丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒及方法

摘要

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种检测样本中HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型病毒核酸存在的方法及试剂盒。本发明的技术方案为提供一种丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取液，PCR反应液，RT-PCR酶系，阳性质控品，阴性质控品，所述PCR反应液包括：1条逆转录引物：SEQ ID NO.1，2条丙型肝炎病毒特异性扩增引物：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，检测探针5条：SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.8。本发明的有益效果为本发明试剂盒可以检测HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型单独感染和混合感染。，检测通量较高，灵敏度、特异性高，可以区分常见亚型，检测结果可借助分析软件自动判断；成本低，操作简单，检测时间短。

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种采用实时荧光RT-PCR检测样本中HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型病毒核酸存在的方法及试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)是引起输血后非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原体，全球性传染，给人类健康带来极大的危害。HCV传播途径包括：输血及器官移植传播、静脉药瘾传播、医源性传播及性接触传播等。据世界卫生组织(WHO)估计，全世界HCV感染率平均约为3％，即约1.7-2.0亿HCV感染者，而且每年仍有300万～400万新发病例。HCV感染率在不同国家和地区有很大差异。鉴于传染源和传播途径的持续存在，加之近期内还不可能提供安全有效的疫苗，估计到2015年，慢性HCV感染的总人数将会增加4倍。我国HCV感染率也相当高，1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查结果显示我国抗-HCV的阳性率平均为3.2％，略高于全球平均水平，由于人口基数大，即使按照当时的总人口计算，HCV感染的绝对人数也已超过3000万。

丙型肝炎自然病程的发展是一个非常复杂的生物学过程，受病毒和宿主等多种因素的影响，如HCV病毒载量、基因型以及宿主年龄、性别、种族和免疫抑制等。有报道高水平病毒血症和HCV基因1b型感染可能与疾病进展或发展为肝癌有关；此外，年长者感染HCV、男性、酗酒、吸烟、肥胖、脂肪肝以及合并HBV或HIV感染也是加速或促进疾病恶化的相关因素。HCV高度变异性、泛嗜性、免疫耐受、免疫损伤等因素是导致HCV感染慢性化的重要原因，持续慢性HCV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，从无症状携带者到轻重悬殊、进展速度快慢不一的肝脏炎症和纤维化，有的还可能发展为肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。此外，HCV感染常伴发许多肝外疾病，如冷球蛋白血症、肾小球肾炎、皮肤黏膜病变和自体免疫性疾患等。感染HCV后发展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的时间大致为10年、20年和30年左右。据统计，丙型肝炎患者中约有60％转为慢性肝炎，其中又有20％的病人转为肝硬化或肝细胞肝癌(HCC)。全球每年HCV感染的患者数呈上升趋势，而且HCV感染的慢性化发生率明显高于乙型肝炎，易出现肝硬化、肝癌，是重要的死亡原因之一，因此慢性丙型肝炎病毒感染的诊断和治疗日益成为人类亟待解决的公共卫生难题。

HCV分子生物学特征：

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒，由于基因型不同，从各地分离的HCV基因组长度也不一致，一般为9400左右个核苷酸。基因组5′和3′端分别为非编码区(Untranslated Regeion，UTR)，中央部分为一个大的开放阅读码框架(Open Reading Frame，ORF)。结构区又分为核心蛋白基因区(C区)和衣壳蛋白基因区(E1和E2)；非结构区又分为NS1、NS2、NS3、NS4、NS5等。NS5区又分为两个亚区：NS5a区和NS5b区。各区序列保守程度由高到低依次为：5′UTR区＞C区＞NS3区＞NS4区、NS5区＞NS2区＞NS1/E2、E1＞3′UTR区。

HCV RNA具有高度的变异性，其变异率高达1.4-1.9×10^-3/核苷酸/年。其原因主要有：①复制酶无校正功能：HCV的复制不需逆转录酶的参与，直接在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerae，RDRP)指导下进行复制，而RDRP缺乏3′→5′核酸外切酶校正功能及其他核酸复制后修复能力，病毒复制可发生随机突变，复制中的错误掺入无法校正，最终导致HCV的高度变异；②易误性RDRP(error-proneRDRP，EP-RDRP)的存在：在HCV复制过程中存在的EP-RDRP，也是导致高度变异的重要原因；③正选择作用：由于宿主免疫选择压力的作用，使能有效激活宿主免疫应答的基因的变异高于其它基因。

