抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法及多克隆抗血清与应用

摘要

本发明提供一种抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法及由其制备的多克隆抗血清与应用。其中，所述方法包含采用SEQ ID NO:1所示序列表示的抗原通过动物免疫获得所述抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清。所述抗原通过下述步骤制得：1)家蚕BmGATA6的克隆和分析：2)家蚕BmGATA6的原核表达及蛋白纯化。本抗血清可以用于家蚕BmGATA6蛋白及与其高度保守的鳞翅目GATA蛋白功能的基础研究，包括western及免疫荧光等方面的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多克隆抗血清，具体涉及一种抗家蚕BmGATA6多克隆抗 血清的制备方法及由其制备的多克隆抗血清与应用。

背景技术

GATA蛋白家族是一组能与含有保守的(T/A)GATA(A/G)基序启动子结 合的转录因子，家族成员已发现在动物、真菌、植物等生物中广泛存在，在真 核生物的增殖、分化和发育中扮演着重要的角色。哺乳动物中以人类为例已经 被鉴定有6个GATA蛋白，分别在造血系统，心脏，肠道等组织器官的分化和 发育中起着关键的作用。昆虫中以果蝇为例也被鉴定出多个GATA蛋白，其中 被研究最为广泛的是在造血过程中扮演指挥调节作用的Serpent和在肠道、眼睛、 鬃毛等发育中起到调节作用的Panner。但是有关家蚕GATA蛋白的研究鲜有报 道，对其在家蚕中的作用也不清楚。虽然GATA是较为保守的蛋白家族，但是 物种间的差异，抗体制备时氨基酸序列的选择等因素，均导致GATA抗体不能 共用，因此要解析家蚕BmGATA6蛋白在家蚕中的功能，顺利进行后续基础性 实验，需要家蚕BmGATA6蛋白抗原及抗体的发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法及 由其制备的多克隆抗血清与应用。

具体地，所述的抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法，包含采用SEQ  ID NO：1所示序列表示的抗原通过动物免疫获得所述抗家蚕BmGATA6多克隆 抗血清。

具体地，所述抗原可以通过下述步骤制得：

1)家蚕BmGATA6的克隆和分析：

根据NCBI上预测的BmGATA6的氨基酸序列，设计如SEQ ID NO：4-5所示 的扩增引物，进行PCR扩增，获得第一扩增产物；

所述第一扩增产物与第一连接载体连接后获得第一连接产物，所述第一连接 产物转化第一感受态细胞，获得第一阳性克隆，然后对第一阳性克隆进行测序 验证，测序获得的BmGATA6全长编码基因序列如SEQ ID NO：3所示；

2)家蚕BmGATA6的原核表达及蛋白纯化：

根据步骤1)获得的BmGATA全长编码基因序列，截取N端从43bp至986bp 的序列，获得SEQ ID NO：1所示的序列，设计如SEQ ID NO：6-7所示的原核表 达引物，进行PCR扩增，获得第二扩增产物；

所述第二扩增产物与第二连接载体连接后获得第二连接产物，所述第二连接 产物转化第二感受态细胞，进行蛋白诱导表达；

对诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，选出较纯的含有BmGATA6蛋 白的洗脱液，多次透析，浓缩，将其冻干成为蛋白干粉，保存，备用。

进一步地，所述诱导表达时，以IPTG至终浓度为分别为0.4mM、0.6mM、 0.8mM、1.0mM后在16℃条件下培养20h和37℃条件下培养5小时分别进行 BmGATA6蛋白诱导表达。

进一步地，以IPTG浓度为0.6mM，在16℃条件下培养20h的条件为最终诱 导条件。

进一步地，第一连接载体是pMD19-T Simple载体，第一感受态细胞是DH5 α感受态细胞。

进一步地，第二连接载体是pET32a载体，第二感受态细胞是BL21感受态 细胞。

进一步地，所述动物免疫包括对HRP标记小鼠，以浓度为2μg/ml的抗原包 被液进行多次多点免疫，计算小鼠产生的家蚕BmGATA6蛋白抗血清的效价。

进一步地，所述制备方法包含：以家蚕5龄6天的中肠的石蜡切片作为样本， 对家蚕BmGATA6蛋白抗血清进行免疫荧光检测。

本发明还提供根据上述制备方法制备的抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清。

根据上述的制备方法制备的抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清能够用于检测 鳞翅目昆虫中保守的GATA蛋白。

