从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法

摘要

本发明提供了一种从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法，该方法通过大孔吸附树脂梯度洗脱，分别得到了高纯度的淫羊藿苷和淫羊藿次苷II提取物。本发明还提供了淫羊藿苷或淫羊藿次苷II的提取分离方法。本发明不仅实现了对淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的同时提取分离，简化了工艺流程，还得到了纯度较高的药物中间体，显著增加了单体成分的收率，提高了药材的利用率，降低了生产成本；同时，本发明方法未使用毒性较大的有机溶剂，保障了操作人员的安全性，实现了绿色生产，具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法。

背景技术

淫羊藿，是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种 功效。由于现代天然药物化学学科的发展，对淫羊藿中的单体活性成分的研 究越来越多。

淫羊藿苷，是从淫羊藿中提取分离的单体之一，对于改善心血管系统、 调节内分泌、增强免疫力、性激素样作用以及抗肿瘤、抗肝毒等方面都有积 极的疗效作用。淫羊藿次苷II，是近几年从淫羊藿中开发出的新单体，在血 管内皮细胞功能改善作用中优于淫羊藿苷；在抑制脂质过氧化、总抗氧化能 力和还原力方面，均具有明显的抗氧化能力；此外还同样具有和淫羊藿苷部 分相同的药理作用（健骨、性激素样等）。

由于淫羊藿苷和淫羊藿次苷II突出的药理作用，已经使其在治疗骨质疏 松、免疫系统、心脑血管或抗癌、防癌的药物或保健品中占据重要地位，其 开发应用和研究前景更宽阔。

针对淫羊藿的上述黄酮类成分，目前已有相关制备方法的报道。如专利 号：03141371.4，该专利中将淫羊藿水提醇沉收，上D101大孔吸附树脂，并 用85%乙醇进行洗脱，最终得到总黄酮含量在50%以上的淫羊藿提取物，其 中，淫羊藿苷含量可达到9%左右。但，上述专利中，提取物中，淫羊藿苷 的含量较低，若还需对淫羊藿苷的进一步分离纯化，后续操作更为复杂，成 本较高。专利申请号：CN 200710133883.3，该专利申请中，将淫羊藿用70% 乙醇提取后，经二氯甲烷脱杂、乙酸乙酯萃取后，再上DM130大孔树脂， 先以碱溶液、20%乙醇冲洗除杂后，再以60%乙醇洗脱，干燥后，提取物中 淫羊藿苷含量达到52%，收率达45.11%；该专利还指出，55%-60%乙醇对淫 羊藿苷的洗脱效果最佳。该专利申请方法，有效提高了淫羊藿苷的纯度，使 得后期分离纯化更为简便，但是，该方法中，需采用二氯甲烷，它是一种毒 性溶剂，在高浓度时会对人体肝、肾和脑组织造成损伤，而且，它对动物有 致癌作用，是人类潜在的致癌物。对于淫羊藿次苷II而言，目前多是采用将 淫羊藿苷水解得到，并没有从淫羊藿中有效提纯淫羊藿次苷II的报道，虽然 这种方式可以有效提纯淫羊藿次苷II，但该方法已将淫羊藿苷水解，无法同 时得到淫羊藿苷，不利于药材资源的利用。

目前未见采用同一分离方法直接分离提取淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的相 关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环境安全性良好、从淫羊藿中同时提取分离 淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法。本发明的另一目的在于提供提取分离淫羊 藿苷或淫羊藿次苷II的方法。

本发明提供了一种从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的 方法，它包括如下操作步骤：

（1）取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液 备用；

（2）取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-70%V/V 乙醇洗脱，分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液Ⅰ和乙醇浓度为 50%-70%V/V的洗脱液Ⅱ；

（3）将洗脱液Ⅰ回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯 层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出 固形物，即得淫羊藿苷粗品；

（4）将洗脱液Ⅱ回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯 层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出 固形物，即得淫羊藿次苷II粗品。

其中，步骤（1）所述水提醇沉过程中，乙醇浓度在60%V/V以上。

进一步地，步骤（1）所述水提醇沉过程中，乙醇浓度为60%V/V。

更进一步地，步骤（1）中，所述水提的具体操作如下：

取淫羊藿药材，加水煎煮2次以上，合并水煎液，减压浓缩至60℃下测 定的相对密度为1.1-1.2。

其中，步骤（2）中，所述非极性大孔吸附树脂为D101型、AB-8型或 DM-130型；所述中极性大孔吸附树脂为DM301型。

进一步地，步骤（2）的具体操作如下：

取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度 为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V、50%V/V、60%V/V、70%V/V乙 醇进行洗脱，并分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V的洗脱液Ⅰ和乙醇浓度为 50%-70%V/V的洗脱液Ⅱ。

