一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺

摘要

本发明公开一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺，该发酵工艺是在现有发酵工艺基础上，向发酵培养基中加入微量元素溶液，充分利用微量元素的作用，达到提高微生物底物转化能力和提高普伐他汀发酵水平的目的，并且通过控制马杜拉放线菌的培养温度以及马杜拉放线菌转化康百汀的转化温度有效提高微生物转化菌——马杜拉放线菌对康百汀的转化能力、提高普伐他汀发酵水平，且其发酵水平远远高于现有技术的水平。本发明的发酵工艺操作简便、成本低廉，适合于大规模的生产。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制备领域，尤其涉及普伐他汀的制备，具体涉及一种 可提高二步发酵法生产普伐他汀产量的发酵工艺。

背景技术

普伐他汀是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，最初用于治疗高 血脂症和家族性高胆固醇，后来适应症不断扩大，可以减缓动脉粥样硬化 的发展，减少冠状动脉粥样硬化病变和临床心血管事件的发生。长期服用 普伐他汀，无论病人是否患有冠心病，都能减低各种原因所致的死亡率， 因此，普伐他汀成为目前他汀类药物中仅有的可用于胆固醇水平较高的或 者冠心病的病人进行心脏病、中风一级和二级防御的药物。

也有研究显示，普伐他汀还能降低糖尿病和阿尔茨海默病的发生率； 能抑制肝癌细胞的增殖；能有效地治疗溃疡性结肠炎，副作用少，半年复 发率低；在治疗慢性心力衰竭、舒张性心力衰竭方面，可改善心功能，改 善心室重塑。

普伐他汀的生产通常由两步发酵过程获得，虽然也有报道或专利(WO 99/10499、WO2007/147827、US 6,274,360和EP 1,266,967)描述可用一步 发酵的方法生产获得普伐他汀，但由于技术复杂及生产效率等原因，普伐 他汀的工业化生产仍以两步发酵为主。

普伐他汀的两步发酵过程为：首先，通过桔青霉(Penicillium citrinum) 等微生物发酵生产获得其次级代谢产物康百汀Compactin(又名美伐他汀 Mevastatin)，然后，通过微生物酶的转化作用，将康百汀转化为普伐他汀。

现有的专利或文献资料公开的将康百汀转化为普伐他汀的微生物主 要包括以下几类：丝状霉菌(Mortierella maculata，WO00/46175)、根毛 霉菌(Mucor Rhizopus，US4448979)、诺卡氏菌(Norcardia，US5830695)、 马杜拉放线菌(Actinomadura，WO96/40863)、链霉菌(Streptomyces  Carbopilus EP215665)、脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates，WO98/45410) 和粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba，CN03141475A)等。

按照公开的专利，上述的霉菌、丝状细菌、放线菌和链霉菌均可以将 康百汀转化成普伐他汀，然而，由于康百汀对微生物转化菌的毒害作用， 使得微生物不能耐受添加到培养物中的甚至是低浓度的康百汀，现有技术 下微生物转化菌对底物康百汀的耐受浓度为0.01-0.05％。

尽管李周灵等(WO98/45410)获得的脱叶链霉菌YJ-118表现了较高 (0.1-0.5％)的底物抗性，Metkinen(Metkinen News March 2000，Metkinen  Oy，Finland；reviewed by Manzoni and Rollini，2002，Appl Microbiol  Biotechnol 58：555-564)也获得了对3g/L康百汀具有抗性的Streptomyces突 变菌株，但其普伐他汀产率不高。

虽然WO96/40863公开了马杜拉放线菌(Actinomadura)ATCC 55678 转化康百汀生产普伐他汀的方法，但未提及微量元素配方在其中的应用， 也未提及发酵培养过程分别控制菌体增殖培养温度和康百汀转化温度对 普伐他汀产量提高的有益作用。

目前，普伐他汀发酵生产水平大多在10g/L左右，作为商业应用的规模 生产，这样的生产水平仍有较大的提高空间。

对于二步发酵法生产普伐他汀来说，其第二步——由微生物转化康百 汀为普伐他汀是影响普伐他汀产量的关键性步骤，而在这一步中，如何提 高微生物对底物康百汀的转化能力和普伐他汀发酵水平是降低普伐他汀 生产成本、增加普伐他汀产量以提高经济效益的最有效途径。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可有效提高微生物 对底物康百汀的转化能力、提高普伐他汀发酵水平，且操作简单、成本低 廉的用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺，该发酵工 艺和现有工艺相似，也是先对马杜拉放线菌在种子培养基中进行种子培 养，然后在发酵培养基中接种种子培养后的马杜拉放线菌，并且向发酵培 养基中加入康百汀，在发酵培养过程中马杜拉放线菌将康百汀转化成普伐 他汀，发酵培养结束得到所需普伐他汀。