HCV基因分型：

HCV RNA由多个区域组成，5’UTR区的序列最为保守，种系变化程度及进化率都很低，可用于区分主要基因型。目前根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV呈现三个水平的遗传变异性：型(types)、亚型(subtypes)和准病毒株(quasispecies)。HCV至少可分为6个基因型(HCV1-6型)，包含超过100个基因亚型(如1a、1b、1c、2a、2b等)。各型核酸序列之间相差31-34％，而亚型序列之间相差约20-23％，准病毒株序列之间相差1-10％。最多的差别序列集中在E1和E2区，而C基因和一些非结构蛋白基因例如NS3则相对保守得多。各型之间序列最为保守的区域是5′UTR区。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，其余各型由于其系统进化上的相似性，被列入HCV6型。

HCV基因分型的临床意义：有助于了解HCV型别进化、探讨HCV传播途径及分布特征，HCV基因型的研究为了解各型在进化中的出现和变化提供了线索，也有助于了解全球丙型肝炎的流行病学情况。

HCV 1、2、3基因型在全球范围内广泛分布，HCV 4型主要分布在北非和中东国家，HCV 5型主要分布于南非，而HCV 6型主要流行于东南亚。在西欧，HCV 1型占当地HCV感染的60-65％，而HCV 3a占大约20％；在美国，慢性HCV感染者主要为HCV 1型(大约占72％)，其次为HCV 2型(大约为16％)、HCV 3型(大约为10％)；在亚洲，HCV 3、6型分布较广，且变异较多；而在非洲，HCV1、2、4型分布广且变异多。这都源于这些HCV型别在一个地区长期流行。

HCV1b和2a在中国各地较为常见，位于西北、东北、东南和中原的大部分地区，主要HCV型别为基因型1b，其次为基因型2a；而在珠江三角洲地区，6a逐渐取代2a成为第二常见亚型；在西南地区则呈现以1b为主，2a、3a、3b、6a等多种基因型分布的特点，与内地其他地区有着显著不同；在我国罕见HCV 4型、5型感染，1a、2b也仅散见报道，较常见的混合感染为1b/2a。因此目前国内流行的主要HCV基因型别为1b、2a、3a、3b及6a。

关于HCV基因分型在肝脏疾病预测中的意义是HCV研究中颇受争议的话题。但在HCV感染的整个过程中，宿主内HCV的疾病表现有明显的生物学差异。某些人群感染HCV后会在短时间内出现严重的并发症，如肝纤维化和肝癌；而某些人群即使感染时间很久却无任何并发症。因此，很有可能存在病毒或宿主方面的因素，包括HCV基因型，会导致这种疾病感染的进程。目前的大多数研究者十分支持HCV基因型是影响病情的主要因素。

有研究报道在慢性HCV感染患者中，与其他基因型相比，HCV 1b型感染与更严重的肝脏疾病、更迅速的疾病恶化相关。Zein等发现HCV 1b基因型在肝硬化和肝脏失代偿要求肝移植的慢性活动性丙型肝炎患者中的感染率远远高于其他基因型。有证据表明，在HCV 1b感染率较高的日本，肝细胞肝癌的发生率远远高于HCV 1b感染率低的欧洲或美国，且发生时间也更早。虽然某些研究否认了以上提到的基因型与病情的相关性，但Ze in等发现，在美国，感染HCV 1b基因型的患者年龄普遍高于感染其他型别的患者，HCV 1b基因型的患者感染时间更早且病程更长；相同研究结果在法国和西班牙也有报道。因此，HCV 1b基因型是更严重的HCV相关性肝脏疾病的标志物。

HCV被发现以来，人们对影响干扰素持续病毒学应答(the sustainedviral response，SVR)的因素做了大量研究，如HCV基因型、病毒载量、患者型别、年龄及肝纤维化程度等，其中HCV基因型被认为对治疗效果影响最大。大量临床试验表明，HCV 1b及1a基因型比HCV 2型或3型对干扰素治疗的持续病毒学应答(SVR)更差。Zein等报道HCV 2型感染患者有60-70％在干扰素治疗6个月后有应答，而HCV 1型感染者只有10-15％有应答反应。这种差别在干扰素治疗的持续性应答方面经常出现，并且不受肝脏组织学特点或治疗前HCV RNA水平的影响。一些关于干扰素加利巴韦林联合治疗慢性HCV病人的研究发现：非1型HCV病人有比较高的SVR，1型HCV病人治疗48周才达到非1型HCV病人治疗24周的效果；2、3型HCV感染患者对干扰素的SRV率是1型HCV感染患者的2～3倍；干扰素加利巴韦林治疗4型HCV感染的SVR类似或低于1型，治疗5型的SRV接近于2和3型；治疗6型感染获得的SVR介于1型与2、3感染之间。

