一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原

摘要

本发明提供了一种包括三种核分枝杆菌抗原的组合抗原，以及应用这一组合抗原制备用于诊断活动性肺结核的试剂的用途。所述组合抗原包括Rv3871，Rv3876和Rv3879。本发明采用三种抗原建立相应抗体检测方法，用于生物样品中对应抗体水平的检测，所测定的三种抗体水平在痰涂片阴性/痰培养阳性结核患者中尤其较高。应用这一组合抗原建立起肺结核诊断方法，并定义阳性样本为两种或以上抗原对应的抗体水平达到阳性判定值。通过大量的临床样本验证，表明本发明提供的诊断方法对痰涂片阳性/痰培养阳性、痰涂片阴性/痰培养阳性以及痰涂片阴性/痰培养阴性结核患者均具有高灵敏度与特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫诊断领域，特别是活动性肺结核疾病的诊断领域。

背景技术

结核病仍然是当今严重威胁人类健康的重大疾病之一。根据世界卫生组织 (WHO)于2013年的报道数据，仅2012年世界新发结核病约860万人，因ZC 核病死亡人数约130万。对于结核病的防控，依然是全世界面临的重大挑战。

早期、快速的结核诊断方法对于防控结核病具有重要意义。目前，研究人员 已开发了多种用于结核病诊断的方法，包括结核菌素皮肤试验，痰涂片，痰培养 以及PCR等。这些方法对结核病的防控做出了一定的贡献。然而，当前的诊断 方法在临床实践中仍然存在明显的局限性，无法满足临床需求。例如，结核菌素 皮肤试验不适合于卡介苗接种人群；痰涂片法检测灵敏性较低，仅为30-40％； 作为结核病诊断金标准的痰培养检测法，其灵敏性也只有50-60％，且该方法较 为耗时，一般需要4-8周的时间；PCR检测法在一定程度上促进了结核病快速检 测技术的发展，但结核分枝杆菌内源性的抑制因子以及检测过程常导致出现一些 假阳性或假阴性结果，且该方法对设备与检测人员专业水平均有较高要求，不适 合于在较为贫困的发展中国家推广，而这些发展中国家恰是结核病患者主要分布 的地区。因此，在结核病防控领域，仍然急需一种快速、高效、廉价的诊断方法。

血清学检测具有易操作、成本低、省时和可测试大量样本等优点，是一类较 为有前景结核病诊断方法。

结核分枝杆菌感染后，作为对结核抗原的应答，患者体液中将产生特异性抗 体，可作为结核病诊断的潜在标志物，因此备受研究人员关注。目前，研究人员 已尝试了用多种结核分枝杆菌抗原进行血清中抗体检测，以用于结核病的诊断， 如结核分枝杆菌抗原38kDa、16kDa、ESAT6、ES-31、19kDa、CFP-10等。但迄 今为止，没有一种抗原能够在结核病诊断中达到满意的灵敏度与特异性。有研究 人员提出了通过多个抗原联合检测进行结核病诊断，并较单个抗原相比显著提高 了诊断效能。然而，以往研究中报道的这些抗原或方法往往在痰培养阴性的结核 病患者中难以达到较为满意的诊断效果。基于此，寻找一组在痰培养阳性与阴性 结核病人群中均具有较好诊断效能的新型抗原，具有重要研究意义与临床应用价 值，也是该研究领域面临的重要问题。

结核分枝杆菌RD区是致病菌株特定的序列，编码多种结核特异性抗原。本 发明人对结核分枝杆菌RD区多种抗原进行了研究，令人惊奇地发现3个结核分 枝杆菌RD区抗原在痰涂片阴性(痰培养阳性)的肺结核病患者中诱导较高水平 的抗体应答，对于活动性肺结核病诊断，尤其是对诊断难度较大的痰涂片阴性(包 括痰培养阳性和阴性患者)患者具有重要意义。在此基础上，本发明人进一步将 所筛选的3种抗原组合用于活动性肺结核病的体外免疫诊断，建立了一种基于 ELISA技术的肺结核病高效诊断方法，该方法与以往的相关报告相比，尤其是针 对痰涂片阴性患者，具有高灵敏性与特异性。