本发明成功克隆家蚕BmGATA6基因，原核表达纯化出有活性的蛋白，通 过多次免疫小鼠产生多克隆抗血清，可以进行体内BmGATA6蛋白表达水平的 western检测，以及组织石蜡切片(需要抗原修复)后的免疫荧光，细胞爬片的 免疫荧光等实验。本发明能够进一步用于家蚕BmGATA6蛋白以及鳞翅目昆虫 中保守的GATA蛋白的功能研究。本抗血清可以用于家蚕BmGATA6蛋白及与 其高度保守的鳞翅目GATA蛋白功能的基础研究，包括western及免疫荧光等方 面的检测。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是家蚕BmGATA6氨基酸保守结构域预测视图。

图2A和图2B是不同浓度IPTG及不同温度下诱导BmGATA6蛋白后 SDS-PAGE电泳检测。图2A为16℃诱导，图2B为37℃诱导。

图3是不同温度诱导及超声波破碎后在上清和沉淀中SDS-PAGE电泳检测 BmGATA6蛋白的表达情况，其中对诱导后的BL21菌液超声处理后，分别提取上 清与沉淀中的蛋白进行考染检测，M是marker，1#是37℃，0mM IPTG上清；2# 是37℃，0mM IPTG沉淀；3#是37℃，0.6mM IPTG诱导上清；4#是37℃，0.6mM  IPTG诱导沉淀；5#是16℃，0.6mM IPTG诱导上清；6#是16℃，0.6mM IPTG诱 导沉淀。

图4是不同浓度咪唑洗脱蛋白后SDS-PAGE电泳检测。

图5是3只小鼠产生的抗血清的western检测。其中M表示marker，阴性血清中 为预染marker，抗血清比例均为1∶5000。

图6是家蚕中肠石蜡切片检测BmGATA6抗血清的免疫荧光效果。抗体稀释 比例均为1∶4000。

具体实施方式

试验材料

综述：

将SEQ ID NO：2所示核苷酸序列克隆并测序确定正确后连接到pET32a载体 的BamH I和Xho I酶切位点，由工程菌BL21进行原核表达后，对BmGATA6 蛋白进行纯化，纯化方法如下：将工程菌用IPTG诱导表达，离心收集菌体，PBS 清洗后用分别含有20mM Tris、0.5M Nacl、20mM咪唑、5％甘油的裂解液重悬， 并进行液氮反复冻融，超声波破碎后离心收集上清，抽滤，然后用Ni亲和柱纯 化，用分别含有0.2M NaH2PO4、0.2M Na2HPO4、4M Nacl、20mM咪唑的结 合缓冲液洗去未结合的蛋白后，再分别用含200mM、500mM和1M咪唑的结合 缓冲液洗脱，最后用PBS溶液透析，得BmGATA6蛋白。将获得的BmGATA6 蛋白用PEG20000浓缩后用冷冻干燥仪将其冻成蛋白干粉分装后于-80℃保存。

取3只昆明小鼠，分别剪尾取血，分离获得阴性血清，于-80℃保存。取适 量BmGATA6蛋白干粉，用双蒸水溶解，用BCA试剂盒测蛋白浓度，取每只小 鼠70μg的蛋白，体积稀释为250μl，与250μl的完全弗氏佐剂充分乳化后第 一次皮下及腹腔多处免疫昆明鼠三只，10天后用同样的蛋白量与同体积的不完 全弗氏佐剂充分乳化后第二次免疫昆明鼠，10天后用同样的方法进行第三次免 疫，15天后进行第四次免疫，15天后直接用70μg BmGATA6蛋白冲击免疫， 3天后进行摘除眼球取血。分离获得抗BmGATA6血清，与等体积甘油混匀后 分装保存于-80℃。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版， J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1家蚕BmGATA6的克隆和分析

从NCBI上下载预测的BmGATA6的氨基酸序列，其登录号为 XM_004924410.1。根据其预测的mRNA序列设计扩增BmGATA6基因的特异 引物，正向引物SEQ ID NO：5，反向引物SEQ ID NO：6，以家蚕五龄三天中肠 cDNA【从家蚕基因组生物学国家重点实验室购买的五龄三天大造家蚕，按照由 申煌煊主编的《分子生物实验方法和技巧》(中山大学出版社2010年6月出版) 第八章RNA的提取与cDNA合成的方法制得】为模板进行扩增，PCR反应条件 为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸2分 钟，共28个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收2000bp 左右条带，然后与pMD19-T Simple载体连接，连接反应体系严格按照Solution I 连接酶使用说明进行，连接条件是在16℃条件下连接2小时，将连接产物转化 DH5α感受态细胞，获得阳性克隆pMD19-T Simple/BmGATA6后测序验证，测 序结果如SEQ ID NO：3所示，经分析克隆的BmGATA6基因的CDS为1971bp， 编码657个氨基酸(如SEQ ID NO：4所示)，用在线软件 SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对其氨基酸序列进行结构分析，如图1 所示，BmGATA6氨基酸序列包含一个保守的GATA结构域。