总之，相同的治疗方法对不同基因型HCV感染的治疗效果确实存在差异，尽管目前仍未明确其理论依据，但可以肯定的是，检测HCV基因型将有助于HCV感染临床诊断并预测治疗效果，为调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术已经广泛应用于RNA病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。RT-PCR技术克服传统方法费时、费力且无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要的缺点，已成为RNA病毒快速诊断的重要手段。一步法RT-PCR只要加入RNA和特异性引物即可实现在同一反应管内连续进行RNA-cDNA-PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA。

型特异性核酸探针实时荧光PCR(Real time PCR)：荧光PCR是在引物特异的基础上采用模版序列特异的荧光探针进一步提高PCR检测的专一性，每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。同时利用荧光共振能量转移的原理，使得PCR的检测灵敏度得极大的提高。检测探针一般是Taqman或MGB探针，扩增区采用HCV保守的5’UTR，检测结果与Innogenetics公司的LiPA试剂盒一致。该方法能较好的区分主要基因型。而且，目前国内市场上HCV定量的产品基本上都采用荧光PCR法，所以采用荧光PCR法进行HCV基因分型能够与HCV定量产品实现无缝衔接。

发明内容

本发明的目的是提供一种将荧光PCR技术的高灵敏度和一步法RT-PCR技术的快速便捷相结合的基因检测技术，一步法RT-PCR即逆转录和PCR在一个共同的体系中进行。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，有助于减少残余污染，简化了实验操作步骤。而且，一步法RT-PCR逆转录所得的cDNA全部用于PCR扩增，故可以得到更高的灵敏度。基于以上特点，一步法RT-PCR在临床检测应用中将有显著的优势。

本发明采用一条HCV特异性引物逆转录得HCV基因组部分片段，该片段覆盖了所有待测亚型的检测位点，再以该片段为模板进行PCR扩增以及荧光检测。

本发明的技术方案为提供一种丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取液，PCR反应液，RT-PCR酶系，阳性质控品，阴性质控品，所述PCR反应液包括：

引物L-pri-C1：5’-ACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAG-3’；

引物L-pri-C2：5’-AATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT-3’；

引物L-pri-C3：5’-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；

探针L-pro-C1：5’-CCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGC-3’；

探针L-pro-C2：5’-GGAATTGCCGGGAAGACTGGGTCCTTTC-3’；

探针L-pro-C3：5’-ACCGGAATCGCTGGGGTGACCGGGTCC-3’；

探针L-pro-C4：5’-AACCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGG-3’；

探针L-pro-C5：5’-CCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGT-3’；

所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

优选的，所述荧光探针5’端标记FAM或HEX，3’端标记TAMARA或BHQ1。

优选的，所述RT-PCR酶系包括M-MLV逆转录酶、RNase抑制剂、TaqDNA聚合酶。

优选的，所述PCR反应液还包括纯水、RT-PCR buffer、MgCl₂、dATP、dTTP、dGTP、dCTP。

本发明的另一技术方案为一种丙型肝炎病毒五种亚型的RT-PCR检测方法，该方法包括下述具体步骤：

a、提取待测样品的RNA；

b、以步骤a提取的RNA为模板，用权利要求1所述引物和探针采用一步法RT-PCR方法进行PCR荧光检测，根据扩增曲线判定样品检测结果。

优选的，所述步骤a具体为

1)吸取600μl RNA提取1液转入洁净的1.5ml离心管，再加入100μl待测样品，迅速地振荡混匀，静置5分钟；

2)加入500μl RNA提取2液，迅速地振荡混匀；

3)吸取600μl步骤2)得到的裂解混合液转移至RNA纯化柱的吸附柱中，8000rpm离心1分钟；

4)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，重复步骤3)；

5)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取3液，8000rpm离心1分钟；

6)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取4液，8000rpm离心1分钟；

7)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取5液，8000rpm离心1分钟；

8)将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，将吸附管装回收集管中，12000rpm离心1分钟，丢弃RNA纯化柱的收集管，将RNA纯化柱的吸附管放入到一洁净的RNA收集管中；

9)往吸附管中央滴加35μl RNA提取6液，静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，收集流穿液，-20℃保存备用。

本发明的有益效果为本发明试剂盒可以同时检测多种基因序列，检测通量较高，灵敏度、特异性高，可以区分常见亚型，检测结果可借助分析软件自动判断，成本低，操作简单，检测时间短，适于在普通分子生物学实验室和临床实验室推广使用，具有很好的临床应用前景。一次实验可同时检测HCV国内常见的5个主要基因亚型(1b、2a、3a、3b、6a)，对检测设备要求简单。