发明内容

本发明涉及一种检测生物样品中结核抗体的抗原组合，所述抗原组合是 Rv3871、Rv3876和Rv3879的抗原组合。

在该实施方案的一个方面中，抗原组合中抗原Rv3871、Rv3876和Rv3879 是分开的抗原。在另一个方面中，抗原组合中抗原Rv3871、Rv3876和Rv3879 中任两种抗原或者3种抗原融合在一起。

在该实施方案的再一个方面中，在抗原组合中，抗原Rv3871是全长序列 (SEQ ID NO.1)、第60位氨基酸至第96位氨基酸的序列(SEQ ID NO.2)或者它 们的衍生序列；抗原Rv3876是全长序列(SEQ ID NO.3)、第380位氨基酸至第 510位氨基酸的序列(SEQ ID NO.4)或者它们的衍生序列；抗原Rv3879是全长序 列(SEQ ID NO.5)、第130位氨基酸至第220位氨基酸的序列(SEQ ID NO.6)或 者它们的衍生序列。

本发明还涉及抗原组合用于制造检测肺结核病的试剂的用途，所述抗原组合 是Rv3871、Rv3876和Rv3879的抗原组合。

在该实施方案的一个方面中，抗原组合中抗原Rv3871、Rv3876和Rv3879 是分开的抗原。在另一个方面中，抗原组合中抗原Rv3871、Rv3876和Rv3879 中任两种抗原或者3种抗原融合在一起。

在该实施方案的再一个方面中，在抗原组合中，抗原Rv3871是全长序列 (SEQ ID NO.1)、第60位氨基酸至第96位氨基酸的序列(SEQ ID NO.2)或者它 们的衍生序列；抗原Rv3876是全长序列(SEQ ID NO.3)、第380位氨基酸至第 510位氨基酸的序列(SEQ ID NO.4)或者它们的衍生序列；抗原Rv3879是全长序 列(SEQ ID NO.5)、第130位氨基酸至第220位氨基酸的序列(SEQ ID NO.6)或 者它们的衍生序列。

用于本发明的生物样品可以是血液、血浆、血清、尿液、胸水、腹水或者痰 液。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种在结核病诊断中具有重要应用价值的抗原组合， 该抗原组合尤其在痰涂片阴性患者中(痰培养阳性)诱导较高的抗体水平。

本发明的另一个目的在于提供一种利用组合抗原进行肺结核病诊断的方法， 采用该方法进行肺结核病诊断，对于痰涂片阳性与阴性患者均具有较高的灵敏性 与特异性。

本发明提供的组合抗原是基于Rv3871，Rv3876和Rv3879的抗原组合，在 实际应用中可以使用三种抗原的全长序列，也可以使用其中包含B细胞免疫活 性表位的特定序列，如Rv3871：第60位氨基酸至第96位氨基酸的序列(SEQ ID  NO.2)；Rv3876：第380位氨基酸至第510位氨基酸的序列(SEQ ID NO.4)； Rv3879：第130位氨基酸至第220位氨基酸的序列(SEQ ID NO.6)；甚至可以在不 脱离本发明主题和范围的情况下对这些序列进行改变，例如使用这些序列的衍生 序列。术语“衍生序列”是与全长序列或者包含B细胞免疫活性表位的特定序列 具有大于80％，大于81％，大于82％，大于83％，大于84％，大于85％，大于 86％，大于87％，大于88％，大于89％90％，大于90％，大于91％，大于92％， 大于93％，大于94％，大于95％，大于96％，大于97％，大于98％，大于99％的 同一性的、可以引起机体特异性B细胞免疫的序列。众所周知，具有所述功能的 这些衍生序列同样可以用于本发明中，因此处于本发明的范围内。