实施例2家蚕BmGATA6的原核表达及蛋白纯化

根据克隆获得的BmGATA6全长CDS序列(如SEQ ID NO：3所示)，截取 N端从43bp至986bp的序列(基因序列如SEQ ID NO：2所示，其相应的氨基酸 序列如SEQ ID NO：1所示)，设计原核表达引物，正向引物如SEQ ID NO：7所 示，5′CGGGATCC CGAGAGGAAGAAAACAGCCA 3′，反向引物如SEQ ID  NO：8所示，下划线序列为BmH I酶切位点，反向引物5′CCGCTCGAG  AAGAGCTCCTTGTTACTGCCTC 3′，下划线序列为Xho I酶切位点，然后以家 蚕五龄三天中肠cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟， 然后95℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共28个循环，最后 72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物用BamH  I和Xho I双酶切，回收BmGATA6基因片段，同时将pET32a载体用BamH I 和Xho I进行双酶切，回收载体骨架，将回收的BmGATA6酶切片段和pET32a 骨架片段进行连接转化，获得pET32a/BmGATA6重组质粒，然后送往华大基因 公司测序，将测序确认正确的重组质粒转化表达感受细胞大肠杆菌BL21，加入 IPTG至终浓度为分别为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM后在16℃条件下培 养20h和37℃条件下培养5小时分别进行BmGATA6蛋白诱导表达，SDS-PAGE 电泳检测，结果如图2A和图2B所示，结果显示在不同的IPTG浓度，不同的 温度下BmGATA6蛋白均有表达；然后选取IPTG为0.6的浓度对其分别进行 16℃条件和37℃条件下的诱导，并进行超声破碎和分离，SDS-PAGE电泳检测， 结果如图3所示BmGATA6蛋白在16℃和37℃的上清与沉淀中均有表达。为了 保证诱导表达的重组蛋白的活性，最终选取了以IPTG浓度为0.6mM，在16℃ 条件下培养20h的条件为最终诱导条件。

将含pET32a/BmGATA6重组质粒的大肠杆菌BL21扩大培养及诱导表达后 在7000rpm条件下离心10分钟收集菌体，PBS清洗3次后用分别含有20mM  Tris、0.5M Nacl、20mM咪唑、5％甘油的裂解液重悬，并进行液氮反复冻融3 次，超声波破碎30分钟后16000rpm离心30分钟收集上清；上清用0.45μm滤 膜抽滤后进行Ni亲和柱纯化。用平衡液(8.5ml0.2M NaH₂PO₄，91.5ml 0.2M  Na₂HPO₄，125ml 4M NaCl，775ml H₂O)平衡Ni亲和柱，将蛋白混合物缓慢挂 柱后，用结合缓冲液(平衡液+20mM咪唑)快速冲洗柱子以洗去未结合的蛋白， 再分别用50ml分别含有40mM，60mM，80mM，100mM，200mM，500mM咪 唑的平衡液(洗脱液)缓慢冲洗柱子并收集洗脱液，收集到的洗脱液进行 SDS-PAGE电泳检测(图4)；选出较纯的含有BmGATA6蛋白的洗脱液，用 PBS溶液透析36小时，每6小时更换透析液一次；纯化及透析后的BmGATA6 蛋白装在透析袋中，在4℃条件下用PEG20000进行浓缩，浓缩到适量体积后分 装到2ml的离心管中，用高速冷冻浓缩仪将其冻干成为蛋白干粉，保存于-80℃ 冰箱备用。

实施例3家蚕BmGATA6蛋白免疫小鼠及抗血清收集

取3只6周龄雄性昆明小鼠(购自重庆腾鑫生物技术有限公司)，分别剪 去少许尾巴收集血液，编好号后室温静置2小时，室温5000g离心5分钟后， 10000g离心1分钟，收集上清于新的离心管中，尽量不要取到下面的红细胞， 上清与甘油以1∶1的比例混合后于-80℃保存，作为阴性血清；