但是现有工艺中普伐他汀产量很低，为了克服这个缺陷，本发明人对 整个工艺中的多项参数进行了研究，如种子培养中培养基配方和培养条 件、发酵培养中培养基配方和培养条件等，最终发现，向发酵培养基中加 入微量元素溶液，可提高马杜拉放线菌对康百汀的转化能力，提高普伐他 汀的发酵水平，从而提高普伐他汀的产量。

上述微量元素溶液是按如下配方配制而得：

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)     0.1～0.2g/L；

硼酸(H₃BO₃)               1.0～1.5g/L；

氯化锰(MnCl₂·H₂O)        0.1～0.2g/L；

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)       5.0～5.5g/L；

硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)     1.5～2.0g/L；

硝酸钠(NaNO₃)             3.0～3.3g/L；

柠檬酸(C₆H₈O₇)            1.5～2.0g/L；

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)       0.2～0.3g/L。

针对发酵培养基配方的改变，发明人又对改进后的工艺进行了工艺参 数的优化，并最终发现在发酵培养基配方改变的基础上，再分别控制马杜 拉放线菌的培养温度和马杜拉放线菌转化康百汀为普伐他汀的转化温度， 可更加好地提高马杜拉放线菌对康百汀的转化能力，提高普伐他汀的发酵 水平，从而提高普伐他汀的产量。

上述马杜拉放线菌的培养温度控制在35～37℃；

上述马杜拉放线菌转化康百汀为普伐他汀的转化温度控制在27～29 ℃。

本发明的一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺， 该发酵工艺的具体步骤如下所示：

步骤1种子培养

首先按照如下配方配制种子培养基：

葡萄糖30g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；

向上述种子培养基中接种马杜拉放线菌(Actinomadura)，接种后在 35～37℃下培养48～72小时；

步骤2发酵培养

首先按照如下配方配制发酵培养基：

葡萄糖60g/L、酵母提取物25g/L、大豆蛋白胨5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、微量元素溶液2.0ml/L和消沫 剂1.0g/L；

向发酵培养基中接种经步骤1种子培养后的马杜拉放线菌，接种后先 在35～37℃下进行增殖培养30～40小时，然后调节发酵培养基温度为 27～29℃后补入康百汀溶液，27～29℃下培养72～156小时实现马杜拉放 线菌转化康百汀为普伐他汀，在27～29℃下培养72～156小时的过程中， 监测发酵液中康百汀的浓度，需维持康百汀在发酵液中的浓度为0.3～ 0.7g/L。

发酵培养结束后，检测普伐他汀含量和康百汀的含量，结果发现康百 汀的转化率达70％以上，普伐他汀发酵生产水平达18g/L以上。与现有技 术相比，生产水平提高幅度达60％以上，转化率提高达10个百分点以上， 由此说明本发明的发酵工艺可大幅度提高普伐他汀生产效率及其产量。

上述发酵工艺中，种子培养基和发酵培养基中所用到的葡萄糖、酵母 提取物、大豆蛋白胨为本领域技术人员进行培养基配制时所常用的碳源和 氮源成分，本领域技术人员在实现本发明时只需购买市售的培养基配制时 常用的葡萄糖、酵母提取物和大豆蛋白胨即可实现本发明；本发明的种子 培养除了培养过程的温度需控制在35～37℃外，其余操作和参数均采用现 有技术即可；本发明的发酵培养除了培养基中加入的微量元素溶液、控制 马杜拉放线菌的培养温度(35～37℃)和控制转化温度(27～29℃)外， 其余操作和参数均采用现有技术即可。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明人通过对发酵工艺中的多种影响参数进行研究后，确定了将 微量元素引入发酵过程中的方案；微量元素与酶的活动密切有关，或是酶 的活性基团成分，或是酶的激活剂，微量元素主要包括铁、铜、锌、锰、 硼、钴、钼等，它们在培养基中，一般仅需含有万分之一甚至更少，浓度 太低，不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制甚至毒害微生物 生长；有鉴于此，本发明人通过长期而深入的研究，最终确定了微量元素 溶液的配方，及其在发酵培养基中的添加量，充分利用微量元素的作用， 达到提高微生物底物转化能力和提高普伐他汀发酵水平的目的；