本发明提供的肺结核病诊断方法是联合Rv3871，Rv3876和Rv3879检测生 物样品中对应的三种抗体水平进行诊断，并定义阳性的判定标准为测试样品中 Rv3871，Rv3876和Rv3879对应的三种抗体水平，至少两种抗体水平达到阳性 阈值。

本发明提供的肺结核病的诊断方法，可以对痰涂片+/培养+、痰涂片+/培养- 以及痰涂片-/培养-等不同类型的活动性肺结核病人群进行诊断，并均具有较好的 诊断效能。

本发明所述的抗体水平检测，可以通过常规ELISA、化学发光ELISA以及 其他相关方法来实现。

本发明的有益效果：本发明联合抗Rv3871、Rv3876和Rv3879抗体水平进 行活动性肺结核病的检测，与单抗原抗体水平以及以往的相关报道相比诊断效能 得到明显提高，尤其对于痰涂片阴性肺结核病患者，本方法仍具有非常高的灵敏 度和特异性，显著优于现有其他方法。

本发明的具体技术方案如下：

(1)抗原蛋白的获取

根据GeneBank等多人结核分枝杆菌H37Rv(GI：448814763)下载基因序 列，设计并合成引物通过PCR技术分别从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中 扩增获得相应的DNA，或通过BioSun Version 3.0(由北京基础医学研究所计算 生物学中心研发)软件分别预测了Rv3871，Rv3876和Rv3879的B细胞免疫活 性表位，获得相应的氨基酸序列于基因序列，设计引物并通过PCR技术分别从 结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增获得相应的DNA片段。随后，经Xho  I与Xba I处理获得特定的限制性酶切位点，进一步将获得的基因片段插入到原 核表达质粒pBVIL1，并转入大肠杆菌HB101进行表达。经扩增和表达后，收集 大肠杆菌HB101菌液，提取蛋白，并通过离子交换和凝胶电泳对重组蛋白进行 纯化，蛋白浓度使用布拉德福德方法进行测定，分装冻于-80℃备用。

(2)抗体检测方法的建立

本部分以ELISA方法，但本发明不限于ELISA方法。将上述获得的3种抗 原蛋白分别溶解于包被缓冲液(0.05M carbonate/bicarbonate，pH 9.6)，配制成5 μg/ml的浓度，并用于96孔培养板的包被；将待测样品以适当比例稀释于含1％ BSA的PBST溶液中，取100μL分别加入到上述抗原包被的培养孔中，密封后 37℃孵育30分钟并洗涤三次；加入100μL辣根酶标记的抗人IgG抗体(Sigma， USA)，密封后于37℃孵育30分钟，洗涤三次后加入新鲜配制的四甲基联苯胺 (TMB)并室温孵育20分钟。随后，加入0.1N的硫酸，通过全自动定量绘图 酶标仪(Bio-Rad，USA)测定450nm光密度值。

(4)临床样本的测定

本部分以临床血清样本为例，但本发明方法不局限于血清样品。按照上述(2) 所述方法分别测定健康人群以及结核病患者血清中Rv3871、Rv3876和Rv3879 对应的抗体(IgG)水平。

(5)诊断效能分析

根据上述测定的三种IgG水平，通过GraphPad Prism 4.0软件制作ROC曲 线，并根据Youden指数(Youden指数＝灵敏度+特异性-1)的最大值确定最佳工 作点，获得Rv3871、Rv3876和Rv3879抗体检测的阳性阈值，分别计算其灵敏 性与特异性等参数，并进一步将三种抗原测定的抗体水平组合用于肺结核病诊 断，定义阳性判定标准为两种或以上IgG水平达到阳性判定值，计算诊断灵敏性 与特异性等参数。

附图说明

图1结核病人群与健康人群中测定的Rv3871、Rv3876和Rv3879抗体水平 分布图。其中TB代表总的结核病患者人群；Control代表健康人群；S+/C+代表 痰涂片+/培养+的结核病患者；S+/C-代表痰涂片+/培养-的结核病患者；S-/C-代 表痰涂片-/培养-的结核病患者。