附图说明

图1：阴性参考品CN1在三个反应液的PCR扩增曲线；

图2：阴性参考品CN2在三个反应液的PCR扩增曲线；

图3：阴性参考品CN3在三个反应液的PCR扩增曲线；

图4：阳性参考品CP1在三个反应液的PCR扩增曲线；

图5：阳性参考品CP2在三个反应液的PCR扩增曲线；

图6：阳性参考品CP3在三个反应液的PCR扩增曲线；

图7：阳性参考品CP4在三个反应液的PCR扩增曲线；

图8：阳性参考品CP5在三个反应液的PCR扩增曲线；

图9：阳性参考品CP6在三个反应液的PCR扩增曲线；

图10：阳性参考品CP7在三个反应液的PCR扩增曲线；

图11：最低检测量参考品CS1在三个反应液的PCR扩增曲线。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例1本试剂盒组成

本发明采用一条HCV特异性引物逆转录得HCV基因组部分片段，该片段覆盖了所有待测亚型的检测位点，再以该片段为模板进行PCR扩增以及荧光检测。

检测试剂盒使用1条逆转录引物：SEQ ID NO.1，2条丙型肝炎病毒特异性扩增引物：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，检测探针5条：SEQ IDNO.4到SEQ ID NO.8，配以RT-PCR Buffer、DNA聚合酶(Taq)、逆转录酶、RNa se抑制剂、dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种单核苷酸单体等成分，通过逆转录反应、PCR体外扩增和荧光信号检测进行丙型肝炎病毒检测。

一、原料来源制备

1、引物和探针

引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。其中不同的探针5’端分别标记FAM或HEX荧光报告基团，3’端均标记TAMRA荧光淬灭基团。引物和探针序列见表1。

表1

产品使用质量控制标准品

使用阳性参考品CP1作为产品使用时的阳性质控品，使用阴性参考品CN1作为产品使用时的阴性质控品。

经过研究确定本试剂盒各亚型RT-PCR反应液生产工艺由三大部分组成，即配制前准备、配制和分装。

根据生产工艺和反应体系研究结果确定本试剂盒各亚型RT-PCR反应液配制单如表2所示。

表2

表2中的符号表示不需要加该试剂

取三只配液瓶，按配制单上每种试剂的量乘以配制人份数，混合均匀。使用单通道移液器将上述各亚型RT-PCR反应液按380μL/管分装。分装1000人份各亚型RT-PCR反应液约需要3小时。

2、RT-PCR酶系生产工艺

经过研究确定本试剂盒RT-PCR酶系生产工艺由配制和分装两部分组成，具体的配制单为：

表3

M-MLV逆转录酶

经供应商审计，选用Promega公司的产品，规格为200U/μL，RNaseH活性缺失，纯度大于90％，具有RNA逆转录酶活性，不含RNase，无核酸内切酶活性或核酸外切酶活性，于-20±5℃保存不冻结。

RNase抑制剂(RNasin)

经供应商审计，选用Promega公司的产品，规格为40U/μL，纯度大于90％，能够抑制RNaseA、RNaseB、RNaseC和人胎盘RNase活性，不影响AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶活性，不含RNase，无核酸内切酶活性或核酸外切酶活性，于-20±5℃保存不冻结。

Taq DNA聚合酶

经供应商审计，选用KaTaRa公司的产品。规格为5U/μL，纯度＞95％，具有DNA聚合酶活性和5’-3’DNA外切酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性，于-20±5℃保存不冻结。

dNTPs

经供应商审计，选用Promega公司的产品。dATP，dCTP，dGTP，dTTP为澄清透明溶液，标示值为100mmol/L；将dATP∶dCTP∶dGTP∶dTTP＝1∶1∶1∶1配制为10mmol/L的混合液。

取一只配液瓶，按配制单上每种试剂的量乘以配制人份数，混合均匀。使用单通道移液器将上述RT-PCR酶系按60μL/管分装。分装1000人份RT-PCR酶系约需要1小时。

3、核酸提取试剂生产工艺

经过研究确定本试剂盒核酸提取试剂生产工艺由三大部分组成，即配制前准备、配制和分装。根据生产工艺和反应体系研究结果确定本试剂盒核酸提取试剂配制单如表4和表5。

表4

表5

  分装量(mL/管)  RNA提取1液  6  RNA提取2液  5  RNA提取3液  5  RNA提取4液  5  RNA提取5液  5  RNA提取6液  0.35