2.本发明通过分别控制微生物培养过程和微生物转化过程的温度，在 添加微量元素溶液的前提下，有效提高微生物转化菌——马杜拉放线菌对 康百汀的转化能力、提高普伐他汀发酵水平，且其发酵水平远远高于现有 技术的水平；

3.本发明通过研究控制种子培养过程的温度为35～37℃，该温度为菌 体繁殖的最适温度，在该温度下菌种生长迅速；本发明将种子培养后的菌 体转入发酵培养基中，控制增殖培养的温度为35～37℃，缩短菌体生长的 延滞期、提前进入对数生长期，有利于菌体大量增殖；

4.本发明的发酵工艺操作简便、成本低廉，适合于大规模的生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对 本发明做任何限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或生产 厂商推荐的条件进行。

本发明的马杜拉放线菌(Actinomadura)采用任何一种现有公开文献 中，可将康百汀转化为普伐他汀的马杜拉放线菌属的菌种，均可实现本发 明。

下述实施例中的马杜拉放线菌(Actinomadura)采用美国典型微生物 菌种保藏中心保藏号为ATCC55678(WO96/40863)的菌种。

本发明的下述实施例中，普伐他汀和康百汀含量按照韩明活等. 《HPLC法测定普伐他汀生产样品中相关组分的含量》.今日药学.2010， 20(7)的方法进行检测。

本发明的实施例中，康百汀的转化率以下述公式进行计算：

转化率＝普伐他汀获得量÷康百汀使用量×100％。

实施例1

本实施例的一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工 艺，该发酵工艺的具体步骤如下所示：

本实施例的微量元素溶液是按如下配方配制而得：

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)      0.1g/L；

硼酸(H₃BO₃)                1.0g/L；

氯化锰(MnCl₂·H₂O)     0.1g/L；

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)    5.0g/L；

硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)  1.5g/L；

硝酸钠(NaNO₃)          3.0g/L；

柠檬酸(C₆H₈O₇)         1.5g/L；

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)    0.2g/L。

步骤1种子培养

首先按照如下配方以1L摇瓶配制350mL种子培养基：

葡萄糖30g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L和消沫剂1.0g/L。

种子培养基灭菌后接入斜面种子马杜拉放线菌(Actinomadura)，在 36℃下摇床培养55h。

步骤2发酵培养

首先按照如下配方以5L全自动发酵罐配制3L发酵培养基：

葡萄糖60g/L，酵母提取物25g/L，大豆蛋白胨5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，微量元素溶液2.0ml/L消沫剂 1.0g/L。

发酵培养基灭菌后接入300mL种子液，在35～37℃下增殖培养40小 时，调节发酵温度为27～29℃并在微生物转化康百汀过程保持此温度，补 入康百汀溶液，以HPLC法检测康百汀浓度使其维持在0.2～0.5g/L，培养 至172h后停止补加康百汀溶液，培养至185h后结束发酵，检测普伐他汀 含量和康百汀含量分别为18612mg/L和12mg/L，共加入康百汀76.5g，转 化率达73％。

本实施例中发酵培养基中的增殖培养时间为40小时，马杜拉放线菌转 化康百汀为普伐他汀的时间为145小时(185-40小时)。

实施例2

本实施例采用50L全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化康百汀生产普 伐他汀，其发酵工艺的具体步骤如下所示：

本实施例的微量元素溶液是按如下配方配制而得：

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)   0.2g/L；

硼酸(H₃BO₃)             1.5g/L；

氯化锰(MnCl₂·H₂O)      0.2g/L；

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)     5.5g/L；

硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)   2.0g/L；

硝酸钠(NaNO₃)           3.3g/L；

柠檬酸(C₆H₈O₇)          2.0g/L；

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)     0.3g/L。

种子培养方法同实施例1。

发酵培养操作如下所示：

首先按照如下配方配制30L发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母提取物 25g/L，大豆蛋白胨5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L， (NH₄)₂SO₄ 2g/L，微量元素溶液2.0ml/L消沫剂1.0g/L。

发酵培养基灭菌后接入2.5L种子液，在35～37℃下培养32小时，调 节发酵温度为27～29℃并在微生物转化康百汀过程保持此温度，补入康百 汀溶液，以HPLC法检测康百汀浓度使其维持在0.3～0.7g/L，培养至180 小时后停止补加康百汀溶液，培养至188小时后结束发酵，检测普伐他汀 含量和康百汀含量分别为18598mg/L和10mg/L，共加入康百汀815.2g，转 化率达73％。

