聚糖凝胶G50洗脱分离一次最多处理1ml，无法大规模制备。使用切向流过滤，还有如下的优势：

本发明的方法采用切向流过滤替换外水相中离子梯度调节剂，能够较彻底地置换外水相，形成的离子浓度梯度较大。同时过滤循环的速度、置换体积量，可以根据具体情况调整，实现在最低的投入下，实现最大的置换效率，便于工业化生产，减低生产成本。而且，采用切向流过滤替换外水相的梯度调节剂后，得到的空白脂质体粒径大小与原先过滤前脂质体粒径相等，此操作对脂质体粒径没有影响。再有，采用切向流过滤，整个体系可以处于密封状态，所有管道可以清洗，防止操作过程细菌微生物的影响，为整个制备过程的无菌提供保证，这对于注射剂的质量控制至关重要。因此，采用的切向流过滤建立离子浓度梯度的方法，相对于传统的透析、凝胶分离等方法，耗时大大降低，安全可靠，可以实现自动化生产。

综合上述论述，本发明采用切向流过滤制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂具有以下优点：

1、采用脂质材料作为盐酸拓扑替康的载体，能明显提高药物在体内的稳定性，保持其活性内酯环结构形式，更好的发挥抗癌作用；能显著延长药物在血液中的循环时间，改善其体内分布，增加药物在肿瘤部位的聚集，提高药效。

2、本发明的盐酸拓扑替康脂质体的粒径为100nm以下，能有效穿透肿瘤血管，通过增强渗透和滞留作用（EPR效应）聚集在肿瘤部位，实现被动靶向作用。

3、离子梯度调节剂能够在内水相中提供酸性环境，使盐酸拓扑替康以内酯形式存在，降低羧酸盐形式，提高了药物活性成分的含量，能够显著改善药物在体内的药效以及生物利用度。

4、本发明中采用的制备方法中，采用少量乙醇作为磷脂材料等的溶剂，不含有常规方法中使用的氯仿等溶剂，在制备过程中，通过加热、高压匀质等过程容易去除，对人体损害小。

所以，本发明采用离子梯度的方法实现主动载药，克服了传统方法制备水溶性药物包封率低的问题，降低游离药物浓度，实现长循环靶向作用，大大提高药物的生物利用度，降低毒副作用。

根据本发明的另一方面，其提供了通过本发明的方法制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂，该脂质体纳米制剂中，磷脂、胆固醇、修饰材料构成脂质双分子层，其结构示意图见图1。

本发明所述的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中，盐酸拓扑替康脂质体的粒径优选为100nm以下，优选为50-95nm；包封率为90%以上，优选92%，更优选95%以上。由于盐酸拓扑替康脂质体的小粒径，其能通过EPR效应聚集在肿瘤组织，同时由于较高的包封率，降低游离药物的浓度。

本发明的再一方面提供了所述的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括，但不限于，肺癌、肝癌、胃癌以及血液病。

附图说明

图1为本发明的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中的盐酸拓扑替康脂质体结构示意图。

图2为示意性地示出切向流过滤示意图。

图3为根据本发明的实施例3制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的盐酸拓扑替康脂质体的粒径分布图。

图4为根据本发明的实施例1制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂与盐酸拓扑替康游离药物（对比例2的注射液）的荧光显微镜观察细胞凋亡图，其中，A：空白对照，B：盐酸拓扑替康游离药物，C：盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂。

图5为根据本发明的实施例2的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和对比例2的游离药物的体外释放的测试结果图。

图6为根据本发明的实施例3的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和对比例2拓扑替康注射液的体内药代动力学曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。

除特殊说明外，本申请采用的原料、设备、方法均为本领域常规的原料、设备和方法。

实施例1至12

取磷脂、胆固醇、PEG-DSPE(上海艾伟特医药科技有限公司，批号B20204)，在5ml无水乙醇中65℃水浴超声溶解，将其注入到预热至65℃的400ml梯度调节剂水溶液，高速搅拌转速设定在200-600rpm，得初品，再于20000psi下高压均质4次，得到空白脂质体，将空白脂质体通过切向流过滤，以去离子水作为置换液，置换空白脂质体外水相后，与40ml盐酸拓扑替康水溶液（2mg/ml）混合，一定温度下孵化15min，取出，放冷，即得。实施例1至12中盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂各成分的种类、数量、关键的工艺参数按表1、2、3操作。

对比例1至2

对比例1按实施例1操作，唯一的不同之处在于以30k达尔顿的透析袋代替切向流过滤法透析置换空白脂质体外水相中的硫酸铵。

对比例2是拓扑替康的普通制剂，配制方法为：取80mg盐酸拓扑替康直接加40ml水溶解，即成2mg/ml的注射液。

表1

表2

用量磷脂胆固醇修饰材料梯度调节剂浓度实施例1850mg250mg320mg250mM实施例22300mg160mg90mg400mM实施例3800mg380mg350mg50mM实施例41500mg180mg80mg150mM实施例51350mg200mg250mg350mM