取若干配液瓶，按配制单上各种提取液的配方配制，混合均匀。使用单通道移液器将上述各种提取液按照分装单表分装。分装1000人份核酸提取试剂约需要2小时。

二、本试剂盒生产工艺主要控制点

1、备料

检测试剂盒使用1条逆转录引物、2条丙型肝炎病毒特异性扩增引物和5条探针，配以RT-PCR Buffer、DNA聚合酶(Taq)、逆转录酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种单核苷酸单体等成分，通过逆转录反应、PCR体外扩增和荧光信号检测进行丙型肝炎病毒检测。

上述的引物和探针均为专用原料，原材料消耗量均较小，原材料取样、检验均在质检中心进行，周转容器的清洁、干燥、消毒在车间清洗间进行。

2、配制

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的配制包括核酸提取试剂的配制：RNA提取1液的配制、RNA提取3液的配制、RNA提取4液的配制、RNA提取5液的配制、RNA提取6液的配制；RT-PCR试剂配制：酶系的配制、HCV 1b RT-PCR反应液的配制、HCV 2a/6a RT-PCR反应液的配制、HCV 3a/3b RT-PCR反应液的配制、HCV分型阳性质控品的配制和HCV分型阴性质控品的配制；其中HCV分型阳性质控品和HCV分型阴性质控品的制备在一万级工作区内的II级生物安全柜内进行；其他项目的配制在车间配制间内进行。

接备料间和纯化间来料，经电子天平称量后配制，质检检验，合格品送至分装各岗位分装。

3、分装

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的分装包括核酸提取试剂的分装：RNA纯化柱的分装、RNA提取1液的分装、RNA提取2液的分装、RNA提取3液的分装、RNA提取4液的分装、RNA提取5液的分装、RNA提取6液的分装、RNA收集管的分装、八联PCR管(配管盖)的分装；RT-PCR试剂分装：RT-PCR酶系的分装、HCV 1b RT-PCR反应液分装、HCV 2a/6a RT-PCR反应液分装、HCV 3a/3b RT-PCR反应液分装、HCV分型阳性质控品的分装和HCV分型阴性质控品的分装。其中HCV分型阳性质控品和HCV分型阴性质控品的分装在一万级工作区内的II级生物安全柜内进行；其它项目的分装在车间配制间内进行。

接备料间和配制间来料，由人工进行分装，合格品送至车间外包装岗位组装。

4、包装

接分装间送来的半成品，在外包装台上人工将检验合格的半成品按下列组装成预冷的包装盒，组装成检测试剂盒。

试剂盒包括核酸提取试剂和RT-PCR试剂两部分，每盒规格为10人份，其中核酸提取试剂含RNA纯化柱、RNA收集管(RNase free)、八联PCR管(配管盖)各1包，RNA提取1液、RNA提取2液、RNA提取3液、RNA提取4液、RNA提取5液各一瓶、RNA提取6液一管；RT-PCR试剂含RT-PCR酶系、HCV 1b RT-PCR反应液、HCV 2a/6a RT-PCR反应液、HCV 3a/3b RT-PCR反应液、HCV分型阳性质控品和HCV分型阴性质控品各1管。

本试剂盒组装后，核酸提取试剂2-8℃保存，RT-PCR试剂保存于-20±5℃，应避免反复冻融。有效期为6个月。成品组装完成后取样送检，检验合格后方可入库。

5、人员净化

十万级洁净区的操作人员需经换鞋、脱外衣、穿洁净服、洗手消毒后进入操作区；一万级洁净区的工作人员需再经换鞋、穿连体无菌工作服进入洁净操作区。

三、标准品(校准品)、质控品的制备方法

企业工作参考品的制备方法及溯源情况

工作参考品的组成：阳性参考品(7份，CP1-CP7)、阴性参考品(3份，CN1-CN3)、最低检测量参考品(1份，CS1)、精密度参考品(1份，CP1)。

1、阳性参考品

收集临床检测结果为丙型肝炎病毒阳性的已灭活的血清或血浆样本，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光PCR检测，从中选取1b单亚型、2a单亚型、3a单亚型、3b单亚型、6a单亚型、1b&2a混合亚型、1b&6a混合亚型七种常见型别的样本，这些样品的PCR产物用引物L-pri-C1&C2或L-pri-C1&C3由上海英骏生物技术有限公司进行测序。测得的序列通过网站ht tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行序列比较，比较结果与荧光PCR检测结果一致的临床样本血清或血浆，采用“丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2009第3400677号，科华生物工程股份有限公司)对其进行定量检测，选取检测结果浓度为5×10⁴IU/ml～5×10⁶IU/mL的血清或血浆样本。将相同基因亚型的血清或血浆混合均匀，按1000μL/管分装，1套7份，编号CP1-CP7，-20±5℃保存。

