一种兔瘟组织灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种兔瘟组织灭活疫苗及其制备方法，其中,兔瘟组织灭活疫苗包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫升病毒提取液中含有5—15mg蜂胶。其制备方法主要包括以下步骤：病料处理与病毒液获取；病毒灭活；疫苗配置；疫苗的安全及免疫效力检验；疫苗分装。采用本发明的疫苗病原体分离后进行了传代增值，较为全面的抗原成份对接种动物群体进行全面的，多方面的诱导，能达到预防和控制疾病的良好效果。采用的蜂胶佐剂是一种良好的免疫增强剂和刺激剂,具有广谱生物学活性,它既能引起特异性免疫应答,又能启动非特异性防御机制,有增强免疫抗体生成和提高白细胞吞噬能力的明显效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对抗兔瘟的组织灭活疫苗，同时还涉及一种该兔瘟组织灭活疫苗的制 备方法，属于兽用动物疫苗领域。

背景技术

兔病毒性出血症（RHD）俗称“兔瘟”，或称兔出血症，是由兔病毒性出血症病毒（RHDV） 引起的兔的一种急性、高度接触性传染病，特征为病死兔出现全身败血症变化，各脏器都 有不同程度的出血、充血和水肿。肺高度水肿，有大小不等的出血斑点，切面流出多量红 色泡沫状液体。喉头、气管粘膜淤血或弥漫性出血，以气管环最明显；肝脏肿胀变性，呈 土黄色，或淤血呈紫红色，有出血斑；肾肿大呈紫红色，常与淡色变性区相杂而呈花斑状， 有的见有针尖状出血；脑和脑膜血管淤血，脑下垂体和松果体有血凝块；胸腺出血。3月 龄以上的青年兔和成年兔发病率和死亡率最高（可高达95％以上），断奶幼兔有一定的抵 抗力，哺乳期仔兔基本不发病。可通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径传染，潜伏期48～ 72小时。本病常呈暴发性流行，发病率及病死率极高，对易感兔致病率达90%，病死率 高达100%，是危害养兔业的最严重的疾病之一。

对RHDV感染至今尚无有效治疗药物，所能应用的治疗措施仅限于对症治疗和支持 治疗，且防治本病经治疗后效果极差，抗生素、磺胺类药物仅防止并发症。当前我国控制 该病主要依靠兔瘟疫苗的免疫接种。尽管疫苗的使用已相当普及，由于某些原因，我国每 年还有许多兔群发生兔瘟，给养兔场造成一定的经济损失。因此研制安全有效的兔瘟疫苗， 称为预防控制该病流行的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫活性较强的兔瘟组织灭活疫苗。

同时，本发明的目的还在于提供一种兔瘟组织灭活疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种兔瘟组织灭活疫苗，包含有兔瘟组 织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫升病毒提取液中含有5-15mg蜂胶。

所述的兔瘟组织病毒液来源于发病兔瘟肝脏组织，取适量按1：5（v/v）加入无菌生 理盐水研磨处理离心后取上清液保存。

所述的蜂胶佐剂可以采用如下方法制备：市场直接购买的蜂胶在-4℃进性冷冻处理6h， 冷冻后的蜂胶用粉碎机粉碎，过20目筛，用950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的蜂胶溶 液。

同时，本发明的技术方案还采用了一种兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1） 兔瘟组织病毒液获得；（2）成品疫苗配置：取合格蜂胶研磨，用950g/L酒精纯化，并配成 30mg/ml的溶液，得到制苗用蜂胶佐剂；（3）取步骤（1）所得的灭活病毒液与蜂胶佐剂， 用胶体磨乳化，加入10mg/l硫柳汞，使其最终浓度达0.01%，混合均匀，定量分装；分装 每只注射1ml，按20ml/瓶或40ml/瓶分装；检验合格的疫苗采用皮下注射，每只注射1ml。

所述的兔瘟组织病毒液获得具体包括以下步骤：

（1）病料来源及处理剖检有典型兔瘟症状的病死兔，无菌取肝脏组织研磨后按照1： 5加入无菌生理盐水，再加上青链霉素1000U（ug）/ml,放置4℃过夜，反复冻融3次 4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃12000rpm/min20分钟离心纯化后，无菌取其上 清液保存备用；

（2）兔体传代培养取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均 取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；

（3）病毒液获取将收集肝脏取少许按1：5加入无菌生理盐水，研细，1500rpm/min 离心10分钟，取上清，做无菌试验和凝集人O型红细胞实验，无菌条件下，将剩余肝脏 除去脂肪和结缔组织，剪碎后用捣碎机反复捣碎3000rpm/min，5min，六层纱布过滤，收 集滤液，用pH为7.2的PBS液10倍稀释；

（4）毒液灭活在步骤(3)的PBS稀释液中加入试剂纯福尔马林液，使其最终含量为 0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封。置于37℃环境中作用48小时，每2小时振 摇一次，使其充分灭活，制成灭活疫苗，低温保存。

