辣椒和番茄细菌性疮痂病菌PFGE分子分型方法

摘要

本发明公开了一种辣椒或番茄上细菌性疮痂病菌分子分型方法，该方法首次公开了采用特殊限制性内切酶 Sml I ( Swa I)切胶块内DNA结合脉冲场凝胶电泳方法（PFGE），对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌进行分子分型的操作技术。将该病原菌悬液经蛋白酶K处理后制成胶块、酶切后经脉冲场凝胶电泳，获得特异性条带，转换条带信息进行聚类分析，可将辣椒和番茄上的细菌性疮痂病菌有效区分为4个种。本发明方法所使用的内切酶为首次采用，电泳参数为自行优化，可以用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原菌分子分型技术，具体涉及用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌（Bacterial Spot caused by Xanthomonads）进行分型的方法。

背景技术

辣椒和番茄疮痂病是普遍发生茄科植物上的一种细菌性病害，该病菌主要危害辣椒和番茄的叶片、茎蔓、果实，尤以叶片上发生普遍。叶片发病，初期形成水渍状、黄绿色的小斑点，扩大后变成圆形或不规则形、暗褐色、边缘隆起而中央凹陷的病斑，粗糙呈疮痂状。严重时叶片发黄、干枯、破裂，早期脱落。茎部和果梗发病，初期形成水渍状斑点，逐渐发展成褐色短条斑。病斑木栓化隆起，纵裂呈溃疡状疮痂斑。果实发病，形成圆形或长圆形的黑色疮痂斑。该病害如果防治不及时，不仅大幅降低辣椒和番茄的产量，而且还严重影响辣椒和番茄的果实品质，造成重大经济损失。

目前该病菌已在美国、巴西、澳大利亚、南非、南斯拉夫、墨西哥、哥斯达黎加、阿根廷等全球60多个许多国家和地区发生，是世界性病害之一。在我国新疆、甘肃、内蒙古、黑龙江、北京、山西等十几个地区也有发生，已引起人们广泛的关注。早在20世纪60年代，Dye等（1964）就已经发现辣椒和番茄细菌性疮痂病病原菌存在相当丰富的遗传多样性。2004年Jones等将该病菌分成4个种：X. euvesicatoria、X. vesicatoria、X. perforans 、X. gardneri 。

PFGE分型技术是利用酶切位点少的限制性核酸内切酶消化细菌DNA，产生大的片段，在脉冲场凝胶电泳条件下进行DNA片段有效分离。PFGE作为一种非常有效的病原菌分型技术，已被广泛地应用于许多病原菌的分子分型研究，并被众多研究者视为分子分型的“金标准”(Fakhr et al., 2005)。目前，辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的脉冲场凝胶电泳分型这方面的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是建立辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的脉冲场凝胶电泳分型技术体系，用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是该方法所使用的限制性内切酶的确定和电泳各项参数的确定。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种辣椒或番茄上细菌性疮痂病菌分子分型方法，该方法筛选低频限制性内切酶，采用优化的电泳参数，最后经脉冲场凝胶电泳，获得特异性条带，转换条带信息进行聚类分析，将4种病原菌有效区分。

所述低频限制性内切酶是SmlI (SwaI)，脉冲场凝胶电泳各项参数为：

模式为 “TWO STATE”，电压梯度：6 V/cm，电场夹角：140°，脉冲时间：20~80 s，电泳时间：17 h，缓冲液：0.5×TBE，缓冲液温度：14 ℃。