以企业阳性参考品作为待检样本，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按照试剂盒说明书进行检测，分型结果应与测序结果一致，即CP1-CP7均为相应型别阳性。

2、阴性参考品

收集已灭活的血清或血浆样本，采用“丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2009第3400677号，科华生物工程股份有限公司)和“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2008第3400932号，科华生物工程股份有限公司)对其进行定量检测，选择丙型肝炎病毒阴性和乙型肝炎病毒阴性的样本，混合均匀，按1000μL/管分装，编号CN1。-20±5℃保存。

收集已灭活的血清或血浆样本，采用“丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2009第3400677号，科华生物工程股份有限公司)和“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2008第3400932号，科华生物工程股份有限公司)对其进行定量检测，选择丙型肝炎病毒阴性和乙型肝炎病毒阳性的样本，混合均匀，按1000μL/管分装，编号CN2-CN3。-20±5℃保存。

以企业阴性参考品作为待检样本，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按照试剂盒说明书进行检测，检测结果应为CN1-CN3均为阴性。

3、最低检出量参考品

收集临床检测结果为丙型肝炎病毒阳性的已灭活的血清或血浆样本，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光PCR检测，并经测序证实为HCV 1b型；筛选出HCV 1b基因亚型阳性样本；再采用“丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(国食药监械(准)字2009第3400677号，科华生物工程股份有限公司)对最低检出量参考品母液的病毒浓度进行定量，取10次定量的平均值大于1.0×10⁷IU/mL的样品；然后采用已灭活的阴性血清或血浆，将定量值大于1.0×10⁷IU/mL的样品稀释至1.0×10⁷IU/mL，将稀释后的样品混合均匀，按1000μL/管分装，1套1管，编号为CS1。-20±5℃保存。

以最低检出量参考品作为待检样本，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按照试剂盒说明书进行检测，结果应为1b单亚型阳性。

4、精密度参考品

采用阳性参考品CP1作为精密度参考品，混匀后按1000μL/管分装，1套1管，编号为CP1。-20±5℃保存。

以1份精密度参考品CP1作为待检样本进行检测，用本公司的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按照试剂盒说明书进行检测，重复10次。10次检测结果都应该是HCV 1b单亚型阳性。

5、HCV分型阳性质控品

采用阳性参考品CP1作为HCV分型阳性质控品，混匀后按100μL/管分装，-20±5℃保存。

以HCV分型阳性质控品作为待检样本，用质检合格的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按试剂盒说明书进行检测，检测结果应为HCV 1b单亚型阳性。

6、HCV分型阴性质控品

采用阴性参考品CN1作为HCV分型阴性质控品，混匀后按100μL/管分装，-20±5℃保存。

以HCV分型阴性质控品为待检样本，用质检合格的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按试剂盒说明书进行检测，检测结果应为阴性。

四、本发明试剂盒主要成分

本品选取HCV基因5’-UTR区域，设计特异性引物及荧光探针，采用PCR-荧光探针法，检测样品中HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型病毒核酸，可检测HCV 1b、2a、3a、3b和6a亚型单独感染和混合感染。

1、本试剂盒主要组成成分如表6。说明：1、试剂盒中不同批号的组分可以互换使用。2、HCV分型阳性质控品来源于临床收集的HCV 1b阳性感染者的血浆样本，用生理盐水适当稀释后所得的液体；HCV分型阴性质控品来源于临床收集的HCV阴性血浆样本。以上质控品均经过灭活处理。

表6

2、储存条件：

试剂盒I(内含RT-PCR试剂和质控品)保存于-20±5℃，应避免反复冻融。试剂盒II(内含核酸提取试剂)保存于2-8℃。本产品在以上所述相应储存条件下的有效期为6个月。

3、适用仪器

包括Agilent Stratagene Mx3000P、ABI Prism 7500、7300、7000等ABI系列等仪器。

五、样本制备

本试剂盒样本来源为血清或血浆。

1、血清制备：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30-60分钟，但不超过4小时，血标本可自凝析出血清，或1500rpm离心5-10分钟，吸取上层血清并转移至无菌离心管中；