图2不同人群中测定的抗Rv3871、Rv3876和Rv3879抗体水平统计图。

图3基于Rv3871、Rv3876和Rv3879测定的抗体水平绘制的ROC曲线。

通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并 不对本发明构成任何限制。

实施例1：Rv3871、Rv3876和Rv3879抗原活性表位分析、基因序列克隆 与蛋白表达

(1)抗原表位分析

从TB databases数据库(http：//tb.lanl.gov/content/index)下载结核分枝杆菌 H37Rv菌株RD1区氨基酸序列。通过Biosun软件分析其抗原表位情况，筛选 Rv3871、Rv3876和Rv3879序列中峰值较高表位区段，并截取其相应氨基酸序 列，通过TB databases数据库在线进行同源性比对分析，确定抗原表位区段及相 应的基因编码序列，Rv3871为第60位氨基酸至第96位氨基酸区段，Rv3876为 第380位氨基酸至第510位氨基酸区段，Rv3879为第130位氨基酸至第220位 氨基酸区段。

(2)原核表达载体的构建

1)根据序列分析结果，通过软件设计Rv3871、Rv3876和Rv3879基因引 物，由Invitrogen公司合成纯化。如表1所示。

表1 Rv3871、Rv3876和Rv3879基因引物序列

2)用去离子水配制成25μmol/L使用浓度，保存在-20℃备用。使用退火延 伸PCR法合成H37Rv菌株Rv3871、Rv3876和Rv3879抗原基因，采用100μl 扩增体系进行扩增，反应体系成分如下：

Taq DNA聚合酶MIX：50μl

上游引物F1：2μl(25μM)

下游引物R1：2μl(25μM)

模板：1μl

灭菌水：45μl

扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s， 30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

3)PCR产物的回收：按照北京百泰克生物技术有限责任公司的“琼脂糖凝胶 回收试剂盒”说明书回收纯化目的基因。回收的PCR产物于-20℃储存备用。

4)酶切：将纯化回收的Rv3871基因PCR产物用Xhol和Xbal限制性内切 酶双酶切，酶切体系为：83μl PCR纯化产物，10μl 10×Muticore，3μl Xhol，3μl Xbal， 1μl 10mg/ml BSA。37℃水浴酶切过夜；将纯化回收Rv3876和Rv3879的PCR 产物的目的基因用BamHI和EcoRI限制性内切酶双酶切，酶切体系：83μl PCR 纯化产物，10μl 10×Muticore，3μl BamHI，3μl EcoRI，1μl 10mg/mlBSA。37℃ 水浴酶切过夜。

5)连接：酶切后的目的片段用胶回收试剂盒纯化。将酶切后的片段和质粒 载体进行连接，Rv3871连接反应体系为：2μl PCR产物双酶切回收片段、2μl  PPBVIL1双酶切回收片段、4μl连接酶。16℃连接5小时以上；Rv3876和Rv3879 连接反应体系为：2μl PCR产物双酶切回收片段、2μl Prtc-CKS双酶切回收片段、 4μl连接酶。16℃连接5小时以上。

(3)连接产物的转化及阳性克隆的鉴定：常规制备大肠杆菌HB101、BL21 感受态细胞。选取表达蛋白分子量正确的克隆株进行测序，在ABI 3730XL全自 动测序仪上进行，由中美泰和生物技术有限公司完成。选择测序正确并且目的基 因高表达的克隆，600μl LB(Amp+)培养过夜的菌液加入300μl灭菌甘油混合后， -70℃保存备用。

(4)工程菌的诱导

Rv3871的诱导：选取测序正确且高表达的菌株接种于200ml LB(Amp+) 液体培养基中，37℃160r/min空气摇床培养过夜，取10ml过夜菌种转种至200ml/ 瓶的新鲜LB(Amp+)培养基，160r/min，37℃振荡培养约2-3小时后，至对数 期，即OD600nm值为0.4-0.6。转至42℃水浴摇床中诱导表达过夜。