所述辣椒或番茄上细菌性疮痂病菌分子分型方法，具体步骤如下：

（1）制备胶块：将所述病菌悬浊液与脉冲场级琼脂糖溶胶混匀，加入到制备胶块的模具中凝固；

（2） 细胞裂解：用SmlI对胶块进行酶切孵育，随后进行清洗；

（3）将酶切胶块内的DNA提取出来；

（4）将所提出出来的DNA进行脉冲场凝胶电泳；

（5）图像的获取：电泳结束后取出胶块，染色拍照获得图像；

（6）进行聚类分析。

进一步地，所述辣椒或番茄细菌性疮痂病菌分子分型方法，具体步骤如下：

（1）制备胶块：

A．在离心管加入预冷的CSB液，将对数生长期的病原菌、混匀成悬浊液，OD值至3.6~4.5；

B.另取离心管，将上述细菌悬浊液于新管中，水浴孵育后加入蛋白酶K溶液；

C.取 1%脉冲场级琼脂糖溶胶与步骤B中的细菌悬浊液混匀，将混合物加入到制备胶块的模具中凝固；

（2） 细胞裂解

A.冰上用离心管加入预冷的CLB液，再加入蛋白酶 K溶液，将步骤（1）制备的胶块移入离心管中；

B.水浴锅中酶切孵育；

（3）清洗胶块

A.倒掉CLB，加入预热纯水，50℃水浴5-15min；

B.纯水同样重复洗2-3次后，加入预热TE溶液，50℃水浴10-20min；

C.TE溶液重复洗2-3次后，加入TE，冷藏保存胶块备用；

（4）提取酶切胶块内的DNA

A.配制缓冲液M：M缓冲液每150μl中纯水为35μl ， Buffer 15μl ；

B.从冰箱取出离心管TE液中胶块，切成2mm宽，放入M缓冲液中，30℃水浴15min；

C. 配制酶切缓冲液H:每个1.5ml离心管需H缓冲液：纯水157μl + Buffer 20μl+ BSA20μl = 197μl；

D.用枪头吸出每个1.5ml离心管缓冲液M，避免损伤胶块，加入缓冲液H为197μl，再加入3μl内切酶SwaⅠ（SmiⅠ）；

E. 30℃水浴中孵育4h；

(5) 加样和电泳

A.取出孵育的1.5ml离心管用移液器小心吸出H缓冲液，加入200μl 0.5×TBE缓冲液；

B.上样，确保所有的胶块在一条水平线上，并且胶块与胶槽的底面相接触；

C.倒入100 ml已融化的60 ℃的1％脉冲级琼脂糖溶胶至胶槽，室温下凝固；

D.打开脉冲场凝胶电泳仪CHEF MAPPER XA系统主机和泵的开关，打开冷凝机，确保预设温度在14℃上机电泳;

根据预实验结果设置电泳参数如下：

模式                             “TWO STATE”

电压梯度                             6 V/cm

电场夹角                             140°

脉冲时间                             20~80 s

电泳时间                             17 h

缓冲液                               0.5×TBE

缓冲液温度                           14 ℃

泵速                                 50

(6) 图像的获取:电泳结束后取出胶块，用EB（溴化乙锭）溶液浸泡凝胶，摇床上染色30 min拍照；

(7) 聚类分析:对电泳图谱进行读带，根据指纹带的有无，分别转换为2个数码，即有带记为1，无带的为0；采用NTSYS2.1计算机软件的非加权组平均法UPGMA分析程序，进行分子指纹聚类分析，得出聚类树状图。

所述辣椒或番茄上细菌性疮痂病菌分子分型方法，聚类结果在遗传相似性为72.2%时所有菌株被分为4个亚群，依据标准菌株所在亚群分析可知，group1属于Xanthomonas euvesicatoria，标准菌株为ICMP98；group2组属于X. perforans，标准菌株为ICMP16690，group 3组属于X. vesicatoria，标准菌株为ICMP63；group 4组属于 X. gardneri，标准菌株为ICMP16689，该聚类的分群结果把4种辣椒番茄细菌性疮痂病菌有效地区分开。

本发明具有下有益效果：

本发明通过软件分析低频内切酶对辣椒番茄细菌性疮痂病菌标准株Xcv85-10的全基因组序列的酶切位点及酶切片段的大小，选择了低频限制性内切酶SmlI (SwaI)，并经过反复试验，确定了辣椒番茄细菌性疮痂病菌PFGE各项电泳参数。本发明方法用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究，解决该病菌因分类和变异情况较复杂给实际工作中带来一些问题，研究探讨辣椒和番茄细菌性疮痂病菌群体遗传结构及亲缘关系，为从遗传进化的角度去认识辣椒和番茄细菌性疮痂病菌，从分子水平对它们进行分类与鉴定，进一步开展该病菌致病力分析与致病机理研究，发展分子检测技术、改进育种策略等提供科学依据。