2、血浆制备：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管使静脉血与抗凝剂充分混匀，室温放置5-10分钟，1500rpm离心5-10分钟，吸取上层血浆并转移至无菌离心管中。

3、制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，4℃保存不超过48小时，-20℃保存不超过半年，应避免反复冻融。运输时需用0℃冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时限不宜超过48小时。

实施例2本试剂盒的使用

一、HCV RNA提取

阳性、阴性质控品与临床样本并行RNA提取

注：RNA提取1液低温保存可能出现结晶沉淀，37℃温育至沉淀完全溶解即可使用。

1、吸取600μl RNA提取1液转入洁净的1.5ml离心管，再加入100μl临床样本(或阳性质控品，或阴性质控品)，迅速地振荡混匀，室温静置5分钟。

2、加入500μl RNA提取2液，迅速地振荡混匀。

3、吸取600μl裂解混合液转移至RNA纯化柱的吸附柱中，室温、8000rpm离心1分钟。

4、将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，重复步骤(3)。

5、将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取3液，室温、8000rpm离心1分钟。

6、将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取4液，室温、8000rpm离心1分钟。

7、将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，往吸附管中加入500μlRNA提取5液，室温、8000rpm离心1分钟。

8、将RNA纯化柱的收集管中的液体倒掉，将吸附管装回收集管中。室温、12000rpm离心1分钟，丢弃RNA纯化柱的收集管，将RNA纯化柱的吸附管放入到一洁净的RNA收集管中。

9、往吸附管中央滴加35μl RNA提取6液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心2分钟。收集流穿液，-20℃保存备用。

二、RT-PCR扩增

取各亚型HCV RT-PCR反应液，取三只离心管，各离心管中分别加入各亚型HCV RT-PCR反应液38×(n+2)μl和酶系2×(n+2)μl，(n＝受检样本数)，混匀，各管分别按40ul/管分装到PCR反应管中。再往各亚型HCV RT-PCR反应液中分别加入样本或质控品的RNA提取产物各10μl。

轻弹管壁混匀，应避免气泡产生，6000rpm瞬时离心后，放入荧光PCR仪，按下列表7所述程序条件扩增。

表7

荧光素设置：所有检测孔均设置为FAM-TAMRA和HEX-TAMRA(无HEX可设置为JOE)；

荧光信号收集：Stage4：60℃---45sec；

反应体积：50ul。

结果分析：反应结束后，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～3、End值可设在5～10，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果)

质量控制：

阴性质控品：各反应管均无典型S型扩增曲线或Ct值＞25.1；

阳性质控品：HCV 1b RT-PCR反应管中FAM标记曲线呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1；其余反应管中均无典型S型扩增曲线或Ct值＞25.1；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

三、试验结果的判定

如果检测样本无典型S型扩增曲线或Ct值＞25.1，则判样本为HCV1b、2a、3a、3b和6a阴性。

如果检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，则根据表8判断样本的亚型。

表8

参考值(参考范围)

根据临床样本的试验结果，经统计学分析后，确定本试剂盒的Cutoff值为25.1。

检验结果的解释

检测样本时，若HCV 1b RT-PCR反应管中FAM荧光素呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，可能的情况是HCV 1b亚型感染或复合感染；若HCV 2a/6a RT-PCR反应管中FAM荧光素呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，可能的情况是HCV 2a亚型感染或复合感染；若HCV 2a/6a RT-PCR反应管中HEX荧光素呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，可能的情况是HCV 6a亚型感染或复合感染；若HCV 3a/3b RT-PCR反应管中FAM荧光素呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，可能的情况是HCV 3a亚型感染或复合感染；若HCV 3a/3b RT-PCR反应管中HEX荧光素呈典型S型扩增曲线且Ct值≤25.1，可能的情况是HCV 3b亚型感染或复合感染；

产品性能指标

1、最低检出量：本试剂盒对标本的最低检出量为1.0×10³IU/ml。

2、交叉反应：试剂盒对于HCV阴性样本，检测结果为阴性，无交叉反应。

四、优点和效果：

同类产品在国内外批准上市情况及所采用的技术方法：

在SFDA数据库“药品注册批准信息”中以“HCV”为关键词，检索到3条与丙型肝炎病毒核酸检测试剂相关的信息(见表9)，均为HCV定性或定量检测试剂，所采用的技术方法皆为荧光PCR，无批准上市的HCV基因分型试剂。