更进一步地，步骤（2）中，20%V/V乙醇用量为4-5倍柱体积；30%V/V 乙醇用量为3-5倍柱体积；40%V/V乙醇用量为4-6倍柱体积；45%V/V乙醇 用量为3-5倍柱体积；50%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；60%V/V乙醇用量 为4-5倍柱体积；70%V/V乙醇用量为3-6倍柱体积。

其中，步骤（3）、（4）中所述乙醇的浓度为60%V/V，所述冷藏的温度 为0~4℃。

其中，所述淫羊藿苷粗品中，淫羊藿苷含量为45%-50%W/W；所述淫羊 藿次苷II粗品中，淫羊藿次苷II含量为58%-63%W/W。

其中，所述淫羊藿选自小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicornu  Maxim.）、朝鲜淫羊藿（Epimedium koresnum Nakai.）、箭叶淫羊藿（Epimedium  sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.）、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens  Maxim.）、巫山淫羊藿（Epimedium wushanense T.(S.Ying)及其近缘替用品 种。

本发明还提供了一种提取分离淫羊藿苷的方法，它包括如下操作步骤：

（1）取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液 备用；

（2）取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-45%V/V 乙醇洗脱，分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液；

（3）将洗脱液回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层， 回收溶剂后，加入60%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物， 即得淫羊藿苷粗品。

进一步地，步骤（2）的具体操作如下：

取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度 为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V乙醇进行洗脱，收集乙醇浓度为 40%-45%V/V的洗脱液。

本发明还提供了一种分离淫羊藿次苷II的方法，它包括如下操作步骤：

（1）取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液 备用；

（2）取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用 20%-45%V/V、50%-70%V/V乙醇洗脱，收集乙醇浓度为50%-70%V/V的洗 脱液；

（3）将洗脱液，回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯 层，回收溶剂后，加入60%乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物， 即得淫羊藿次苷II粗品。

进一步地，步骤（2）的具体操作如下：

取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度 为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V、50%V/V、60%V/V、70%V/V乙 醇进行洗脱，收集乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明可以在同一种分离方法下，同时实现对淫羊藿苷和淫羊藿 次苷II两种单体成分的提取分离，简化了两种单体成分的提取分离流程，充 分利用了淫羊藿药材资源，大幅降低了生产成本；

（2）本发明提取分离过程中，未使用二氯甲烷等毒性较大的有机溶剂， 避免了对操作人员的健康危害，减少了对环境的污染；

（3）本发明方法可以分别得到纯度较高的淫羊藿苷粗品（纯度 45%-50%）和淫羊藿次苷II粗品（纯度58%-63%），为两种单体成分的进一 步纯化和医药应用提供了高含量的中间体。同时，本发明提取分离方法中， 两种单体成分的收率均在80%以上，明显优于现有分离方法。

附图说明

图1淫羊藿苷对照品的液相色谱图；

图2淫羊藿次苷II对照品的液相色谱图；

图3淫羊藿苷粗品的的液相色谱图；

图4淫羊藿次苷II粗品的液相色谱图。

具体实施方式

本发明中所用淫羊藿，均参照《中国药典》2005版，选自小檗科植物淫 羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）、朝鲜淫羊藿（Epimedium koresnum  Nakai.）、箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.）、 柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens Maxim.）、巫山淫羊藿（Epimedium  wushanense T.(S.Ying)。其近缘替用品种也可使用。

实施例1 本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法

1）取朝鲜淫羊藿（Epimedium koresnum Nakai.）药材500g同时：测 定淫羊藿苷，水份。

2）将1)中所述药材用17倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药 渣和滤液。

3）将2)中所得药渣用10倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第 二次药渣和滤液。

4）将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置9h， 取其上清液在55℃-70℃段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60℃下测定相对密 度为1.1-1.2范围段，得到浸膏。

5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置10h，离 心，取上清液减压蒸馏至500ml。

6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为：用450g DM301树脂，5%的 NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和20h，备用。

7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和22h得到饱 和大孔树脂。

8)用20%乙醇4倍柱体积，30%乙醇3倍柱体积，40%乙醇4倍柱体积， 45%乙醇3倍柱体积、50%乙醇3倍柱体积，60%乙醇4倍柱体积，70%乙醇 3倍柱体积，80%乙醇3倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓 度洗脱液：40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。

9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70% 洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。

10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯80ml，分别萃取10min弃去 水层。回收乙酸乙酯。

11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各30ml，超声21min，过滤，滤 渣弃去，滤液备用。

12)将11)中所得滤液在0~4℃冷藏过夜，结晶析出沉淀。

13)将12)中所得沉淀进行合并，40%-45%洗脱液合并得到46%淫羊藿苷 粗品（淫羊藿苷46%，淫羊藿次苷II 2.5%），50%-70%洗脱液合并得到59% 淫羊藿次苷II粗品（淫羊藿苷0%，淫羊藿次苷II 59%）。