用无菌生理盐水稀释研磨后的组织悬液用4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃ 10000rpm/min30分钟离心纯化后，无菌取其上清液保存备用。

处理的肝脏病料进行了传代培养，取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只， 每传一代均取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；共传四代，用兔20只，发 病19只，接种后三天内死亡17只，收集病死兔肝脏低温保存；证实无菌且血凝试验阳性 时判为合格。

低温保存为-15℃，血凝试验凝集对象为人O型1%红细胞，阳性效价HA为2⁷。

阳性冰冻保存液用甲醛灭活，最终含量为0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封， 置于37℃环境中作用48小时，每2小时振摇一次，使其充分灭活。

采用本发明的方法制备得到的疫苗病原体分离后进行了传代增值，较为全面的抗原成 份对接种动物群体进行全面的，多方面的诱导，能达到预防和控制疾病的良好效果。采用 的蜂胶佐剂是一种良好的免疫增强剂和刺激剂,具有广谱生物学活性,它既能引起特异性免 疫应答,又能启动非特异性防御机制,有增强免疫抗体生成和提高白细胞吞噬能力的明显 效果。

具体实施方式

兔瘟组织灭活疫苗实施例1

本实施例的兔瘟组织灭活疫苗包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫 升病毒提取液中含有15mg蜂胶。

兔瘟组织灭活疫苗实施例2

本实施例的兔瘟组织灭活疫苗包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫 升病毒提取液中含有10mg蜂胶。

兔瘟组织灭活疫苗实施例3

本实施例的兔瘟组织灭活疫苗包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫 升病毒提取液中含有5mg蜂胶。

兔瘟组织灭活疫苗制备方法实施例

本实施例的兔瘟组织灭活疫苗制备方法如下：

1)病料处理：剖检有典型兔瘟症状的病死兔，无菌取其一大半肝脏 按1：5加入无菌生理盐水，再加上青链霉素1000U（ug）/ml,放置4℃过夜，反复冻融3 次4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃10000rpm/min30分钟离心纯化后，无菌取其 上清液保存备用。

2)兔体传代培养：取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均取死 亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料。共传四代，用兔20只，发病19只，接种后 三天内死亡17只，收集病死兔肝脏-15℃保存。

3)病毒液获取：将收集肝脏取少许按1：5加入无菌生理盐水，研细，1500rpm/min离 心10分钟，取上清，做无菌试验和凝集人O型红细胞实验，测定HA效价为2⁸。无菌条件 下，将剩余肝脏除去脂肪和结缔组织，剪碎后用捣碎机反复捣碎3000rpm/min，5min，六 层纱布过滤，收集滤液，用pH为7.2的PBS液10倍稀释。

细菌学检查

用上述上清液接种鲜血琼脂斜面培养基2管，每管接种0.2ml，结果为阴性，证明无 细菌感染。

动物接种实验

取上述上清液分别接种下列三种动物：成年家兔5只，小白鼠4只，青年 鸡3只，兔、鸡每只军皮下接种1ml，小白鼠每只皮下注射0.2ml。接种后隔离饲养，观 察7～14天，结果：兔子在感染后8～24h体温高达41～42℃，接种三天后全死亡，期临 床症状，病理变化与所取病死兔相同，取其肝脏做细菌学检查均为阴性。而人工感染的其 他两种动物全部健康。

毒液灭活

取兔瘟组织灭活疫苗制备方法实施例步骤3)中的PBS稀释液，加入试剂纯福尔马林 液，使其最终含量为0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封。置于37℃环境中作用 48小时，每2小时振摇一次，使其充分灭活，制成灭活疫苗，低温保存。

疫苗配置

取合格蜂胶研磨，用适量950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的溶液，得到制苗用蜂 胶佐剂。取上述灭活病毒液与蜂胶佐剂等比例用胶体磨乳化，加入10mg/l硫柳汞，使其最 终浓度达0.01%，混合均匀，定量分装。

疫苗检验

安全试验取疫苗按4ml/只接种易感兔4只(腿部肌注)，观察7天接种兔健康存活。

免疫原性检验

将0.5ml、1ml灭活疫苗灭活疫苗分别对成年兔进行腿部皮下注射，每组12只，免疫前 及免疫后第7、14、21、28、35、42和56天经耳静脉采血，分离血清，检验抗体水平， 按ELISA检测试剂盒说明进行操作。所得结果如下表1：

表1成年兔免疫后血清抗体水平变化（A₆₅₀）

效力检验取10只易感兔，随机分成两组，每组5只，试验组于腿部肌注本发明的疫 苗1ml/只，对照组注射正常兔肝组织悬液1ml/只。7天后用血凝价2⁸的材料悬液注射2ml/ 只，观察7天，试验组全部存活，对照组全部发病死亡，如表2所示：

表2