表9

通过查阅文献及相关网站，找到国外有以下几种已批准上市的的HCV基因分型检测试剂盒(见表9)：

1)INNO-LiPA HCV II：是由Innogenetics公司(Belgium)开发的利用反向线性杂交方法进行HCV分型检测的试剂盒，扩增5’UTR区，能检测HCV 1-6共6种不同的基因型及1a、1b、2a/c、2b、3a-c、4a-h、5a、6a等亚型，已通过CE认证。

2)Versant HCV Genotype Assay(LiPA)2.0：由法国Bayer公司联合Innogenetics公司(Belgium)推出的新版HCV基因分型试剂，已通过CE认证。原理同样是线性探针杂交，但对1型和6型以及1a与1b的区分更准确，因为除5’UTR外，增加了C区序列信息。

3)Abbott HCV ASR：美国Abbott公司的产品。靶区域为5’UTR和NS5B，采用多色三管Real-time RT-PCR技术，可检测HCV主要基因型1-6，还可以区分1a和1b。已通过FDA认证。

4)Trugene 5′NC Genotyping Kit：Bayer公司产品，是已商品化的HCV测序试剂，其有专门的试剂盒、测序系统以及分析软件，检测区域在5′UTR，区分主要基因型与LiPA有很好的一致性，但不能准确检测亚型。国外批准上市的HCV基因分型试剂盒见表10。

表10

申请注册产品与国外同类产品的比较

从检测原理、检测基因型别、试剂费用等几个方面对本公司申请注册的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的方法与国外已获证并应用较普遍的试剂盒进行的比较，见表11。

表11

从上表中可以看出，在四种试剂盒中，申请注册产品与Abbott HCVASR检测原理基本相同，也是采用实时荧光PCR检测的方法。在检测型别方面，Abbott HCV ASR试剂盒能同时检测1-6型，而本公司研发的试剂盒检测的型别为1b、2a、3a、3b和6a型，少于Abbott HCV ASR试剂盒，但根据文献报道以及我们的临床考核试验，国内HCV病毒的主要基因亚型为1b、2a、3a、3b和6a型，尚未发现4，5型。因而试剂盒的设计能满足国内的HCV基因型检测需求。此外，Abbott HCV ASR检测试剂价格高，不容易在国内开展。

INNO-LiPA HCV II(VERSANT HCV Genotype 2.0 Assay)和Trugene5′NC Genotyping试剂相对于申请注册试剂而言，检测仪器或试剂价格昂贵，不适于临床普遍推广使用，而且存在对某些主要基因型检测特异性不高，不能准确区分亚型，对混合感染的检测能力低等缺点。

本申请注册试剂1次试验在3管PCR中同时检测多种基因序列，检测通量较高；灵敏度、特异性高，可以区分常见亚型，检测结果可借助分析软件自动判断；成本低，操作简单，检测时间短，适于在普通分子生物学实验室和临床实验室推广使用，具有很好的临床应用前景。

质量控制体系稳定可靠；产品稳定性能良好，检测结果可靠准确，具有较高的临床应用价值。一次实验可同时检测HCV国内常见的5个主要基因亚型(1b、2a、3a、3b、6a)；对检测设备要求简单。

本试剂盒在实验室性能评价方面主要进行了包括以下几个方面的性能研究：最低检出量、准确性、特异性、精密度、重复性和混合感染等。

请参阅图1到图11：

图1-3为阴性参考品CN1-CN3分别在HCV 1b RT-PCR反应液、2a/6aRT-PCR反应液和3a/3b RT-PCR反应液中的PCR扩增曲线；

图4-10为阳性参考品CP1-CP7分别在HCV 1b RT-PCR反应液、2a/6aRT-PCR反应液和3a/3b RT-PCR反应液中的PCR扩增曲线；

图11为最低检测量参考品CS1在HCV 1b RT-PCR反应液、2a/6aRT-PCR反应液和3a/3b RT-PCR反应液中的PCR扩增曲线。

分析最低检出量实验结果表明本试剂盒可以稳定地检出最小浓度为1×10³IU/m L HCV血清样本；

分析准确性实验结果表明对于不同类型阳性样本，本试剂盒检测结果均与测序结果完全吻合；

分析特异性实验结果表明HCV临床阴性样本不干扰本试剂盒的检测结果，不存在非特异扩增反应；

精密度研究结果表明本试剂盒批内与批间一致性好，批内精密度与批间精密度均≤10％。

重复性研究结果表明在各种实验条件下能反复多次稳定检出五种临床常见的HCV基因亚型，重复性为100％。

混合感染试验结果显示本试剂盒对国内常见的HCV 1b&2a混合亚型感染和HCV 1b&6a混合亚型感染均能准确地检出。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。