附图说明

图1是用本发明确定的限制性内切酶和电泳参数进行电泳结果图，图中：从左至右的电泳带依次为：1- Marker、2-14为病原菌。

     图2：UPGMA聚类图(右侧括号内数字为菌株数)  。

具体实施方式

用本发明中筛选的低频限制性内切酶SwaⅠ和设置的脉冲场凝胶电泳参数对来自国内的辣椒和番茄细菌性疮痂病原菌进行电泳，结果见图1，所有菌株共呈现出15条特异性条带，每个菌株呈现3-8条左右的条带，大小在180~2200 kb之间。将电泳图谱中条带信息制成0-1表格，有条带记为1，无条带记为0，采用Ntsys 2.1软件根据UPGMA算法进行聚类分析，可将4种辣椒和番茄细菌性疮痂病原菌有效区分，说明本发明中采用的内切酶和电泳参数，可对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌进行PFGE分子分型。

本发明具体操作方法如下：

1、胶块制备

本实验方法主要依据美国CDC-PulseNet中用于大肠杆菌的PFGE标准方法(Ribot et al., 2006)，对部分步骤进行了改动，具体操作如下：

（1）1.5ml 离心加入500μl 预冷的CSB液，将对数生长期的病原菌、混匀成悬浊液，OD值至3.6~4.5；

（2）另取1.5ml 离心管，将100 μl 上述细菌悬浊液于新管中，37℃水浴孵育5min后每管加入5μl蛋白酶K溶液；

（3）取100μl 1%脉冲场级琼脂糖溶胶与100 μl 细菌悬浊液混匀，将混合物加入到制备胶块的模具中凝固；

2、 细胞裂解

（1）冰上用50ml离心管加入5ml 预冷的CLB液，再加入25μl蛋白酶 K（20mg/ml）溶液，将上述制备的胶块移入离心管中；

（2）54℃水浴锅中酶切孵育3h；

3、清洗胶块

（1）倒掉CLB，每管加入预热纯水15ml，50℃水浴10min；

（2）纯水同样重复洗三次后，加入15ml预热TE溶液，50℃水浴15min；

（3）TE溶液重复洗三次后，加入10ml TE，4℃冰箱保存胶块备用；

4、酶切胶块内的DNA

（1）配制缓冲液M

     每个1.5ml离心管需M缓冲液：纯水135μl + Buffer 15μl = 150μl；

（2）从冰箱取出离心管TE液中胶块，切成2mm宽，放入M缓冲液中，30℃水浴15min；

（3）配制酶切缓冲液H

     每个1.5ml离心管需H缓冲液：纯水157μl + Buffer 20μl+ BSA20μl = 197μl；

（4）用枪头吸出每个1.5ml离心管缓冲液M，避免损伤胶块，加入缓冲液H为197μl，再加入3μl内切酶SwaⅠ（SmiⅠ）；

（5）30℃水浴中孵育4h；

5、加样和电泳

（1）取出孵育的1.5ml离心管用移液器小心吸出H缓冲液，加入200μl 0.5×TBE缓冲液；

（2）上样，确保所有的胶块在一条水平线上，并且胶块与胶槽的底面相接触；

（3）倒入100 ml已融化的60 ℃的1％脉冲级琼脂糖溶胶至胶槽，室温下凝固；

（4）打开脉冲场凝胶电泳仪CHEF MAPPER XA系统主机和泵的开关，打开冷凝机，确保预设温度在14℃上机电泳。

根据预实验结果自行设置电泳参数如下：

模式                             “TWO STATE”

电压梯度                             6 V/cm

电场夹角                             140°

脉冲时间                             20~80 s

电泳时间                             17 h

缓冲液                               0.5×TBE

缓冲液温度                           14 ℃

泵速                                 50

6、图像的获取

电泳结束后取出胶块，用EB（溴化乙锭）溶液浸泡凝胶，摇床上染色30 min拍照。

7、聚类分析

对电泳图谱进行读带，根据指纹带的有无，分别转换为2个数码，即有带记为1，无带的为0；采用NTSYS2.1计算机软件的非加权组平均法UPGMA分析程序，进行分子指纹聚类分析，得出聚类树状图如图2。

所有菌株电泳图谱分成11种PFGE条带图谱类型，分别记为A~K。

聚类结果在遗传相似性为72.2%时所有菌株被分为4个亚群，依据标准菌株所在亚群分析可知，group1属于Xanthomonas euvesicatoria，标准菌株为ICMP98；group2组属于X. perforans，标准菌株为ICMP16690，group 3组属于X. vesicatoria，标准菌株为ICMP63；group 4组属于 X. gardneri，标准菌株为ICMP16689。说明该聚类的分群结果能把4种辣椒番茄细菌性疮痂病菌有效地区分开。