Rv3876和Rv3879的诱导：选取测序正确且高效表达的菌株接种于300ml LB (Amp+)液体培养基中，37℃空气摇床培养过夜，取10ml过夜菌液转种至200ml/ 瓶的新鲜LB(Amp+)培养基中，160r/min，37℃振荡培养约2小时后，培养至 对数期，即OD600nm值为0.4-0.6。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)化 学诱导剂，终浓度1mM，在30℃空气摇床中诱导表达过夜。

(5)蛋白表达形式鉴定

收集上述诱导菌液1-1.5ml，离心(12000rpm/lmin)，弃上清收集沉淀，加 入300μl纯净水悬起沉淀，冰浴中超声(每超声30秒间隔30秒)6次，12000rpm 离心2min分别收集上清和沉淀，取上清100μl加50μl上样缓冲液，沉淀加 100μl纯净水使其悬浮并加入50μl上样缓冲液，沸水中加热5min，进行 SDS-PAGE电泳鉴定确定蛋白的表达方式。

(6)包涵体的制备

对于包涵体表达的蛋白，150mlLB(Amp+)接种150ul菌种，37℃培养过 夜。次日将培养过夜的菌液，分别按10ml/瓶的量转接在12瓶200ml/瓶的LB (Amp+)液体培养基中，37℃培养至对数期，42℃水浴摇床诱导表达过夜；取 上述诱导菌液1000ml，于4℃6000r/min离心10min，收集菌体沉淀。用10倍 体积的25mmol/L TE(pH 8.0)缓冲液将沉淀重悬，加入溶菌酶(1mg/ml)，于 室温磁力搅拌10min。冰浴中超声波破菌，每次超30s，间隔20s，共超15次。4℃ 12000r/min离心20min，弃上清，沉淀用1mol/L的NaCl(用TE配制)洗一次， 再用TE缓冲液洗2次，收集沉淀，直接纯化或-20℃保存。

(7)抗原蛋白的收集与纯化

可溶性表达蛋白菌液：将诱导表达的菌液收集于500ml大离心瓶中， 6000rpm/min，4℃离心10min收集菌体沉淀；用25mmol/LTE缓冲液(pH8.5) 重悬沉淀，并定容至200ml；超声破碎细胞22min，超声30s，间隔30s；12000rpm， 4℃离心15min，收集上清，通过4.5μm滤膜过滤；用25mmol/L TE缓冲液(pH8.5) 平衡Q柱5个柱体积，将记录仪调至基线，缓慢上样，流速为1ml/min；样品 上完后用25mmol/L TE缓冲液(pH8.5)平衡约5个柱体积，收集穿过峰；用0.05 mol/L Nacl TE缓冲液(pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰标记为洗脱峰1；用0.1mol/LNacl  TE缓冲液(pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰记为洗脱峰2；用0.15mol/LNacl TE缓 冲液(pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰为洗脱峰3；用0.2mol/LNacl TE缓冲液(pH 8.5) 洗脱，收集洗脱峰为洗脱峰4；用0.25mol/LNacl TE缓冲液(pH 8.5)洗脱，收 集洗脱峰为洗脱峰5；用0.5mol/LNacl TE缓冲液(pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰 为洗脱峰6；SDS-PAGE鉴定各步收集产物。

包涵体表达蛋白菌液：将诱导表达的菌液收集于500ml大离心瓶中， 6000rpm，4℃离心10min收集菌体沉淀；用25mmol/L TE缓冲液(pH8.5)重悬 沉淀，定容至200ml；超声破碎细胞22min，在菌液中加入1M/ml溶菌酶ml， 超生30s，间隔30s；用25mmol/L TE(含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)缓冲 液平衡Q柱5个柱体积；洗脱步骤与可溶性表达菌液的洗脱步骤相同，但洗脱 液中含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇。