取3支BmGATA6蛋白干粉，分别用300ml去离子水充分溶解后用BCA 试剂盒进行蛋白浓度的测量，共取750μl约210μg BmGATA6蛋白与750μl 完全弗氏佐剂，用两支5ml注射器来回吹打直至蛋白被充分乳化，分别对3只 昆明鼠进行多处的皮下及腹腔注射免疫，每只约注射70μg蛋白。分别间隔10 天后进行第二次及第三次免疫，除了将完全弗氏佐剂换成不完全弗氏佐剂外， 方法同第一次；间隔15天后进行第四次免疫，方法同第二次；距第四次免疫后 15天各取70μg BmGATA6蛋白将体积补充到500μl后直接注射小鼠进行最后 一次免疫冲击，3天后分别通过摘除眼球的方法获得小鼠血液。

将收集的抗BmGATA6蛋白的血清编好号后室温静置2小时，同处理阴性 血清的方式进行处理，分装和保存。

实施例4抗家蚕BmGATA6蛋白血清的检测

配抗原浓度为2μg/ml的包被液(Na₂CO₃0.17g，NaHCO₃0.28g定容至 100ml)，在酶标板中每孔加100μl，密封后于37℃静置1小时后转至4℃冰箱 过夜；取出酶标板，用PBST(KH₂PO₄0.2g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，NaHPO₄·12 H₂O 2.95，Tween-20 0.5ml，定容至1L)洗3次，每次5分钟，将3只小鼠的抗 血清(1#、2#、3#)分别以1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、 1∶32000、1∶64000、1∶128000及1∶256000的比例进行稀释后分别取100μl加入 包被了抗原的孔中，另外各留一个同样包被了抗原的孔分别加入100μl以 1∶8000比例稀释的阴性血清，1∶30000比例稀释的HRP标记小鼠IgG及PBST， 37℃孵育1小时候PBST洗3次，每次5分钟；分别加入以1∶30000的比例稀释 HRP标记小鼠IgG 100μl，37℃孵育1小时后PBST洗3次，每次5分钟；用 TMB显色试剂盒进行显色，并测定A450的OD值及计算3只小鼠产生的 BmGATA6蛋白抗血清的效价，结果如表1所示，3只小鼠的抗血清效价均高达 1∶128000。

表l

  1∶500 1∶1000 1∶2000 1∶4000 1∶8000 1∶16000 1∶32000 1∶64000 1∶128000 1∶256000 阴性血清 空白 第一只 1.500406 1.460213 1.461861 1.430188 1.45121 1.396746 1.379622 1.02275 1.136666 0.1432329 0.138952 0.1182988 第二只 1.483028 1.46698 1.479357 1.432371 1.395874 1.441161 1.406163 1.269189 1.233514 0.09170054 0.1712278 0.1119433 第三只 1.464646 1.450806 1.377811 1.501604 1.438726 1.388982 1.394825 1.360386 1.140426 0.1333108 0.1278683 0.1169995

用家蚕5龄7天中肠蛋白为样品，对抗家蚕BmGATA6蛋白血清进行western  blot检测，蛋白经SDS-PAGE电泳及转膜后，用含有5％BSA的TBST(NaCl8.8g， 1M Tris-HCl(ph 8.0)20ml，0.5ml Tween20，定容到1L)于4℃封闭过夜，分 别将3只小鼠产生的抗血清以1∶5000稀释后于室温孵育2小时，TBST洗3次， 每次10分钟，以1∶30000的比例稀释的HRP标记小鼠IgG室温孵育1小时后， 再次用TBST洗3次，每次10分钟，用ECL显色液进行显色及用成像仪进行曝 光，如图5所示，3只小鼠产生的抗血清都可以特异的显示5龄3天家蚕中肠中 的BmGATA6蛋白条带，大小约为80kD。

还对家蚕BmGATA6蛋白抗血清进行了免疫荧光检测。以家蚕5龄6天的 中肠的石蜡切片作为样本，经过抗原修复后，用PBS洗片子3次每次5分钟后， 用含有1％Triton-X 100的PBS室温孵育15分钟，再用PBS洗5分钟，洗3次 后，用含有3％BSA和10％山羊血清的PBS封闭液于4℃封闭过夜，用封闭液以 1∶1000、1∶2000、1∶4000的比例稀释2#抗血清，并以1∶2000的比例稀释阴性血 清，分别于室温孵育样品2小时后，用PBS洗3次每次10分钟，再用Alexa 594Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)抗体室温孵育1小时，用PBS洗3次每次10 分钟；用适当比例的DAPI室温孵育40分钟后，PBS洗10分钟，添加抗荧光 淬灭剂然后用指甲油封边后用荧光显微镜成像观察，如图6所示，与阴性血清 相比，BmGATA6抗血清可以特异的标记家蚕中肠中的BmGATA6蛋白，并显 示其表达于家蚕中肠细胞的细胞核中。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所 属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动 与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。