实施例6900mg400mg180mg200mM实施例72000mg250mg380mg250mM实施例8800mg380mg200mg100mM实施例91000mg160mg400mg200mM实施例101400mg200mg390mg280mM实施例111500mg400mg120mg300mM实施例121000mg350mg200mg350mM对比例1850mg250mg320mg250mM

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

性能测试

粒径及分布测试：

取实施例3制得的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂分别用水稀释后，经粒径测定仪测定其粒径及分布。结果如图3，盐酸拓扑替康脂质体Z均粒径为62.38nm，多分散指数为0.105，粒子分布较为均匀。使用相同的方法测定其他实施例中制备的盐酸拓扑替康脂质体和在对比例中制备的盐酸拓扑替康脂质体。结果见表4。

包封率的测定：

取实施例1至12和对比例1制得的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂进行包封率的测定。

色谱条件：色谱柱Waters X-Bridge C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇-磷酸溶液（3ml磷酸至1L水中，三乙胺调PH4.0）（35∶65）流速1ml/min；柱温40℃；检测波长267nm；进样量10μl。

取充分溶胀的Sephadex G-50葡聚糖凝胶适量，制备凝胶柱（35cm×1cm），精密量取盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂0.5ml上柱，以PBS（PH=6.8）洗脱，收集含纳米制剂的流份共10ml，置50ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀后精密量取0.5ml置10ml量瓶中，用酸化甲醇定容，采用HPLC测定纳米制剂中包裹的药量W；另取盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂0.5ml置于50ml量瓶中，同法操作，测定总药量W₀。计算得盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂的平均包封率。结果见表4。

其中，包封率=W/W₀×100%

细胞凋亡测试：

用Hoechst33342染色法观察盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和盐酸拓扑替康游离药物是否诱导细胞凋亡。将HT-29细胞以2×10⁴个/孔的密度接种到24孔板中，置于37℃、5%CO₂的条件下培养24h。弃去原培养液，加入0.5ml DMEM培养液，分别加入实施例1中的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和盐酸拓扑替康游离药物适量使药物终浓度为10μg/ml，在培养箱中继续培养24h后，弃去孔中溶液，剩余物用1ml pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每孔加含Hoechst33342（10μg/ml）的DMEM培养液200μl，孵育20min后，用1ml PBS冲洗，于荧光显微镜下观察细胞形态。

图4结果表明，实施例1制备的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和对比例2制备的盐酸拓扑替康游离药物均可诱导细胞凋亡，经Hoechst33342染色后，正常细胞的细胞核呈现均匀的蓝色荧光，而游离药物组细胞核浓染，盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂组细胞核皱缩且碎裂，且细胞凋亡现象更为明显。

体外释放测定：

取实施例2制得的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂以及对比例2进行体外释放的测定。

精密量取1ml，加至透析袋（透析袋分子量8000-14000Da）中，扎紧两端，置于装有20ml释放介质（Hepes缓冲液）的锥形瓶中，于（37.0±0.5）℃条件下恒速振荡（100r/min）。分别在0.5、1.5、3、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、144、168h取样，进样测定，计算累积释放率（%）。同时取上述两种制剂各1ml，测定两种制剂中药物总含量，以累积释放率（Q）对时间（t）作图，释放曲线见图5。

由图5可见，盐酸拓扑替康游离药物在6h基本释放完全，表明透析袋对盐酸拓扑替康无吸附和截留；相比于游离药物，盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂中药物释放较为缓慢，24h时累积释放率为17.67%，完全释放需要约144h，保证了脂质体在体内循环是能够将药物转运至靶部位，从而可以实现在体内的长循环靶向作用。

体内药动学试验:

取体重为200g左右的健康wistar大鼠，雄性，10只，随机分成两组，按10mg/kg的给药剂量抽取实施例1-12的拓扑替康脂质体纳米制剂及对比例2的拓扑替康溶液，尾静脉注射给药，分别于0.083、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、12.0、24小时眼眶取血0.5至1.0ml，置于肝素抗凝管中，1000rpm离心10分钟后分离血浆。精密吸取100μl置5ml离心管中，加入甲醇400μl，涡旋振荡混合5分钟，3000rpm离心10分钟。取上清液氮气吹干，加入乙腈200μl溶解，取10μl注入液相测定。测定拓扑替康体内药动学数据，计算药物在体内的滞留时间，见表4。实施例1至实施例12的体内滞留时间均大于对比例2，说明脂质体纳米制剂在体内停留时间比游离药物长。

图6为根据本发明的实施例3的盐酸拓扑替康脂质体纳米制剂和对比例2拓扑替康注射液的体内药代动力学曲线图。

表4