本实施例中发酵培养基中的增殖培养时间为32小时，马杜拉放线菌转 化康百汀为普伐他汀的时间为156小时。

实施例3对照实施例

本实施例采用50L全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化康百汀生产普 伐他汀，本实施例发酵培养基中不添加微量元素溶液，控制增殖培养温度 和转化培养温度均为35～37℃。实施步骤如下：

种子培养方法同实施例1。

发酵培养操作如下所示：

首先按照如下配方配制30L发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母提取物 25g/L，大豆蛋白胨5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L， (NH₄)₂SO₄ 2g/L，消沫剂1.0g/L。

发酵培养基灭菌后接入2.5L种子液，发酵全过程在35～37℃下培养， 培养至33小时开始补入康百汀溶液，以HPLC法检测康百汀浓度使其维持 在0.3～0.7g/L，培养至181小时后停止补加康百汀溶液，培养至188小时 后结束发酵，检测普伐他汀含量和康百汀含量分别为11372mg/L和18mg/L， 共加入康百汀591.6g，转化率62％。

实施例4对照实施例

本实施例采用50L全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化康百汀生产普 伐他汀，本实施例与实施例3相同，发酵培养基中不添加微量元素溶液， 但在其余各项参数控制不变情况下，控制增殖培养温度为35～37℃，培养 33小时、转化培养温度为27～29℃，发酵培养至183小时结束，检测普伐 他汀含量和康百汀含量分别为13372mg/L和27mg/L，共加入康百汀622.0g， 转化率65％。

实施例5对照实施例

本实施例采用50L全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化康百汀生产普 伐他汀，本实施例发酵培养基中添加微量元素溶液，但按照常规的温度控 制方法，发酵培养全过程控制相同温度35～37℃。实施步骤如下：

本实施例的微量元素溶液配方同实施例1。

种子培养方法同实施例1。

发酵培养操作如下所示：

首先按照以下配方配制30L发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母提取物 25g/L，大豆蛋白胨5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L， (NH₄)₂SO₄ 2g/L，微量元素溶液2.0ml/L，消沫剂1.0g/L。

发酵培养基灭菌后接入2.5L种子液，发酵全过程在35～37℃下培养， 培养至35小时时开始补入康百汀溶液，以HPLC法检测康百汀浓度使其维 持在0.3～0.7g/L，培养至180小时后停止补加康百汀溶液，培养至190小 时后结束发酵，检测普伐他汀含量和康百汀含量分别为13466mg/L和 24mg/L，共加入康百汀652.5g，转化率66％。

实施例6对照实施例

本实施例采用50L全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化康百汀生产普 伐他汀，本实施例与实施例5相同，发酵培养基中微量元素配方同实施例 1，但按照常规的温度控制方法，发酵培养全过程控制相同温度27～29℃。 发酵结束检测普伐他汀含量和康百汀含量分别为14066mg/L和14mg/L，共 加入康百汀671.5g，转化率67％。

将实施例1～6的数据进行对比，结果如表1所示。

表1各实施例的数据对比

备注：实施例3中，发酵培养基未加入微量元素溶液，也没有分别控 制发酵增殖培养温度和转化培养温度，为现有技术。

现以发酵体积(50L)相同的实施例2、3、4、5、6进行比较分析：

1.与现有技术(实施例3)相比，发酵培养基未加入微量元素溶液但 分别控制发酵增殖培养温度和转化培养温度的实施例4，发酵水平提高 18％，转化率高3个百分点。

2.与现有技术(实施例3)相比，发酵培养基加入微量元素溶液但未 分别控制发酵增殖培养温度和转化培养温度的实施例5和实施例6，发酵分 别水平提高18％和24％，转化率分别高4个百分点和5个百分点。

2.与现有技术(实施例3)相比，本发明工艺的实施例2，发酵培养基 中加入了微量元素溶液且分别控制发酵增殖培养温度和转化培养温度，发 酵水平提高64％，转化率高11个百分点。

由此说明，发酵培养基中加入微量元素溶液对提高普伐他汀发酵水平 和康百汀的转化率有一定帮助，而同时再对发酵过程的温度进行控制，即 先控制马杜拉放线菌的培养温度在35～37℃，然后再控制马杜拉放线菌对 康百汀的转化温度在27～29℃，则可更加有效地地提高普伐他汀发酵水平 和康百汀的转化率。