所得终产品纯度测定实验方法如下：

色谱条件：Dikma C₁₈色谱柱（4.5×150mm，5μm）；流动相：乙腈（A） -水（B）梯度洗脱，0~7min，30%A，7~8min，30%~45%A，8~20min，45%A； 流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：270nm。

对照品溶液的制备：分别取淫羊藿苷、淫羊藿次苷II对照品适量，精密 称定，加甲醇制成每1ml约各含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取终产品约0.1g，精密称定，置具塞量瓶中，加稀 乙醇50ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

测定结果见图1-4。

实施例2 本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法

1）取淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）药材500g  同时：测定 淫羊藿苷，水份。

2）将1)中所述药材用19倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药 渣和滤液。

3）将2)中所得药渣用11倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第 二次药渣和滤液。

4）将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置13h， 取其上清液在55℃-70℃段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60℃下测定相对密 度为1.1-1.2范围段，得到浸膏。

5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置8h，离 心，取上清液减压蒸馏至500ml。

6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为：用450g AB-8树脂，5%的 NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和18h，备用。

7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和24h得到饱 和大孔树脂。

8)用20%乙醇5倍柱体积，30%乙醇5倍柱体积，40%乙醇6倍柱体积， 45%乙醇4倍柱体积，50%乙醇5倍柱体积，60%乙醇4倍柱体积，70%乙醇 6倍柱体积，80%乙醇4倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓 度洗脱液：40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。

9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70% 洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。

10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯100ml，分别萃取12min弃 去水层。回收乙酸乙酯。

11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各50ml，超声18min，过滤，滤 渣弃去，滤液备用。

12)将11)中所得滤液在0~4℃冷藏过夜，结晶析出沉淀。

13)将12)中所得沉淀进行合并，40%-45%洗脱液合并得到49%淫羊藿苷 粗品，50%-70%洗脱液合并得到61%淫羊藿次苷II粗品。测定方法如实施例 1。

实施例3 本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法

1）取箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.） 药材500g同时：测定淫羊藿苷，水份。

2）将1)中所述药材用19倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药 渣和滤液。

3）将2)中所得药渣用7倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第二 次药渣和滤液。

4）将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置11h， 取其上清液在55℃-70℃段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60℃下测定相对密 度为1.1-1.2范围段，得到浸膏。

5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置6h，离 心，取上清液减压蒸馏至500ml。

6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为：用450g DM301树脂，5%的 NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和22h，备用。

7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和26h得到饱 和大孔树脂。

8)用20%乙醇6倍柱体积，30%乙醇7倍柱体积，40%乙醇5倍柱体积， 45%乙醇5倍柱体积，50%乙醇7倍柱体积，60%乙醇6倍柱体积，70%乙醇 6倍柱体积，80%乙醇4倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓 度洗脱液：40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。

9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70% 洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。

10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯120ml，分别萃取8min弃去 水层。回收乙酸乙酯。

11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各70ml，超声22min，过滤，滤 渣弃去，滤液备用。

12)将11)中所得滤液在0~4℃冷藏过夜，结晶析出沉淀。

13)将12)中所得沉淀进行合并，40%-45%洗脱液合并得到48%淫羊藿苷 粗品，50%-70%洗脱液合并得到62%淫羊藿次苷II粗品。测定方法如实施例 1。

经测定，本发明实施例1-3的提取分离方法中，淫羊藿苷的收率约为 80%，淫羊藿次苷II的收率约为85%。

实施例4 大孔树脂型号筛选

大孔树脂预处理方法：按照实施例1中同法处理，备用。

静态吸附/解吸附试验：取处理好的大孔树脂各1g，分别置于50ml具 塞锥形瓶中，加入20ml的实施例1步骤5）所得溶液，静置24h，倾出吸 附后的残液。大孔树脂用水洗涤过后，用不同浓度的乙醇溶液解吸附。按测 定方法测定5）中溶液、残液及解吸液的浓度，并以淫羊藿苷及淫羊藿次苷 II总量为指标，按下试计算吸附容量及解吸率，结果见表1。

表1

由表1可知，DM301、DM-130和AB-8对淫羊藿苷及淫羊藿次苷II总 量的吸附值及解吸率均较好，均可作为淫羊藿苷及淫羊藿次苷II的分离用树 脂；而D101树脂也可用于上述成分的分离，但其吸附值较低，不利于资源 的节约，因此，本发明用优选DM301、DM-130和AB-8型大孔吸附树脂。

综上所述，本发明不仅实现了对淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的同时提取分 离，简化了工艺流程，还得到了纯度较高的药物中间体，显著增加了单体成 分的收率，提高了药材的利用率，降低了生产成本；同时，本发明方法未使 用毒性较大的有机溶剂，保障了操作人员的安全性，实现了绿色生产，具有 良好的工业应用前景。