实施例2：基于Rv3871、Rv3876和Rv3879抗原的ELISA方法建立与临床 样本测定

(1)将纯化所得的上述Rv3871、Rv3876和Rv3879抗原分别用包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释到5μg/ml，包被96孔微孔板，每孔0.5μg 抗原，4℃过夜，洗板2次，每次1min；

(2)加入1％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭4h，拍干；次日弃封闭液， 室温干燥过夜即制备成96孔酶联板，真空封装后，4℃保存备用；

(3)待测血清样本(包括健康对照和肺结核病患者，其中肺结核病患者又 分为痰涂片阳性/痰培养阴性患者、痰涂片阴性/痰培养阳性患者、痰涂片阴性/ 痰培养阴性患者)用稀释液按1∶10稀释后加入96孔酶联板，37℃孵育30min， 洗板5次，每次1min，拍干；

(4)加入抗人IgG酶结合物，37℃孵育20min，洗板5次×1min，拍干；

(5)将显色试剂A与B按照1∶1比例混合后加入各孔，37℃孵育10min；

(6)每孔加入终止液终止显色，在酶标仪上检测样本吸光值(A450nm值)；

(7)根据健康对照和肺结核病患者血清测定的抗Rv3871、Rv3876和Rv3879 IgG数据，利用GraphPad Prism 4.0软件绘制健康人群与结核病整体人群中抗体 水平分布图，以及三种抗体在痰涂片阳性/痰培养阴性患者、痰涂片阴性/痰培养 阳性患者、痰涂片阴性/痰培养阴性患者人群中的分布情况(图1)；

(8)根据上述检测数据比较三种抗原IgG在健康人群以及痰涂片阳性/痰培 养阴性患者、痰涂片阴性/痰培养阳性患者、痰涂片阴性/痰培养阴性患者人群中 的水平(图2)；进一步利用GraphPad Prism 4.0软件绘制ROC曲线(图3)，确 定每一种IgG用于结核病诊断的最佳工作点与阳性判定值，并分别计算三种抗体 单独诊断时对肺结核病的灵敏性与特异性及阳性预测值和阴性预测值，如表2；

表2单抗原IgG诊断效能分析

Youden指数＝灵敏度+特异性-1；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。

(9)根据步骤(8)确定的共三种IgG阳性判定值，联合三种IgG水平进 行肺结核病诊断，分别定义如下阳性判定标准：1)一种或以上IgG水平达到阳 性判定值；2)两种或以上IgG水平达到阳性判定值；3)三种或以上IgG水平 达到阳性判定值。

(10)根据步骤(9)，分别在不同的判定标准下计算三种IgG联合诊断对肺 结核病的灵敏度和特异性，以及阳性预测值和阴性预测值，如表3，可以得出当 阳性判定标准定义为2个或以上抗原IgG达到阳性值，Youden指数最大，具有 最好的诊断效能，灵敏度和特异性均较高。

表3三种抗原IgG联合进行结核病诊断效能分析

1*：阳性判断标准为1个或以上抗原IgG达到阳性值；2*：阳性判定标准为2个或以上 抗原IgG达到阳性值；3*：阳性判定标准为3个或以上抗原IgG达到阳性值。

(11)根据步骤(9)方法与步骤(10)结果，计算三种IgG联合诊断(阳 性判定标准为2个或以上抗原IgG达到阳性值)分别对痰涂片阳性/痰培养阴性 患者、痰涂片阴性/痰培养阳性患者、痰涂片阴性/痰培养阴性结核病患者诊断的 灵敏度和特异性，以及阳性预测值和阴性预测值，如表4，结果表明该方法对目 前临床难以确诊的痰涂片阴性患者(包括培养阳性和阴性)同样具有非常好的诊 断效能，灵敏度和特异性均达到较高水平。

表4三种抗原IgG联合进行结核病诊断效能分析

S+/C+代表痰涂片阳性/痰培养阴性结核病患者；S-/C+痰涂片阴性/痰培养阳性结核病患者；

S-/C-痰涂片阴性/痰培养阴性结核病患者。